含姜黄素的聚合物及其在烧伤促愈合中的应用

1.本发明涉及一种由生物材料制造的医疗器械，尤其涉及一种以姜黄素为活性成分，辅以聚合物的粉末，以其为敷料，用于促进烧伤创面的愈合。


背景技术：

2.烧伤是全世界最常见的创伤之一。缩短深度烧伤伤口的愈合时间是一个具有挑战性的临床问题，这与降低烧伤死亡率和预防疤痕形成密切相关。烧伤创面可分为三个区：凝固性坏死区(中部损伤最严重)；缺血区(特征是灌注减少，但有抢救的可能)；充血区(伤口最外层以炎症性血管扩张加剧为特征)。由氧自由基和炎症引起的缺血区通常构成了初始伤口的很大一部分，并在48小时内逐渐坏死。烧伤创面的感染、疼痛是发生休克及死亡的主要原因。
3.烧伤通常很痛苦，不可避免地会有严重感染。以往，用于治疗感染的静脉抗生素会引起菌群失调和进一步更严重的健康问题。传统的银离子敷料在大面积使用时对人体是有毒的。此外，烧伤通常很痛。因此，镇痛药和阿片类药物传统上是用来缓解疼痛的，但其副作用和成瘾性是不可避免的。姜黄是姜科的一种草本植物，几个世纪以来一直被用来治疗皮肤病、感染、压力和抑郁。姜黄素(cur)是姜黄中的活性成分，已证明其抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、抑制增生性瘢痕形成、减轻疼痛和促进伤口愈合的功效。因此，cur可以作为一种有前景的抗氧化剂、抗菌剂和控制损伤相关疼痛的药物，从而促进伤口愈合。而cur的临床应用受到其稳定性低、水溶性低、分解快和生物利用度差的限制。因此，应进一步研究和应用辅助材料，以提高的稳定性和生物相容性。
4.基于我们过往的研究，我们发现生物分子和金属离子的结合可以为生物分子的生物活性和稳定性提供保护。因此，我们成功地制备了没食子酸基镁有机骨架(mof)。因此，mof具有较高的热稳定性和生物相容性，此外，它还会缓慢释放mg
2+
，从而调节炎症和促进血管形成，从而最终加速糖尿病伤口的愈合。(engineered regeneration 2022，3(4)，440-452)然而，用于保护生物活性药物(如：cur)的mof的独特结构仍然缺乏研究。
5.尽管应用mof可以保护药物的生物活性，但烧伤的大量渗出物仍然限制生物药物的长期疗效。同时，由于伤口闭合的必要性，单纯的药物治疗不足以治愈严重烧伤。(nat rev dis primers 2020，6(1)，11)因此，需要伤口敷料来进一步保护cur的生物活性，以及成功闭合伤口。目前的金标准烧伤覆盖范围是自体中厚皮片移植(stsg)，但由于自体皮肤不足、生物相容性低的人工敷料替代品以及其无法保护和提供生物活性药物而受到限制。之前的许多研究已经证明，聚(γ-谷氨酸)(γ-pga)水凝胶具有良好的生物相容性、强保水性、超吸收和药物释放性能。然而，由于烧伤后大量伤口渗出物，单独使用γ-pga水凝胶似乎对长期伤口闭合和药物输送无效。因此，迫切需要开发具有高形态可塑性和湿粘性的新型水凝胶敷料，以适应烧伤的特殊伤口条件，同时从不同方面缓慢释放保护良好的生物活性药物，促进伤口愈合。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的在于提供一种含姜黄素的聚合物，含有cur-mof的聚合物以加速烧伤伤口愈合。
7.本发明的另一个目的在于提供一种含姜黄素的聚合物，实现治疗性cur-mof缓慢释放。
8.本发明的再一个目的在于提供一种含姜黄素的聚合物粉末，能形成具有良好的形态可塑性和优异的粘合强度的水凝胶，适合烧伤伤口的使用情形。
9.本发明的又一个目的在于提供一种含姜黄素的聚合物粉末，在制备用于治疗烧伤创面，促进愈合的医疗器械中的应用。
10.一种含姜黄素的聚合物，由ε-聚-l-赖氨酸(ε-pll)和γ-聚谷氨酸(γ-pga)相混的组合物作为载体，其中装载生物活性cur-mof。
11.按重量比，ε-pll：γ-pga为1∶1，制成载体，其形态如：粉末，系一种由γ-pga和ε-pll通过强离子键连接的杂化粉末。
12.γ-pga分子量分布为mw＝1000-15000kda
13.ε-pll分子量分布为mw＝2000～5000kda
14.装载生物活性cur-mof量为2mg/ml。
15.cur-mof包括姜黄素和镁离子，其以cur为支架结构，镁离子为连接点制得，呈颗粒状，直径2μm
±
2μm。
16.示例性的，本发明的含姜黄素的聚合物按如下方法制取：
17.将cur-mof分散(如：超声)于γ-pga水溶液(如：10wt％)或ε-pll水溶液(如：10wt％)中，再相应加入ε-pll水溶液(如：10wt％)或γ-pga水溶液(如：10wt％)相混合(γ-pga水溶液和ε-pll水溶液的体积比如：1∶1)。立即将混合物浸入液氮中15分钟)，之后，再行冷冻干燥以除去水分。最后，使用研钵和杵研磨干燥固体而得粉末状的聚合物载体。
18.cur-mof和聚合物载体两种材料结合形成的cur-mof@γ-pga/ε-pll能实现活性成分cur的连续释放。从第24小时开始，cur-mof@γ-pga/ε-pll释放的cur-mof浓度稳定在7μg/ml
±
0.6μg/ml。
19.本发明提供的cur-mof@γ-pga/ε-pll粉末置入创面后，会迅速吸收创面渗出物，并转化为一种湿粘性水凝胶，具有良好的形态可塑性和优异的粘合强度，具有优良自愈特性，并有助于直接应用或注射到具有复杂几何形状的伤口上，适合烧伤的特殊情况。
20.同时，这种多功能粉末将缓慢释放治疗性cur-mof。mof独特的结构提高了cur的生物相容性和稳定性，在保持其抗氧化、抗菌、抗炎和镇痛功效的有效浓度的同时，促进了cur缓慢而可控的释放。此外，在降解过程中，cur-mof也会缓慢释放mg
2+
，具有抗炎和促进血管生成的作用。
21.经验证，cur-mof@γ-pga/ε-pll在体内和体外均实现了粘合剂作用，并成功闭合伤口，以及释放的cur和mg
2+
对加速烧伤伤口愈合的疗效，共同促进细胞增殖和m2巨噬细胞的表型极化。因此，cur-mof@γ-pga/ε-pll可作为一种相变的水凝胶敷料，在使用前为粉末，作用于烧蚀伤口后转变为水凝胶，促进临床烧伤的愈合。
22.将本发明的粉末型含姜黄素聚合物制成用于烧伤的医疗器械，在不添加任何交联剂和有机溶剂的情况下，通过吸收湿组织渗出物，即可形成水凝胶。它对伤口的形状或大小
没有限制，不仅能以复杂的形状紧密覆盖伤口进行保护，可以有效地覆盖和保护伤口，吸收渗出物，促进组织再生，具有抗氧化、抗炎、镇痛和抗菌作用，在治疗烧伤伤口方面具有巨大潜力。
23.此外，从伤口处剥下伤口敷料既费力又痛苦(acs appl mater inter 2018，10(48)，41076-41088)。本发明提供的cur-mof@γ-pga/ε-pll采用可生物降解材料，可被人体吸收，以避免敷料被迫剥离，从而减轻患者的疼痛。
附图说明
24.图1为cur-mof合成和表征图；其中，a为cur-mof微球的合成示意图；b和c为cur-mof的fe-sem图像；d、e、f和g为cur-mof的sem图像和元素映射结果图；h为cur-mof粉末的x射线衍射(xrd)光谱；i为cur-mof和姜黄素的吸收光谱图；j为428nm处不同浓度cur-mof的吸收强度；k为姜黄素和cur-mof在水中和dmso中的照片；l和m为用于研究cur和cur-mof稳定性的光学照片和浓度曲线；n为在pbs存在下，cur-mof@γ-pga/ε-pll水凝胶随时间释放的cur-mof百分比结果图；
25.图2为γ-pga/ε-pll水凝胶的制备与性能测试结果图；其中a为γ-pga/ε-pll粉末和γ-pga/ε-pll水凝胶制备示意图；b为水凝胶a合成过程的光学照片；c为γ-pga/ε-pll水凝胶和cur-mof@γ-pga/ε-pll水凝胶的照片；d为水凝胶的粘附和自愈合照片；e为粘附于各种组织，包括：肾、脾、肝、心、肺和皮肤的照片；f为γ-pga/ε-pll水凝胶中聚合物扩散和随时间变化的荧光显微镜图像；g为注射期间cur-mof@γ-pga/ε-pll水凝胶的照片，h为荧光显微镜下观察cur-mof@γ-pga/ε-pll的粘性细丝图；i为机械试验示意图；j为搭接剪切试验曲线；k为拉伸试验曲线；l为剥离试验曲线；m为两种水凝胶在不同时间点(80％湿度箱，室温)吸湿后的图形；n为两种水凝胶溶胀率的统计分析结果图；o为两种水凝胶在24天内的降解率图；
26.图3为cur-mof@γ-pga/ε-pll的体外细胞活性、迁移和细胞毒性；其中，a为与不同材料共培养48小时后，成纤维细胞活/死细胞双重染色的荧光显微镜图像；b为huvecs与不同浓度的cur-mof或正常细胞培养基共培养48小时的细胞活力测试结果图；c为与不同浓度的cur-mof和不同材料提取物共培养的成纤维细胞的细胞活力，或48小时内无材料；d为与不同材料(γ-pga/ε-pll提取物、cur mof@γ-pga/e-pll萃取物和cur mof溶液)或正常细胞培养基(对照组)共培养后，成纤维细胞的增殖和迁移能力结果图；e为不同组间隙闭合率的量化，n＝3，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；
27.图4为cur-mof@γ-pga/ε-pll的体外抗氧化和血管生成行为图；其中，a为对经不同处理48小时的raw264.7细胞进行ros分析结果图，ros用dcfh-da(绿色)染色；b为不同处理组ros生成的统计分析结果；c为huvec与添加h2o2的不同浓度的cur-mof共培养，或与正常细胞培养液共培养的细胞活力测试结果图；d为与γ-pga/ε-pll提取物、cur-mof@γ-pga/ε-pll萃取物、cur-mof溶液(5g ml-1
)或正常细胞培养基培养6小时成管实验照片；e为各组的连接和管长度的定量结果图，n＝3，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；
28.图5为小鼠深度烧伤的体内伤口愈合评估图；其中，a为分别在第0、3、5、7、10、12和14天对烧伤创面进行不同治疗后的代表性照片，对照组为未经治疗的小鼠；b为量化各组的伤口面积率图，n＝4，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；c为第7天和第14天不同组烧伤创
面的h&e和masson三色染色图像，黑色箭头表示创面边缘；
29.图6为cur-mof@γ-pga/ε-pll的细胞增殖和血管生成功效的体内研究结果图；a为第7天不同组的抗cd31(绿色)和抗ki67(红色)免疫荧光染色的代表性图像，细胞核用dapi(蓝色)染色；b为第14天不同组的抗cd31(绿色)和抗ki67(红色)免疫荧光染色的代表性图像，细胞核用dapi(蓝色)染色；c为不同组伤口组织毛细血管密度的量化结果图；d为量化不同组伤口组织的细胞增殖率图，n＝3，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；
30.图7为cur-mof@γ-pga/ε-pll细胞形态改变的免疫调节作用的体内研究结果图；其中，a为用cd68(红色)和cd206(绿色)免疫荧光染色m2极化，细胞核用dapi(蓝色)染色，不同治疗组伤口组织cd68和cd206双重染色的代表性图像；b为每个区域cd68+和cd206+细胞数量的量化(mm-2
)；c为用cd68(红色)和inos(绿色)对m1极化进行免疫荧光染色，细胞核用dapi(蓝色)染色，不同治疗组伤口组织cd68和inos双重染色的代表性图像；d为每个区域cd68+inos+细胞数量的量化(mm-2
)，n＝3，*p＜0.05，**p＜0.01；e为mgs分数的量化结果图；f为小鼠体重变化的量化，n＝4，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
具体实施方式
31.以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
32.本发明以下实施例所用的主要材料的来源如下：
33.γ-pga(mw＝1000～15000kda)购自赛泰斯生物科技有限公司(中国)。
34.ε-pll(mw＝2000～5000kda)从阿拉丁(中国)购买。
35.从macklin(中国)购买的姜黄素纯度为98％。
36.高糖dmem细胞培养基和胎牛血清(fbs)购自gibco(uk)。
37.将包括成纤维细胞、huvecs和raw264.7细胞在内的细胞系与完整培养基(含10％fbs和1％青霉素-链霉素的高糖dmem细胞培养基)在培养箱(37℃，5％co2)中培养。
38.本发明以下实施例所用的各项试验方法具体说明如下：
39.1)cur-mof和cur-mof@γ-pga/ε-pll的表征
40.将cur-mof溶解在dmso中，其系列浓度为10μg/ml～100μg/ml，并使用微孔板阅读器(spectramax id3，molecular devices.llc.，usa)测量其428nm处的吸光度。以获得标准曲线。在440nm处以同样的方法测量姜黄素，以获得标准曲线。使用标准曲线计算溶液中姜黄素和cur-mof的浓度。
41.2)cur-mof稳定性测试
42.将姜黄素和cur-mof粉末溶解在dmso中，置于室温和阳光下，每24小时取100μl溶液，用微孔板阅读器测量，计算浓度，并拍照记录。
43.3)拉伸试验
44.粘合剂水凝胶直接应用于机械试验仪器(gt-tcs-2000万能材料试验机)，其具有直径为4cm的圆形金属接触面，并端对端连接，记录了失效前粘结接头的最大应力。
45.4)剥离试验
46.为了评估剥离粘合强度，使用了90
°
剥离试验。水凝胶样品用布箔固定，以获得原始剥离粘合强度，防止其沿剥离方向延伸。
47.5)搭接剪切试验
48.将粘合水凝胶涂敷在接触面积为5cm2的玻璃载玻片上，以搭接剪切方式连接，并以搭接剪切的方式连接拉伸力学试验。所有机械试验均在室温下进行。对每种条件下的三个试样进行测试，以确保数据的可靠性。
49.6)cur-mof和cur-mof@γ-pga/ε-pll的药物释放曲线
50.简而言之，将40mg cur mof@γ-pga/ε-pll粉末浸入37℃下的5ml pbs中，并以预定的时间间隔收集100μl pbs。将相同重量的cur-mof动力透析膜(500da)设为对照组。为了测量释放的cur mof的量，使用微孔板阅读器测量提取液在280nm处的吸光度。
51.7)膨胀试验
52.将γ-pga/ε-pll和cu-moof@γ-pga/e-pll粉末分别在室温下浸入pbs中。在预定的时间间隔内，在去除pbs并再次浸入pbs后，对水凝胶进行称重。每次记录水凝胶重量。膨胀率计算如下：
53.膨胀率＝m/m0×
100％
54.其中，m和m0分别是膨胀样品和初始样品的重量。
55.8)吸湿性试验
56.干燥的cur-mof@γ-pga/ε-pll粉末置于室温(30℃)、湿度80％的密封罐中。每隔10分钟用电子秤对粉末进行称重，以记录粉末吸湿性的变化。
57.9)降解率测试
58.将γ-pga/ε-pll和cu-moof@γ-pga/e-pll粉末浸入pbs中，并分别置于37℃、5％co2培养箱中。按照预定的时间间隔，将其取出并冷冻干燥，然后称重并记录。降解率计算如下：
59.降解率＝(w-w1)/w
×
100％
60.式中，w1和w分别是浸没样品和初始样品的重量。
61.10)细胞毒性试验
62.cur-mof cck-8分析：huvec接种在96孔板中，每个孔有5000个细胞，并保存在含有10％fbs的dmem培养基中。在用100μl高糖dmem饥饿huvec 12小时后，用不同浓度的cur mof(5、15、30、40、50、60、80和120μg ml-1)处理，并仅含有完整培养基作为对照组48小时。每个组有三个平行。48小时后，向每个孔中添加含有10％cck-8溶液的完整培养基，以与活细胞相互作用。然后，将细胞置于培养箱中1小时，用微孔板阅读器(spectramax id3，molecular devices.llc.，usa)分析96孔板。
63.不同材料的cck-8分析：γ-pga/ε-pll和cur-mof@γ-pga/ε-pll粉末分别浸入5ml pbs中三天，以获得提取物。成纤维细胞以每孔5000个细胞的速度接种到96孔板中，并分为四组，即对照组、γ-pga/ε-pll提取物组和cu-moof@γ-pga/ε-pll萃取物组，最后一组分为不同浓度的cur-mof(5、10、15、20和25μg/ml)，持续48小时，技术检测过程与上述相同。
64.11)活/死细胞双重染色
65.成纤维细胞以每孔60
×
104个细胞的速度接种在6孔板中。将细胞分为五组，与γ-pga/ε-pll、cu-moof@γ-pga/ε-pll和不同浓度的cur-mof溶液(溶解在完整培养基中)(10
和20μg/ml)或无材料共培养48小时。根据制造商的方案进行钙蛋白am/pi分析(yeasen，上海)。移除培养基，并向每个孔中添加300μl染色试验，移除上清液后，将6孔板置于培养箱中15分钟。细胞用荧光显微镜成像。
66.12)体外迁移分析。
67.将成纤维细胞接种在6孔板中，并在添加10％fbs的高糖dmem培养基中培养。当培养皿中的细胞密度达到90％时，用无菌200μl移液管尖端在六孔板孔中心划出一条直线，然后用pbs清洗并去除脱落细胞。细胞分为五组，与γ-pga/ε-pll、cur-mof@γ-pga/ε-pll和cur-mof溶液(5μg/ml和10μg/ml)或正常细胞培养基共同培养。在治疗后0、6、12和24小时拍摄显微图像。
68.13)成管分析
69.首先，根据制造商的协议，在96孔板的每个孔中添加50μl生长因子降低的matrigel(bd biosciences，usa)，然后放置在培养箱中30分钟，直到固化。其次，将huvecs(每孔2
×
104个细胞)接种在固化的matrigel基质上，并在无血清dmem培养基中培养，培养介质为10μg/ml cur-mof溶液、γ-pga/ε-pll提取物、cur-mof@γ-pga/ε-pll萃取物或正常细胞培养基(对照)。每组的代表性图像在第六小时拍摄。
70.14)体外抗氧化试验
71.通过在高h2o2浓度环境中对细胞的保护作用，评估不同浓度的cur-mof的抗氧化作用。将huvec(每孔5000个细胞)接种到96孔板中。在典型条件下培养24小时后，细胞暴露于300μm h2o2中，并在未经处理或不同浓度的cur-mof(15、30、40、50、60、80和120μg/ml)下培养30分钟。未接受过氧化氢或治疗的组设为对照组。使用cck-8试剂盒，以先前介绍的相同方式，测定不同抗氧化处理后huvec的细胞活性。
72.15)体外抗炎试验
73.在lps诱导的炎症阳性raw 264.7细胞上评估cur-mof@γ-pga/ε-pll的抗炎作用。将raw 264.7细胞(每孔70
×
104个细胞)接种到六孔板中。在典型条件下培养24小时后，将细胞暴露于10μg/ml lps中，不经处理或用γ-pga/ε-pll、cur-mof@γ-pga/ε-pll和cur-mof溶液(10和20μg ml-1)的提取物培养48小时。未经lps或处理的组设为对照组。根据制造商的方案，使用ros检测试剂盒(中国beyotime)对raw264.7细胞进行染色。染色的细胞首先用荧光显微镜拍照，然后用流式细胞仪进行收集和分析(beckman coulter，美国)。
74.16)深烧伤创面模型的体内建立及创面愈合评价
75.小鼠烧伤模型：采用6周龄c57bl/6小鼠建立深度烧伤模型。用硫化钡去除毛发，间隔24小时后将小鼠麻醉。将底面直径为1em的圆柱形铜棒连接到恒温电烙铁上，调节电烙铁温度至120℃，用温度计检查底面温度。体重为300毫克持续5秒时，小鼠背部形成直径为1厘米的圆形烧伤伤口。在24小时的间隔中，老鼠背部烫伤伤口形成的焦痂被迅速清除，形成直径为1厘米的圆形伤口。(mil med res 2022，9(1)，42)
76.随后，将44只小鼠随机分组进行不同的治疗(对照组、cur-mof溶液(20μg/ml)组、γ-pga/ε-pll粉末和cur-mof@γ-pga/ε-pll粉组)。老鼠在单独的笼子里饲养，有充足的食物和水。在烧伤后第0、1、3、5、7、10、12和14天拍摄伤口区域的图像。
77.17)组织学和免疫组织化学染色
78.在治疗后的第三、第七和第十四天，用过量的4％氯醛处死小鼠。首先去除伤口区
域的皮肤组织，并将其浸泡在4％多聚甲醛中24小时以上。脱水后，将样本嵌入蜡块中，将样本切成5μm厚的切片，进行后续染色。为了检测创伤愈合过程，这里应用了苏木精和伊红(h&e)、马森三色染色和免疫荧光染色，使用抗cd31(1∶500)和抗ki67(1∶500)。为了测试巨噬细胞极化，此处使用了针对cd68、cd206和inos的抗体。
79.18)统计分析
80.所有定量数据均以平均值
±
标准偏差表示。两组均采用未配对学生t检验，两组以上均采用单因素方差分析和tukey事后检验。使用spss(社会科学统计软件包)26.0进行统计分析，认为双侧p＜0.05具有统计学意义。graphpad prism 8.0用于图形绘制。image j软件(nih，bethesda，md，usa)用于图像分析和统计。
81.实施例1 cur-mof的合成与表征
82.1)制取cur-mof
83.首先，使用溶剂热法(acs nano 2021，15(11)，17842-17853)合成了cur-mof，但也改进了以前的方法。在磁力搅拌下将8g姜黄素和500ml去离子水混合10分钟。然后添加10m naoh水溶液以将ph调节至12。添加10g mgcl2并磁力搅拌10分钟，然后将混合溶液在马弗炉(sxi-8-10，中国郑州新韩仪器设备有限公司)中在120℃下加热24小时。红棕色固体在离心机中分离(10000rpm，15min，4℃)，用乙醇洗涤两次，然后用去离子水洗涤两次。
84.2)制备γ-pga/ε-pll粉末
85.以1∶1的体积比混合了10wt％γ-pga和10wt％ε-pll水溶液。立即将混合物浸入液氮中约15分钟，不倒出任何液体，并冷冻干燥以除去水分。最后，使用研钵和杵研磨干燥固体以获得γ-pga/ε-pll粉末。
86.3)制备cur-mof@γ-pga/ε-pll粉末
87.通过超声波将cur-mof粉末分散在10wt％ε-pll水溶液中，然后混合等体积的10wt％γ-pga水溶液。立即将混合物浸入液氮中约15分钟，不倒出任何液体，并冷冻干燥以除去水分。最后，使用研钵和杵将干燥固体研磨成橙色cur-mof@γ-pga/ε-pll粉末。
88.cur-mof是一种生物相容性多孔材料，以镁离子为连接点，姜黄素为骨架(图1a)。扫描电子显微镜(sem)图像显示，cur-mof具有直径为2-4μm的均匀球形结构(图1b和1c)。通过使用亮场扫描电子显微镜进行元素映射，确认了cur-mof的组成。结果表明，碳(c)、镁和氧(o)在cur-mof中均匀分布(图1d-g)。cur-mof粉末的x射线衍射(xrd)产生了晶体形成特征峰(图1h)，这进一步证明了cur-mof的成功合成。
89.此外，姜黄素和cur-mof分别在440nm和428nm处显示出特征吸收峰(图1i和1j)。测试cur-mof是否提高了姜黄素的生物利用度，将姜黄素和cur-mof分别溶于水和二甲亚砜，得到姜黄素不溶于水溶于二甲亚砜，cur-mof即溶于水也溶于二甲亚砜(图1k)。为了研究cur和cur-mof的不同稳定性，将它们在阳光下(室温下)暴露7天。照片图像如图11所示，显示了cur溶液中的明显颜色变化，表明其稳定性较低。第7天对cur和cur-mof的残留浓度进行量化，显示姜黄素显著下降，而cur-mof缓慢下降(图m)。为了测试cur-mof@γ-pga/ε-pll的制造是否可以延长cur-mof的释放，将cur-mof@γ-pga/ε-pll置入pbs中检测相应时间点的cur-mof浓度，得到缓释曲线(图1n)。
90.γ-pga是带正电荷的酸性大分子，而ε-pll是带负电荷的碱性聚合物。阴离子和阳离子相互吸引，并通过离子之间的物理相互作用紧密结合，从而获得粘附性水凝胶(图2a)。
20μg ml-1
的cur-mof浓度没有显示细胞毒作用，低剂量的cur-mof在48小时内显著促进成纤维细胞增殖(图3b-c)。
97.为了进一步证明材料的生物相容性，在浓度为10和20μg ml-1
的γ-pga/ε-pll、cur-mof@γ-pga/ε-pll和cur-mof溶液上进行了活/死双重染色实验，获得了类似的结果(图3a)。
98.实施例3 cur-mof和cur-mof@γ-pga/ε-pll水凝胶增强体外细胞增殖、迁移和血管生成
99.通过划痕试验评估γ-pga/ε-pll、cur-mof@γ-pga/ε-pll和cur-mof溶液(浓度分别为5μg ml-1
和10μg ml-1
)对细胞增殖和迁移的影响。结果表明，与未治疗组相比，其他治疗组对细胞迁移和增殖的影响增强。cur-mof@γ-pga/ε-pll组的增强最为明显，定量分析显示，与对照组相比，24小时后的残留区域更小2.86倍。与使用不同浓度cur mof溶液的治疗组相比，5μg ml-1
组对细胞的影响稍强，这与之前cck8试验的结论相似(图3d-e)。此外，还进行了管形成实验(图4d)。huvec与dmem(对照组)、cur-mof溶液或γ-pga/ε-pll或cur-mof@γ-pga/ε-pll提取物孵育6小时。图4e量化并显示了不同组的接头和管道长度。与对照组相比，所有三个治疗组的连接数量和管长度都显著增加，尤其是cur-mof@γ-pga/ε-pll组。
100.实施例4 cur-mof和cur-mof@γ-pga/ε-pll水凝胶体外抗氧化和抗炎活性
101.使用cck8分析法评估在过氧化氢存在下用不同浓度的cur处理后的细胞存活率，以证明cur-mof的抗氧化活性。先前用huvecs评估了cur-mof的细胞毒性，细胞存活率与浓度高于25μg ml-1
的对照组显著不同。有趣的是，在过氧化氢存在的情况下，即使浓度高达120μg ml-1
，细胞存活也随着cur-mof浓度的增加而增加(图4c)。因此，证明cur-mof具有抗氧化活性，并且随着浓度的增加而增加。
102.为了研究体外cur-mof@γ-pga/ε-pll清除活性氧的能力，首先使用脂多糖(lps)诱导巨噬细胞产生氧化自由基。接下来，使用2’，7
’‑
二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)作为ros探针，通过绿色荧光强度评估孵化期间的ros水平。结果表明，γ-pga/ε-pll处理的细胞荧光强度明显低于lps处理的细胞。同时，cur-mof@γ-pga/ε-pll组的荧光强度也显著低于lps组，表明cur-mof@γ-pga/e-pll具有自由基清除能力。与预期结果相反，cur-mof组处理的细胞荧光强度非常高。与cur-mof溶液组的不同浓度相比，cur-mof溶液组的浓度越高，荧光强度越高(图4a和图4b)。与维生素c类似，姜黄素是一种强大的还原剂，具有抗氧化和抗氧化作用。姜黄素促进活性氧生成的作用与其抗肿瘤和抑制瘢痕增生的作用密切相关。流式细胞术报告了类似的结果。研究表明，姜黄素的抗炎和增殖活性独立于其调节活性氧状态的能力。
103.实施例5 cur-mof@γ-pga/ε-pll水凝胶在体内促进深度烧伤创面愈合和血管生成
104.在小鼠背部建立直径为1cm的圆形三度烧伤模型。脱毛治疗后每隔24小时对小鼠皮肤进行一次治疗，以排除应用于小鼠皮肤的脱毛膏的化学损失。由于热效应造成的持续损伤，烧伤后伤口继续加深，直到24小时后，伤口停止进展并变得稳定。此时，去除烧伤的焦痂，然后用喷粉器将治疗组的粉末均匀地喷洒在伤口上。等待10分钟，让粉末从伤口吸收水分并形成凝胶以密封伤口。与其它组相比，cur-mof@γ-pga/ε-pll组在第12天伤口几乎完
全愈合(图5a)。cur-mof和γ-pga/ε-pll组也在第14天愈合，而对照组仍有较小的伤口。
105.对残余伤口面积的百分比进行了统计定量比较(图5b)。这些结果表明，cur-mof@γ-pga/ε-pll具有促进血管生成、促进细胞增殖、抗氧化、抗炎和抗菌的协同作用，因此具有有效的伤口愈合作用。
106.实施例6 cur-mof@γ-pga/ε-pll水凝胶促进体内组织再生和血管生成
107.通过苏木精和伊红(h&e)染色观察伤口床、肉芽形成和上皮形成过程，而通过马森三色染色观察胶原沉积和血管生成(图5c)。第7天，cur-mof@γ-pga/ε-pll组的上皮覆盖率已经高于对照组。在第14天，伤口愈合的宏观观察结果与cur-mof@γ-pga/ε-pll和cur-mof组的结果一致。cur-mof组和cur-mof@γ-pga/ε-pll组的上皮细胞均被完全覆盖，对照组和γ-pga/ε-pll各组的上皮细胞均有缺陷，但pp组的上皮覆盖率高于对照组。cur-mof@γ-pga/ε-pll组治疗的伤口床比其他组显示出更多的胶原形成，表明伤口闭合性更好。
108.使用免疫荧光染色评估体内组织再生。cd31和ki67分别用于标记再生组织中的毛细血管和增殖细胞(图6a和图6b)。对毛细血管密度(图6c)和再生细胞数量(图6d)进行了量化。结果表明，在伤口愈合的第7天，cur-mof@γ-pga/ε-pll组的增殖明显好于对照组，而cur-mof@γ-pga/ε-pll组和cur-mof组之间略有差异。在第14天进行进一步比较，发现cur-mof@γ-pga/ε-pll组与其他组之间存在显著差异。与对照组、γ-pga/ε-pll组和cur-mof组相比，cur-mof@γ-pga/ε-pll组的增殖毛细管密度分别高2.86、1.57和1.70倍。
109.实施例7 cur-mof@γ-pga/ε-pll水凝胶诱导体内m2复极
110.巨噬细胞在许多炎症细胞中具有重要的调节活性。在伤口愈合的早期阶段，从最初的炎性m1巨噬细胞形态到抗炎性m2巨噬细胞形态的及时和适当过渡对于重建正常体内平衡至关重要。因此，在第三天对γ-pga/ε-pll、cur-mof、cur-mof@γ-pga/e-pll治疗组和未经任何治疗的伤口(对照组)的伤口组织进行免疫荧光染色。有巨噬细胞标记(cd68，红色)、m1巨噬细胞标记(inos，绿色)和m2巨噬细胞标记物(cd206，绿色)(图7a和图7c)。cd68+和cd206+细胞数量的量化显示，与对照组相比，cur-mof@γ-pga/ε-pll、cur-mof和γ-pga/e-pll治疗分别使m2极化增加4.43倍、2.43倍和1.14倍(图7b)。同时，cd68+inos+细胞数量的量化显示，第三天在cur mof和cur mof@γ-pga/ε-pll组的组织免疫荧光染色中未发现m1细胞。对照组和γ-pga/ε-pll组均发现m1细胞(图7d)。这进一步证明了cur-mof和cur-mof@γ-pga/ε-pll的抗炎活性，cur-mof@γ-pga/ε-pll优于cur-mof。
111.实施例8 cur mof和cur mof@γ-pga/ε-pll水凝胶可有效缓解烧伤后疼痛
112.烧伤是一种非常痛苦的经历，疼痛缓解在烧伤伤口的治疗中尤为重要。许多研究表明姜黄素具有镇痛作用。疼痛影响小鼠的饮食和新陈代谢，从而影响其体重。因此，记录治疗后小鼠的体重变化，并用小鼠grimace量表(mgs)评估了小鼠的疼痛。结果表明，在治疗后的第一天，γ-pga/ε-pll组和对照组的小鼠体重减少到其治疗前体重的近9％，而cur-mof组和cur-mof@γ-pga/ε-pll组的小鼠重量没有显著变化。在接下来的14天里，所有四个组的体重都持续增加，γ-pga/ε-pll组和对照组的体重增加更快。四组体重逐渐接近对方(图7e)。以上结果显示了小鼠烧伤早期的疼痛和cur-mof的镇痛作用。mgs评估还显示，小鼠的疼痛在前三天很严重，第五天后逐渐减轻。第2天，cur-mof组和cur-mof@γ-pga/ε-pll组之间没有显著差异，cur-mof组的平均得分低于pp组和对照组。截至第3天，cur-mof@γ-pga/ε-pll组和cur-mof组的得分表现显著不同，再次表明cur-mof@γ-pga/ε-pll组活性成
分的持续释放(图7f)。