一种银纳米酶组装体/抗生素在制备治疗耐药感染性疾病的组合药物中的应用

1.本发明涉及纳米生物材料与抗生素组合药物的应用，具体涉及一种银纳米酶组装体/抗生素在制备治疗耐药感染性疾病的组合药物中的应用。


背景技术：

2.耐药细菌感染已经成为全球范围内一个重要的公共卫生问题。据报道，至2050年耐药细菌感染预计导致每年1000万人死亡，以及高达100万亿美元的治疗成本，造成巨大的健康威胁与经济负担。造成这一问题的原因是耐药细菌通过降低细菌内抗生素浓度、分泌抗生素灭活酶、修饰抗生素靶点等方式逃避抗生素疗效，目前大部分抗生素的疗效都已经受到威胁。然而，过去30余年都没有具有新型机制的抗生素被批准上市，更加重了耐药细菌感染的治疗负担，因此，以现有抗生素为基础制备新型组合药物是克服细菌耐药性的关键手段。
3.目前，已有小分子抑制剂可以通过干扰抗生素灭活酶的作用、破坏细菌膜稳定性或抑制细菌膜上的抗生素外排泵等机制来增强抗生素的作用，从而使抗生素得以对抗耐药细菌。如公开号为cn107753470的中国专利公开了一种多粘菌素耐药蛋白的小分子抑制剂及其应用。该发明首次发现了乙醇胺作为一种小分子抑制剂可以抑制多粘菌素的耐药性、抑制mcr-1蛋白活性、抑制与mcr-1结构类似的磷酸转移酶活性，将乙醇胺作为小分子抑制剂与多粘菌素联合用药，可以使得多粘菌素能够更好地发挥作用，为多粘菌素的应用提供了更为有效的应用空间，在制药领域和动物养殖领域具有十分重要的应用价值，对于耐药性广泛存在的今天具有重大意义。
4.然而，细菌在生物体内定植后会分泌胞外基质并自发形成生物膜，提供了保护细菌免受小分子抗生素和抑制剂影响的物理屏障；同时，细菌细胞内由核糖体生物发生介导的生物合成与分泌行为进一步支持细菌粘附、生物膜的继续形成以及细菌耐药相关物质(如抗生素灭活酶)的产生，提供了化学屏障。这些细菌细胞外及细胞内的生命活动协同形成了一个有利于耐药细菌生长的微环境，即感染微环境，阻碍了抗生素及耐药抑制剂的实际应用效果。因此，开发能够调节感染微环境的药物，尤其是能够破坏细菌生物膜，以及抑制细菌核糖体功能的药物，将有希望破坏细菌耐药屏障，用于制备与抗生素复合的新型抗菌药物来克服耐药细菌感染。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种银纳米酶组装体/抗生素在制备治疗耐药感染性疾病的组合药物中的应用，银纳米酶组装体能够在感染微环境中特异性发挥类氧化酶活性破坏细菌生物膜，进入细菌胞内发挥类硫醇氧化酶活性来催化核糖体蛋白半胱氨酸残基中的硫醇氧化为磺酸，干扰核糖体的生物合成功能，从而抑制耐药物质的分泌，增强抗生素疗效。
6.本发明提供如下技术方案：
7.一种银纳米酶组装体/抗生素在制备治疗耐药感染性疾病的组合药物中的应用，所述组合药物包括银纳米酶组装体和抗生素，所述银纳米酶组装体由超小银纳米酶、感染微环境响应性高分子配体与两亲性表面活性剂构成。
8.本发明中银纳米酶组装体具有类氧化酶活性与类硫醇氧化酶活性：在感染微环境中解组装后发挥类氧化酶活性，催化产生的活性氧(reactive oxygen species，ros)能够破坏细菌生物膜，增强抗生素渗透；银纳米酶进入细菌胞内发挥类硫醇氧化酶活性，可以通过银硫键结合氧化核糖体上的半胱氨酸上的巯基/二硫键，并将其氧化成磺酸(可以催化氧化核糖体蛋白半胱氨酸残基中的硫醇氧化为磺酸)，能够导致核糖体蛋白二级结构破坏，抑制核糖体的蛋白合成功能(干扰核糖体的生物合成功能)，从而抑制耐药物质的分泌，增强抗生素疗效。银纳米酶的功能能够有效增强组合药物中抗生素的渗透效果与杀菌活性，从而其组合药物能产生优异的感染性疾病治疗效果。
9.所述银纳米酶组装体的制备方法包括：
10.1)超小银纳米酶的制备：以硝酸银为前驱体，以油胺为还原剂，以油酸为溶剂，通过热分解法制备超小银纳米酶；
11.2)银纳米酶组装体的制备：将超小银纳米酶与感染微环境响应性高分子配体混合在有机溶剂中，在水浴超声中缓慢滴入溶有两亲性表面活性剂的磷酸盐缓冲液中，充分乳化后挥发除去有机溶剂，得到银纳米酶组装体。
12.将银纳米酶组装体与抗生素混合在磷酸盐缓冲液中，得到银纳米酶组装体/抗生素组合药物。
13.在步骤1)中，所述硝酸银与油胺的质量比为1：2.9-5.9，升温速率为1℃/分钟-10℃/分钟。
14.通过控制升温速率能够控制银纳米酶尺寸，当硝酸银：油胺(质量比)为1：2.9，升温速率为1℃/分钟时得到3-5nm的超小银纳米酶。
15.在步骤2)中，所述感染微环境响应性高分子配体中响应基团包括葡糖酸、咪唑、透明质酸、聚(ε-己内酯)、聚磷酸盐、明胶酶可切割肽中的一个或多个；
16.所述两亲性表面活性剂选自泊洛沙姆、聚乙二醇-聚苯乙烯、聚乙二醇-聚乳酸中的一个或多个。
17.所述超小银纳米酶的尺寸为3-5nm，由感染微环境响应性高分子配体与两亲性表面活性剂进行组装后得到的银纳米酶组装体水合粒径为200nm，解组装后水合粒径为10-20nm。
18.本发明中所述银纳米酶组装体水合粒径在组装状态下约为200nm，银纳米酶组装体中的感染微环境响应性高分子配体能够响应于微环境特征发生结构变化，导致银纳米酶组装体由组装状态转变为分散状态，其水合粒径减小至10-20nm，此时银纳米酶比表面积增大，类氧化酶活性增强。在氧化催化过程中，银纳米酶表面结合氧气分子，并催化生成ros，同时表面形成氧单原子。表面携带氧单原子的银纳米酶，在结合硫醇基团后发挥类硫醇氧化酶活性，可将硫醇基团或二硫键氧化为磺酸。
19.优选的，所述抗生素为氨苄西林、盘尼西林、链霉素。
20.优选的，所述组合药物中银纳米酶组装体和抗生素的质量比为8:1。二者在该比例下发生最佳协同作用，使银纳米酶组装体/抗生素比例为8：1的组合药物能够有效治疗耐药
细菌感染。
21.本发明提供的银纳米酶组装体可以在耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌生物膜中响应性解组装，深度渗透生物膜内部并催化产生ros，氧化破坏生物膜；进一步，解组装的银纳米酶进入细菌，结合核糖体上的半胱氨酸并催化硫醇基团磺酸化，破坏蛋白质二级结构从而干扰核糖体功能，抑制细菌膜蛋白、抗生素灭活酶、胞外基质等物质的合成分泌，最终逆转细菌耐药性，增强组合药物中抗生素的渗透性和杀菌活性。
22.具体地，本发明中所述银纳米酶/抗生素组合药物能够有效杀灭耐药细菌并清除生物膜，通过破坏生物膜增强抗生素的渗透，通过抑制核糖体生物合成功能降低抗生素灭活酶、细胞外基质的分泌水平，逆转耐药细菌的耐药性，相比同等浓度的抗生素或同等浓度的银纳米酶单独治疗，具有协同增强的疗效。
23.同时，本发明中所述的银纳米酶组装体通过抑制细胞外基质等耐药物质的分泌，能够抑制细菌对抗生素耐药性的进化。
24.本发明中的银纳米酶组装体具有类氧化酶活性和类硫醇氧化酶活性，可以催化产生ros，以及可以催化氧化半胱氨酸。银纳米酶组装体进入感染微环境后，可以解组装并发挥类氧化酶活性，产生ros破坏生物膜屏障。当银纳米酶进一步被耐药细菌摄取后，可以发挥类硫醇氧化酶活性，氧化核糖体蛋白的半胱氨酸残基，抑制核糖体生物合成功能。由此，银纳米酶组装体不仅能够破坏细菌生物膜来瓦解物理耐药屏障，还可以抑制耐药相关物质(包括细菌膜蛋白、抗生素灭活酶、细胞外基质)的分泌，从而增强组合药物中抗生素的渗透性与抗菌活性。
25.本发明中所述的银纳米酶/抗生素组合药物发挥作用的机制为：银纳米酶组装体可以在感染微环境中解组装，单分散的银纳米酶高效渗透进入细菌生物膜，发挥类氧化酶活性破坏生物膜结构。单分散的银纳米酶易于被耐药细菌摄取，并与细菌胞内核糖体蛋白中的半胱氨酸残基结合，氧化半胱氨酸导致蛋白二级结构破坏，影响核糖体生物合成功能，放大抗生素疗效，使组合药物在该比例下呈现良好的抗感染疗效。
26.同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
27.(1)本发明中的银纳米酶组装体/抗生素组合药物中的银纳米酶组装体由超小银纳米酶组成，超小银纳米酶具有超小尺寸和大的比表面积，使其表面具有丰富的催化位点，能够进行高效的类酶催化反应。
28.(2)本发明中的银纳米酶组装体/抗生素组合药物中的银纳米酶组装体具有感染微环境响应性，在感染部位微环境下可以响应性解组装，进而发挥特异性增强的酶活性。
29.(3)本发明中的银纳米酶组装体/抗生素组合药物能够氧化破坏耐药细菌生物膜结构，有效渗透进入细菌生物膜，此外，本组合药物能够降低细胞外基质、抗生素灭活酶的分泌水平，从而削弱细菌耐药性，提高自身抗菌活性。
附图说明
30.图1为实施例1中制备的具有类氧化酶活性和类硫醇氧化酶活性的超小银纳米酶的透射电子显微镜(tem)图；
31.图2为实施例1中制备的具有类氧化酶活性和类硫醇氧化酶活性银纳米酶组装体在ph7.4以及ph5.5的条件下的tem图；
32.图3为实施例1中制备的银纳米酶组装体在不同ph条件下的动态光散射粒径分布图。
33.图4为实施例1中制备的银纳米酶组装体在酸性条件下发挥类氧化酶活性的性能表征。
34.图5为实施例1中制备的银纳米酶组装体解组装后发挥类硫醇氧化酶活性的性能表征；
35.图6为实施例1中制备的银纳米酶组装体在模拟生物膜微环境中产生ros的性能，以及破坏细菌生物膜的表征；
36.图7为耐药细菌与银纳米酶组装体共孵育后，细菌膜电位、细胞外基质与抗生素灭活酶的分泌水平检测。
37.图8为利用碘化丙啶(pi)染料与死细胞核(syto green)染料染色法进行银纳米酶组装体/抗生素组合药物治疗耐药细菌生物膜感染的性能检测。
38.图9为实施例1中制备的银纳米酶组装体/抗生素组合药物治疗小鼠皮肤耐药细菌生物膜感染的效果评估。
具体实施方式
39.本发明提供的银纳米酶组装体可以在感染微环境中响应性解组装，发挥特异性放大的类氧化酶活性，产生ros破坏细菌生物膜结构；进入细菌细胞后，银纳米酶发挥类硫醇氧化酶活性，氧化核糖体蛋白的半胱氨酸残基，抑制核糖体的生物合成与分泌功能，减少细胞外基质、抗生素灭活酶等耐药相关物质分泌，逆转细菌耐药性；该银纳米酶组装体能够作为一种抗菌佐剂恢复耐药细菌对传统抗生素的敏感性，为能够高效治疗耐药细菌感染药物的开发提供一种策略。下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。
40.实施例1：具有类氧化酶活性和类硫醇氧化酶活性的银纳米酶组装体的合成与表征
41.(1)超小银纳米酶的合成：
42.将170mg硝酸银与0.5ml油胺，4.5ml油酸混合，真空条件下在70℃下搅拌1.5h，在氩气保护下以1℃/min的速度将混合物升温至180℃，当体系温度到达180℃时保持该温度2分钟，快速冷却，加入无水乙醇进行沉淀，离心(8000rpm，10min)，弃去上清液收集沉淀，用氯仿与无水乙醇的混合液离心洗涤3次，得到超小银纳米酶，分散在氯仿中备用。
43.结果如图1所示，对超小银纳米酶用透射电镜进行形貌表征，粒径约为3-5nm。
44.(2)ph响应性高分子配体的合成：
45.称取0.2g十八胺，溶于10ml二氯甲烷(ch2cl2)中。另称取1.0g l-天冬氨酸苄酯-n羧酸酐，溶于5ml二甲基亚砜(dmso)中，随后缓慢加入到十八胺的ch2cl2溶液中，在30℃条件下搅拌反应48h。反应完毕后，将反应混合液加入到预冷过的无水乙醚中，4℃条件下静置使晶体析出，随后离心(3500rpm，5min)收集固体，经无水乙醚离心洗涤3次后，将收集到的固体置于真空干燥箱中，在室温条件干燥过夜，即得到十八胺-聚天冬氨酸苄酯。称取干燥后的0.2g十八胺-聚天冬氨酸苄酯，溶于5ml dmso中，加入1ml 1-(3-氨基丙基)咪唑，在室温条件下搅拌反应12h。随后，将反应液加入到20ml预冷过的0.1m盐酸(hcl)中，装入活化过的透析袋(截留分子量为1000da)中，并以0.01m hcl作为透析介质进行透析。透析完成后，收
集透析袋中液体，经冷冻干燥，最终得到ph响应性高分子配体十八胺-聚(天冬氨酸-咪唑)。
46.(3)银纳米酶组装体的合成：
47.称取约3mg超小银纳米酶，分散在0.5ml氯仿中；称取5mg十八胺-聚(天冬氨酸-咪唑)，溶解在0.1ml无水甲醇中，与超小银纳米酶的氯仿溶液均匀混合，待用。另称取10mg亲水性表面活性剂普朗尼克f127溶解于5ml磷酸缓冲液(pbs，ph 7.4，10mm)中。在水浴超声条件下，将超小银纳米酶与十八胺-聚(天冬氨酸-咪唑)的混合溶液缓慢滴加到普朗尼克f127溶液中，并不断摇晃容器使形成均匀乳剂。在滴加完毕后，将所得到的均匀乳剂置于30℃水浴中，敞口搅拌30min使有机溶剂挥发完全，最终得到银纳米酶组装体。
48.结果如图2所示，对制备得到的银纳米酶组装体的用透射电镜进行形貌表征，银纳米酶组装体在ph 7.4条件下保持组装状态，而在ph 5.5条件下解组装为分散状态。
49.结果如图3所示，对制备得到的银纳米酶组装体使用动态光散射仪进行水合粒径表征，银纳米酶组装体的水合粒径随着ph降低而减小，说明银纳米酶组装体在随ph降低而发生解组装行为。
50.结果如图4所示，对制备得到的银纳米酶组装体的类氧化酶活性进行表征，分别在ph 7.4与ph 5.5的磷酸盐缓冲液中用紫外分光光度计检测银纳米酶组装体与邻苯二胺共孵育时邻苯二胺氧化产物的吸光度，结果显示，ph5.5磷酸盐缓冲液中的邻苯二胺氧化产物的吸光度较ph 7.4条件下较强，说明银纳米酶组装体在ph 5.5条件下发挥增强的类氧化酶活性。
51.结果如图5所示，对制备得到的银纳米酶组装体的类硫醇氧化酶活性进行表征，银纳米酶组装体在ph 5.5的磷酸盐缓冲液中孵育发生解组装后，在ph 7.4的磷酸盐缓冲液，37℃条件下与l-半胱氨酸共孵育，利用红外光谱仪和拉曼散射光谱仪检测半胱氨酸硫醇基团特征峰变化，结果显示，硫醇特征峰减弱，磺酸基团特征峰增强，说明银纳米酶能够将硫醇氧化为磺酸。
52.实施例2：银纳米酶组装体破坏细菌生物膜和抑制核糖体功能的效果。
53.药物的制备：将实施例1制备得到的银纳米酶组装体分散在ph 7.4的磷酸盐缓冲液中。
54.耐药细菌生物膜模型与浮游耐药细菌模型的建立：将金黄色葡萄球菌分别培养在ph 5.5及ph 7.4的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tsb)中，分别模拟耐药细菌在生物膜中的生长环境与浮游生长环境。
55.组别设置：
56.a.对照组：耐药细菌生物膜/浮游耐药细菌给予新鲜的胰蛋白胨大豆肉汤培养基。
57.b.治疗组1：向耐药细菌生物膜/浮游耐药细菌培养液中加入ag
+
使其浓度为8μg/ml。
58.c.治疗组2：向耐药细菌生物膜/浮游耐药细菌培养液中加入银纳米酶组装体使其银浓度为8μg/ml。
59.以上三组培养液在37℃、180rpm条件下孵育2h后，向其中加入ros荧光探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(dcfh-da，20μm)，在37℃、180rpm条件下避光孵育15min。随后，通过离心(5000rpm,5min,4℃)收集细菌，并用超纯水洗涤2次，最终用超纯水重悬，通过荧光分光光度计测定其中的荧光强度(激发波长为488nm，发射波长为525nm)，同时通过测定od
600
对
细菌总量进行定量，并通过荧光强度与od600的比值得到平均荧光强度。以在中性条件下空白对照组的平均荧光强度为1，计算其他各组的相对荧光强度，从而评估ros产生的强度。
60.银纳米酶组装体(8μg/ml)或磷酸盐缓冲液与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(2
×
105cfu/ml)于孔板中，在过氧化氢酶(28单位/ml)存在/不存在的条件下分别在37℃条件下继续培养24h。随后，翻转孔板弃去上清液，并用去离子水洗涤3次，洗去悬浮细菌。接着用甲醇进行固定，室温下孵育15min后，吸弃，自然风干。固定后每孔加入50μl 0.05％结晶紫溶液进行染色，室温下孵育5min。染色结束后，用去离子水洗涤3次，洗去多余的染料。随后，将孔板开盖置于烘箱(37℃)中进行干燥。待干燥后，向每孔中加入200μl 33％乙酸溶液，轻轻振荡15min使染料完全溶解。最后，通过酶标仪测定结晶紫在570nm处的吸收值，与空白组对比计算生物膜总量百分比。
61.选用硫磺素t(tht)作为细菌膜电位指示剂考察经银纳米酶组装体处理后细菌膜电位的变化。tht为一种正电荷小分子染料，能够通过扩散作用进入细菌内。当核糖体功能障碍时，细菌膜蛋白合成减少，会导致细菌膜电位升高，此时，tht能够更多地蓄积在细菌内，因而在观察细菌时能观察到较强的荧光信号。以上三组培养液，同时加入硫磺素t(tht)，作为细菌膜电位指示剂，tht终浓度为10μm。37℃条件下孵育12h，每隔一个小时，取处理后的菌液，测定其中tht的荧光值及菌液的od600。荧光分光光度计检测tht荧光时，激发波长设定为440nm，发射波长设定为494nm。
62.以上三组培养液在37℃孵育48h后，离心并洗涤3次后加入细胞外基质染料刀豆蛋白a-异硫氰酸罗丹明，室温下孵育染色25min，然后离心(5000rpm,5min,4℃)收集在容器中形成的生物膜，用pbs重悬，通过荧光分光光度计测定其中的荧光强度(激发波长550nm，发射波长为580nm)，同时通过测定od
600
对细菌总量进行定量，并通过荧光强度与od600的比值得到平均荧光强度。以空白对照组的平均荧光强度为1，计算其他各组的相对荧光强度，从而评估细胞外基质分泌的水平。
63.以上三组培养液在37℃孵育48h后，离心并洗涤3次后，加入β-内酰胺酶指示剂硝基噻吩共孵育3h，通过紫外分光光度计测定其在490nm的吸光度。同时通过测定od
600
对细菌总量进行定量，并通过荧光强度与od600的比值得到平均荧光强度。以空白对照组的平均吸光度为1，计算其他各组的相对吸光度，从而评估β-内酰胺酶相对活性百分比。
64.结果如图6所示，银纳米酶组装体可以在模拟耐药细菌生物膜的环境下产生ros；银纳米酶组装体可以减少细菌生物膜总量，且该效应能够被ros清除剂(过氧化氢酶)抑制。
65.结果如图7所示，银纳米酶组装体可以导致细菌膜超极化，并抑制耐药细菌分泌细胞外基质和β-内酰胺酶的产生。
66.实施例3：银纳米酶组装体/抗生素组合药物在治疗耐药细菌生物膜感染中的效果。
67.药物的制备：将实施例1制备得到的银纳米酶组装体稀释在tsb中，使最终浓度为40μg/ml，称取氨苄西林溶解于tsb中，使最终浓度为5μg/ml，得到银纳米酶组装体/抗生素组合药物。
68.耐药细菌生物膜模型建立：取适量耐甲氧西林金黄色葡萄球菌悬液，用tsb培养基稀释至菌液浓度约为2
×
105cfu/ml，接种至玻底培养皿中，在37℃恒温培养箱中培养48h，形成成熟细菌生物膜。
69.组别设置：
70.a.对照组：成熟生物膜给予新鲜的tsb。
71.b.治疗组1：在成熟生物膜中加入含有氨苄西林的tsb(氨苄西林最终浓度为5μg/ml)。
72.c.治疗组2：在成熟生物膜中加入含有ag
+
的tsb(最终银浓度为40μg/ml)。
73.d.治疗组3：在成熟生物膜中加入含有银纳米酶组装体的tsb(最终银浓度为40μg/ml)。
74.e.治疗组4：在成熟生物膜中加入含有氨苄西林与ag
+
的tsb(氨苄西林最终浓度为5μg/ml，银浓度为40μg/ml)。
75.f.治疗组5：在成熟生物膜中加入银纳米酶组装体/抗生素组合药物的tsb。
76.成熟细菌生物膜与不同处理组抗菌剂共孵育24h后，翻转孔板弃去上清液，并用生理盐水洗涤3次。随后，加入含有syto green(4.5μm)和pi(0.05mg/ml)的生理盐水溶液，在37℃条件下孵育20min。染色结束后，洗去多余的染料，并用防荧光淬灭封片剂封片。通过激光共聚焦显微镜对生物膜中两种荧光进行观察并拍摄。
77.结果如图8所示，银纳米酶组装体/抗生素组合药物可以有效地杀灭成熟生物膜中的耐药细菌。
78.实施例4：银纳米酶组装体/抗生素组合药物在小鼠皮肤耐药细菌生物膜感染中的耐药逆转效果
79.药物的制备：将实施例1制备得到的银纳米酶组装体分散到磷酸盐缓冲液中，称取氨苄西林分散到磷酸盐缓冲液中，二者按照8：1质量比混合得到银纳米酶组装体/抗生素组合药物。
80.皮肤感染动物模型的建立：以6-8周龄balb/c雌性小鼠为模型动物，将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌悬液浓度调整至菌液浓度为108cfu/ml，于小鼠右侧背部进行皮下注射(100μl/只)。24h后，可观察到注射处呈现白色感染外观，说明造模成功。
81.组别设置：
82.a.对照组：确证模型建立成功后，在小鼠皮肤感染部位皮下注射生理盐水。
83.b.治疗组1：确证模型建立成功后，在小鼠皮肤感染部位皮下注射含有氨苄西林的药液(氨苄西林浓度为0.27mg/kg)。
84.c.治疗组2：确证模型建立成功后，在小鼠皮肤感染部位皮下注射含有ag
+
的药液(银浓度为2.16mg/kg)。
85.d.治疗组3：确证模型建立成功后，在小鼠皮肤感染部位皮下注射含有银纳米酶组装体的药液(银浓度为2.16mg/kg)。
86.e.治疗组4：确证模型建立成功后，在小鼠皮肤感染部位皮下注射含有氨苄西林与ag
+
的药液(氨苄西林浓度为0.27mg/kg，银浓度为2.16mg/kg)。
87.f.治疗组5：确证模型建立成功后，在小鼠皮肤感染部位皮下注射含有银纳米酶组装体/抗生素组合药物的药液(氨苄西林浓度为0.27mg/kg，银浓度为2.16mg/kg)。
88.治疗过程中对小鼠感染皮肤面积进行统计。治疗第15天，处死小鼠，收集感染皮肤，称重后进行匀浆，将匀浆液进行倍数稀释(分别稀释1倍、10倍、102倍、103倍)，并在tsb固体培养基上进行涂布，随后将固体培养基置于37℃条件下倒置孵育24h。最后，对固体培
养基上的菌落形成情况进行计数确定皮肤中的细菌数量以考察银银纳米酶组装体/抗生素组合药物治疗皮肤感染的效果。
89.结果如图9所示，银纳米酶组装体/抗生素组合药物能够协同治疗耐药细菌生物膜感染。
90.本发明通过材料表征实验和体内外实验两个方面证实了银纳米酶组装体的类氧化酶活性与类硫醇氧化酶活性，并验证了银纳米酶组装体/抗生素组合药物中银纳米酶组装体破坏细菌生物膜，抑制细菌分泌功能的效果，最终验证了银纳米酶组装体/抗生素组合药物在体内外治疗耐药细菌生物膜感染的效果，为临床上对抗难治性耐药细菌感染的抗生素组合药物研究提供一种具有潜力的纳米材料。