一种用于肿瘤靶向三联免疫细胞治疗的纳米佐剂胶束及其制备方法和应用

1.本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，尤其涉及一种用于肿瘤靶向三联免疫细胞治疗的纳米佐剂胶束及其制备方法和应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤严重危害人类健康，而免疫治疗能通过激活自身的免疫系统进而恢复机体的抗肿瘤免疫应答，实现高效杀伤肿瘤的目的，具有潜在的临床应用前景。研究证实，通过沉默/抑制肿瘤表观免疫耐受性组分(如免疫检查点pd-1/pd-l1、ctla-4及免疫耐受性因子tgf-β)的免疫治疗策略能部分逆转免疫耐受微环境，在临床上展现了不俗的疗效。然而，基于肿瘤固有免疫耐受组分(如肿瘤相关巨噬细胞(tams),骨髓来源的抑制性细胞(mdscs)及肿瘤浸润性树突状细胞(tidcs)等免疫耐受性细胞)能源源不断地表达/分泌表观免疫耐受分子(m2型tams通过分泌白介素10(il-10)，转化生长因子(tgf-β)和促血管生成因子抑制t细胞活化增殖的同时促进肿瘤血管新生；m2型mdscs通过分泌il-10，tgf-β和表达精氨酸酶抑制效应t细胞活性；tidcs具有功能缺陷，无法充分诱导对肿瘤抗原的适应性免疫应答)的原因，前述治疗策略被迫需要提高给药频次，并且无法从根本上彻底逆转肿瘤免疫耐受网络，这也是制约肿瘤免疫治疗的关键原因。鉴于肿瘤免疫抑制微环境的复杂性和肿瘤异质性，逆转单个耐受性细胞并不能完全重塑肿瘤免疫抑制微环境并重建抗肿瘤免疫反应。因此，如何将促进肿瘤生长的m2型tams和mdscs转变为抑制肿瘤的m1型，同时激活tidcs，将有望为提高肿瘤免疫治疗疗效提供新途径。
3.事实上，tams广泛浸润在肿瘤组织中，而mdscs和tidcs不断在肿瘤组织和引流淋巴结之间移动。一方面，cpg寡脱氧核苷酸(cpg odns)作为免疫佐剂是toll样受体9(tlr9)激动剂，不仅可以促进tidcs的成熟，还可以通过极化tams使其从促进肿瘤生长的m2型极化为抑制肿瘤生长的m1型。然而，佐剂分子cpg的稳定性差和易失活严重限制了cpg的生物利用度。另一方面，受限于肿瘤渗透和免疫耐受细胞低摄取两个障碍，使得目前用于促进肿瘤生长的m2型tams和mdscs转变为抑制肿瘤的m1型同时激活tidcs的治疗手段仍难以发挥实质疗效。


技术实现要素：

4.(一)要解决的技术问题
5.鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种用于肿瘤靶向三联免疫细胞治疗的纳米佐剂胶束，其能实现高效负载核酸药物并提高核酸药物的生物利用度，可克服体内递送屏障，安全高效递送免疫佐剂到达肿瘤微环境且同时靶向3类免疫耐受细胞(tams、mdscs和tidcs)，介导肿瘤“三重”免疫调控治疗并提高疗效。本发明还涉及该纳米佐剂胶束的制备方法和应用。
6.(二)技术方案
7.为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
8.第一方面，本发明提供一种用于肿瘤靶向三联免疫细胞治疗的纳米佐剂胶束，其为核壳结构的球形，粒径为80-120nm；所述核壳结构的球形包括胶束内核mpc和共聚物外壳peg-pll-dmma，胶束内核mpc粒径为40-60nm；共聚物外壳peg-pll-dmma具有ph响应性，其通过静电吸附作用接枝在胶束内核mpc表面；ph响应性是指共聚物外壳在肿瘤微环境低ph刺激下发生脱落导致纳米佐剂胶束尺寸变小和电荷反转；
9.所述胶束内核mpc为将甘露糖ma接枝到pei上，再通过静电吸附作用负载cpg得到具有三重靶向作用的内核ma-pei-cpg，即胶束内核mpc；
10.所述共聚物外壳peg-pll-dmma为以氨基聚乙二醇单甲醚mpeg-nh2为引发剂，通过n6-苄氧羰基-l-赖氨酸环内酸酐的酸酐环发生开环聚合反应合成peg-pllz，再脱去n6-苄氧羰基，得到含有氨基侧链的peg-pll，使用二甲基马来酸酐与peg-pll的氨基侧链缩合反应，以酰胺键结合，即制得共聚物外壳peg-pll-dmma。
11.所述纳米佐剂胶束具有增强肿瘤渗透和自放大药物释放特性的ph响应型且有三重靶向免疫耐受细胞的特性，所述纳米佐剂胶束能高保真性地负载核酸药物，并且程序性的克服体内诸多生理屏障，提高药物递送效率和生物利用度，有助于逆转复杂的肿瘤免疫抑制微环境及肿瘤免疫治疗，高效杀伤肿瘤并抑制肿瘤生长及转移。其中，ph响应是指共聚物外壳在不同ph环境下会发生尺寸增大或减小的变化，具体是在ph 7.4(模拟正常生理条件)条件下尺寸为100nm左右大小，而在ph 6.8(模拟肿瘤微环境低酸刺激)条件下尺寸减小到55nm，与胶束内核mpc的大小相近。此外，zeta电位结果表明，在ph 6.8刺激下，纳米佐剂胶束的表面电荷从-7.82mv反转为+23.29mv，证实了纳米佐剂胶束具有ph响应的电荷反转特性。
12.第二方面，本发明实施例提供一种用于肿瘤靶向三联免疫细胞治疗的纳米佐剂胶束的制备方法，其包括如下步骤：
13.s1、制备胶束内核mpc材料，其制备过程包括：
14.s11、对甘露糖ma羧基功能化，使用edc和nhs对其羧基进行活化，与溶有pei的溶液混合反应，反应液经双蒸水透析、冷冻干燥得到ma-pei；
15.s12、将cpg溶解于depc水得到cpg溶液，将溶解有ma-pei的depc的水溶液与cpg溶液混合，通过静电吸附作用将cpg吸附到ma-pei上；之后将混合体系涡旋静置，得到ma-pei-cpg；
16.s2、制备共聚物外壳peg-pll-dmma材料，其制备制备过程包括：
17.s21、以氨基聚乙二醇单甲醚mpeg-nh2为引发剂，将mpeg-nh2和n6-苄氧羰基-l-赖氨酸环内酸酐溶解于溶剂中，惰性气氛保护下常温反应，n6-苄氧羰基-l-赖氨酸环内酸酐的酸酐环发生开环聚合，反应结束后，将反应混合液滴加到乙醚中得到沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到产物peg-pllz；
18.s22、将产物peg-pllz溶于三氟乙酸，加入hbr/hac溶液，室温搅拌反应，使peg-pllz中n6-苄氧羰基与l-赖氨酸之间的酰胺键水解脱去n6-苄氧羰基，将反应混合液滴加到乙醚中得到沉淀，真空干燥，将沉淀溶于双蒸水中透析，冷冻干燥，收集得到含有氨基侧链的peg-pll；
19.s23、将peg-pll溶于水，并调节水溶液的ph调节至8-8.5，随后将二甲基马来酸酐
加入peg-pll水溶液中，用稀碱将ph保持在8-9之间，待ph稳定后，室温下继续反应，二甲基马来酸酐与peg-pll的氨基侧链反应形成新的酰胺键，之后用双蒸水透析，冷冻干燥收集产物，即为共聚物外壳peg-pll-dmma材料；
20.s3、制备核壳结构的纳米佐剂胶束
21.称取胶束内核mpc材料和共聚物外壳peg-pll-dmma材料按照1:1.8-2.2质量比混合溶解于depc水中，室温搅拌反应，共聚物外壳peg-pll-dmma材料以通过静电吸附作用接枝到胶束内核mpc材料表面，反应液在depc水中透析，冷冻干燥，收集产物，制得纳米佐剂胶束。
22.需说明的是，上述步骤s1和s2并不限制实施顺序，既可先制备共聚物外壳peg-pll-dmma材料也可先制备胶束内核mpc材料。
23.根据本发明的制备方法，步骤s11中，对ma羧基功能化的方法为：称取ma溶解于氢氧化钠溶液中碱化反应，将氯乙酸溶液加入反应体系，45-60℃连续搅拌，反应完成后，将反应体系ph调至2-3，混合液随后滴加到预冷的甲醇溶液中，离心去除沉淀并收集上清，减压蒸发，用乙醇重悬沉淀，离心去除沉淀，并用无水乙醇反复清洗，经真空干燥得到羧基功能化的ma产物ma-cooh。
24.优选地，氢氧化钠溶液浓度为3m；在55℃连续搅拌，反应10h，用1m hcl溶液将反应体系的ph调至2-3；以11000rpm的转速离心10分钟去除沉淀，无水乙醇清洗3次，真空干燥，得到ma-cooh。
25.根据本发明的制备方法，步骤s11中，将ma-cooh重悬于pbs中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc
·
hcl和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)室温搅拌对ma-cooh的羧基进行活化，然后将溶有pei的pbs溶液加入上述体系，室温搅拌，反应过程中ma通过其羧基与pei分子链上的氨基发生缩合反应，使ma接枝到pei链上；反应液经双蒸水透析、冷冻干燥得到最终产物ma-pei。
26.其中，pbs的ph＝6.5，每1mmol的ma-cooh添加1.5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)对ma-cooh的羧基进行活化，活化反应时间1.5h，加入0.16mmol pei(重均分子量mw＝1800da)的pbs溶液加入上述体系，室温搅拌48h，最后将反应溶液转移至透析袋(mwco＝3500da)，纯水透析3天，冷冻干燥收集最终产物，则合成了共聚物ma-pei。
27.根据本发明的制备方法，步骤s12中，每1nmol的核苷酸cpg溶解于50μl depc水，将200μl溶解有不同浓度ma-pei的depc溶液加入上述体系，制备一系列不同n/p比(氮/磷比，即pei中的氮原子与rna中磷酸盐的摩尔比)的混合体系，使混合体系中ma-pei与cpg的质量比分别为1、2、3、4、5、10、15和20；将混合体系涡旋30秒，静置放置0.5小时，所得的产物即为ma-pei-cpg(记为mpc)。最后根据实验，选出效果最好的混合体系。
28.depc水是用depc(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水(一级水)，无色液体，经检测不含杂质rna、dna和蛋白质。该步骤及后续步骤使用depc水都是不含杂质rna、dna和蛋白质的水，因此亦可以替换成其他方法处理的不含杂质rna、dna和蛋白质的水。
29.根据本发明的制备方法，步骤s21中，先将n6-苄氧羰基-l-赖氨酸环内酸酐溶于dmf中并进行脱气处理；随后将溶有氨基聚乙二醇单甲醚mpeg-nh2的四氢呋喃或dmf溶液缓
慢加入n6-苄氧羰基-l-赖氨酸环内酸酐的溶液中，氮气保护条件下，室温反应60-80h；随后将反应混合液滴加到乙醚中得到沉淀，收集沉淀于真空干燥箱内干燥，收集产物peg-pllz。
30.优选地，所述脱气处理是通过“液氮冷冻-抽真空-充氮气解冻”循环操作进行脱气处理，以排除n6-苄氧羰基-l-赖氨酸环内酸酐溶液中所混入的空气，防止氧气产生的氧化反应副产物。其中，n6-苄氧羰基-l-赖氨酸环内酸酐为现有化合物，可直接采购或自行合成。自行合成可按照如下方法进行：将n6-苄氧羰基-l-赖氨酸(25mmol)溶解在四氢呋喃中，50℃搅拌10分钟。将14mmol的三光气缓慢加入上述溶液中，再搅拌5小时后得到澄清溶液。随后转移到正己烷溶液中，-20℃静置过夜。过滤收集沉淀，随后用正己烷清洗3-5遍，室温下真空干燥24小时收集产物lys-nca。
31.优选地，合成peg-pllz的过程以氨基聚乙二醇单甲醚mpeg-nh2为引发剂，通过lys-nca的酸酐环发生开环聚合反应合成peg-pllz；具体步骤如下：以mw＝5000的mpeg-nh2和lys-nca溶解于dmf中，25℃持续反应3天；mpeg-nh2与lys-nca的摩尔量之比为1:20-30左右；随后，将反应混合液逐滴加入到乙醚中得到沉淀，收集沉淀于真空干燥箱内干燥，收集产物peg-pllz。
32.根据本发明的制备方法，步骤s22中，透析采用mwco＝3500da的透析袋。优选地，hbr/hac溶液的质量分数为33.3wt％，室温搅拌反应1h，将反应混合液滴加到乙醚中得到沉淀，真空干燥，将沉淀溶于双蒸水中透析(透析袋mwco＝3500da)3天，冷冻干燥，收集得到含有氨基侧链的peg-pll。
33.根据本发明的制备方法，步骤s23中，用氢氧化钠将peg-pll水溶液的ph调节至8.5，将二甲基马来酸酐dmma逐滴加入peg-pll水溶液中，用稀氢氧化钠溶液将ph保持在8-9；其中dmma的摩尔量是peg-pll中侧链氨基摩尔量的2倍；待ph稳定后，在室温下继续反应12h，随后用双蒸水透析(透析袋mwco＝3500da)36h，冷冻干燥收集产物，即得共聚物外壳peg-pll-dmma材料。
34.根据本发明的制备方法，步骤s3中，称取胶束内核mpc材料和共聚物外壳peg-pll-dmma材料按照1:2质量比混合溶解于depc水中，室温搅拌反应12h，共聚物外壳peg-pll-dmma材料以通过静电吸附作用接枝到胶束内核mpc材料表面，反应液在depc水中透析(透析袋mwco＝8000da)2天，冷冻干燥，收集产物，制得纳米佐剂胶束ppd/mpc。
35.第三方面，本发明提供上述任一实施例所述制备方法制备的纳米佐剂胶束在制备治疗肿瘤的佐剂或药物中的应用。
36.第四方面，基于本发明的基本思路和原理，在制备其他核酸药物时，还可将核酸cpg替换成其他具有治疗功能和活性的核酸药物分子，同时将靶向分子ma替换成其他相应的靶向分子，从而制得一种负载核酸药物的纳米胶束，用于相应疾病的治疗。制备方法和结构参照上述实施例。
37.例如，可设计一种负载核酸药物的纳米胶束，其核壳结构的球形，包括载药胶束内核和共聚物外壳peg-pll-dmma；共聚物外壳peg-pll-dmma具有ph响应性，其通过静电吸附作用接枝在载药胶束内核表面；ph响应性是指共聚物外壳在肿瘤微环境低ph刺激下发生脱落导致纳米佐剂胶束尺寸变小和电荷反转；
38.所述载药胶束内核为将靶向分子接枝到pei上，并通过静电吸附作用负载核酸药物分子得到具有靶向作用的载药胶束内核；
39.所述共聚物外壳peg-pll-dmma为以氨基聚乙二醇单甲醚mpeg-nh2为引发剂，通过n6-苄氧羰基-l-赖氨酸环内酸酐的酸酐环发生开环聚合反应合成peg-pllz，再脱去n6-苄氧羰基，得到含有氨基侧链的peg-pll，使用二甲基马来酸酐与peg-pll的氨基侧链缩合反应，以酰胺键结合，即制得共聚物外壳peg-pll-dmma。
40.(三)有益效果
41.本发明提供的纳米佐剂胶束为核壳结构的球形，由胶束内核mpc和共聚物外壳peg-pll-dmma所组成，胶束内核mpc为核酸载体递送cpg，高效负载核酸药物，提高生物利用度。胶束内核mpc中的寡脱氧核苷酸cpg不仅可促进tidcs的成熟，还通过极化tams将其从促进肿瘤生长的m2型极化为抑制肿瘤生长的m1型。胶束内核mpc中的聚醚酰亚胺pei又可通过激活tlr4通路将tams和mdscs从m2型逆转为m1型。胶束内核mpc中的ma甘露糖，可与在tidcs和m2-tams表面高度表达的cd206(甘露糖受体，可作为主动靶向给药系统的天然靶标)特异性结合，使纳米佐剂胶束负载的核酸药物主动靶向至tidcs和m2-tams，进而提高免疫耐受细胞对核酸药物的摄取效率和克服脱靶效应。纳米佐剂胶束的外壳peg-pll-dmma具有ph值响应性，在不同ph调节下自动调节尺寸大小和发生电荷反转，因而可以响应肿瘤微环境刺激，克服肿瘤渗透的生物屏障，有助于提高递送效率和抗肿瘤效果。
42.本发明制得的多功能纳米佐剂胶束ppd/mpc，能响应弱酸性的肿瘤微环境，诱导载体尺寸减小及电荷反转，克服肿瘤渗透和细胞屏障从而提高递送效率和生物利用度。此外，本发明的纳米佐剂胶束还具有三重免疫耐受细胞靶向的性能。简要来说，在肿瘤微环境释放的带强正电荷的mpc内核胶束通过淋巴回流以及受体-配体相互作用，分别特异性靶向tams、mdscs和tidcs，提高免疫耐受性细胞的胞吞效率，克服细胞摄取屏障，mpc既靶向极化tams和mdscs又靶向激活tidcs，“三重”调控免疫耐受微环境并级联放大抗肿瘤免疫应答，从而高效杀伤肿瘤，提高肿瘤免疫治疗效果。
附图说明
43.图1是实施例2中测试了实施例1各步骤产物的核磁、凝胶渗透色谱和红外光谱图：其中图1a、图1b和图1c分别是ma-pei、peg-pll、peg-pll-dmma的核磁，图1d是peg-pll-dmma和ma-pei的凝胶渗透色谱，图1e分别是peg-pllz、peg-pll、peg-pll-dmma、ma-cooh和ma-pei的红外光谱图；
44.图2是实施例3中测试了实施例1制备的产物在不同条件下的tem图、zeta图和dls图：其中图2a是mpc在ph 7.4以及ppd/mpc在ph 7.4、ph 6.8条件下的tem图，图2b是mpc在ph 7.4以及ppd/mpc在ph 7.4、ph 6.8条件下的dls图,图2c是mpc在ph 7.4以及ppd/mpc在ph 7.4、ph 6.8条件下的zeta电位值；
45.图3是实施例4的ppd/mpc纳米胶束的细胞活性图及体外肿瘤渗透图：其中图3a、图3b和图3c分别是不同浓度的ppd/mpc胶束与tams、tidcs及mdscs共培养24h和48h的细胞毒性测定图，图3d是肿瘤多细胞球与该体系在ph 7.4和ph 6.8的条件下分别孵育4h和12h的clsm图，图3e是荧光量化统计。图3d比例尺：200nm；
46.图4是实施例4中细胞摄取的clsm和fcm分析图：其中图4a、图4b和图4c分别tams、tidcs及mdscs细胞与ppd/mpc纳米胶束分别在ph 7.4、ph 6.8以及用甘露糖预处理条件下孵育12h后的clsm图像，细胞核和细胞骨架分别用dapi(蓝色)和actinred
tm
555(红色)染色，
图4d&4e&4f是在上述处理条件下，fcm对应的量化统计分析。图4a&4b&4c的比例尺：50μm；
47.图5是实施例4中体外抗肿瘤以及细胞因子检测图：其中图5a、图5b和图5c分别是b16f10细胞与tams、tidcs及mdscs共培养24h后的存活率；图5d和图5e是elisa试剂盒检测不同处理组与tams共孵育24h后il-12、il-10细胞因子的水平。图5f和图5g是elisa试剂盒检测不同处理组与tidcs共孵育24h后il-12、tnf-α细胞因子的水平，图5h、图5i、图5j和图5k是elisa试剂盒检测不同处理组与mdscs共孵育24h后il-12、tnf-α、il-10和tgf-β细胞因子的水平。
48.图6是实施例4的ppd/mpc纳米胶束体外重编程免疫耐受细胞流式图：其中图6a、图6b、图6c和图6d是不同处理组与tams共孵育24h后tams的表型、m1-tams和m2-tams的相对丰度及m1/m2的比例，图6e和图6f是不同处理组与tidcs共孵育24h后tidcs的表型及定量分析。
49.图7是实施例4的ppd/mpc体外抗肿瘤转移效果：图7a、图7b、图7c和图7d是b16f10细胞与tams共培养24h后划痕愈合、迁移和侵袭的显微镜图像和定量分析，图7e、图7f、图7g和图7h是b16f10细胞与mdscs共培养24h后划痕愈合、迁移和侵袭的显微镜图像和定量分析。其中图7a和7e的比例尺：100μm。
50.图8a-图8e为实施例5的ppd/mpc体内治疗及病理分析：图8a是荷瘤小鼠经生理盐水、cpg、ma-pei、mpc、ppd/mpc处理不同时间后的肿瘤大小，图8b是给药处理期间的相对肿瘤体积变化图；图8c和图8d是小鼠存活率曲线及体重变化图，图8e是肿瘤组织he，tunel及ki-67免疫荧光染色，其中，图8e的比例尺：50μm。
51.图9a-图9d是实施例5中t细胞的免疫响应流式检测：其中图9a和图9b是cd8
+
毒性t细胞流式检测和相应的量化统计，图9c和图9d是肿瘤浸润tregs细胞的流式检测及量化统计。
52.图10a-图10f是实施例5的成熟dc细胞、m1-tams细胞及mdscs细胞的免疫响应流式检测：其中图10a和图10b是肿瘤浸润成熟dc细胞的流式检测和量化统计，图10c和图10d是肿瘤浸润m1-tams细胞的流式检测及量化统计，图10e和图10f是肿瘤浸润mdscs细胞的流式检测及量化统计。
53.图11a-图11d是实施例5的b和nk细胞的免疫响应流式检测：其中图11a和11b是肿瘤浸润b细胞的流式检测及量化统计，图11c和11d是肿瘤浸润nk细胞的流式检测及量化统计。
54.图12是实施例5的生物安全性实验结果：图12a是荷瘤小鼠各个脏器的h&e染色，图12b是血常规图。其中，图12a的比例尺：50μm；
55.图13是实施例5的抗肿瘤转移的实验结果：其中图13a和图13b是各个给药处理组的b16f10恶性肿瘤肺转移模型小鼠肺部肿瘤转移结节及量化统计图；其中，图13a的比例尺：50μm；
56.图14a-图14e是实施例5的ppd/mpc抗肿瘤复发效率及免疫效应的持续性的图：其中图14a是通过以上治疗组的给药途径来评价肿瘤的复发程度的示意图，图14b是各种给药后小鼠的肿瘤复发率统计，图14c、图14d及图14e是小鼠二次注射肿瘤细胞后，体内效应记忆t细胞和中枢记忆t细胞水平流式检测和及量化统计。
57.图15是实施例5的多功能ppd/mpc纳米佐剂胶束系统在体内三重癌症免疫治疗能
力的示意图。
具体实施方式
58.为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
59.本发明的整体构思是：基于尺寸/电荷可调的纳米胶束系统及甘露糖ma靶向修饰的递送策略在增强肿瘤渗透、提高耐受性细胞靶向摄取及克服体内递送屏障中的优势，结合阳离子聚合物pei及免疫佐剂cpg能有效极化tams&mdscs并激活tidcs的特征，利用化学合成、静电吸附及自组装手段，优化合成参数，构建具有长循环、高渗透及“三重”靶向调控免疫耐受微环境特性的“推进式”佐剂胶束控释系统，策略性克服体内递送屏障，“三重”靶向极化tams&mdscs并靶向激活tidcs，抑制免疫耐受微环境，介导肿瘤“三重”免疫调控治疗，增强肿瘤免疫治疗效果。
60.首先，本发明合成负载cpg的ma和pei功能化的聚合物内核(ma-pei-cpg)，同时本发明还通过化学合成ph敏感键桥连的聚合物外壳(聚乙二醇-聚赖氨酸-二甲基马来酸酐peg-pll-dmma)，优化合成和组装参数。随后，将ph响应性可脱落的peg-pll-dmma外壳与ma-pei-cpg内核组装，制备“推进式”佐剂胶束。本发明得到的纳米胶束集成高药物装载量、易表面修饰、ph响应性尺寸减小及电荷反转、以及可降解等优点，易于制备与保存，并在核酸药物递送及肿瘤免疫治疗方面有潜在的应用。
61.本发明方案实现肿瘤的治疗的机理为：所述纳米佐剂胶束能安全高效负载免疫佐剂cpg，借助epr效应靶向肿瘤病灶。随后，响应肿瘤微环境低ph刺激，断裂酰胺键，快速脱落外壳peg聚合物，其尺寸变小，暴露表面带有强正电荷的mpc内核，实现载体尺寸减小和电荷反转，小尺寸载体更容易渗透到肿瘤深处，正电荷特性材料更容易被细胞高效摄取，进而克服体内生理屏障，提高体内药物递送效率。更为重要的是，小尺寸(约40-60nm)的内核mpc通过淋巴回流以及受体-配体相互作用，提高tams、mdscs和tidcs三类免疫耐受性细胞对ma-pei-cpg佐剂颗粒的靶向内吞效率。同时，通过cpg激活tlr-4/9通路，靶向逆转mdscs及tams表型，使其从促进肿瘤生长的m2型极化为抑制肿瘤生长的m1型，恢复其抗肿瘤免疫功能。同时，纳米体系负载的免疫刺激分子cpg在肿瘤原位形成“疫苗”促进tidcs激活，进而充分诱导对肿瘤抗原的适应性免疫应答，实现转移性肿瘤的治疗。
62.下面结合附图对本发明做进一步描述。需说明的是，以下实施例中制备多功能ppd/mpc纳米佐剂胶束所采用的具体方法和条件并不对本发明构成限制；本领域技术人员可根据下述具体实施例中的方法和条件进行合理地调整，只要能够所需的目标产物即可，而调整的方案和条件也应涵盖在本发明的专利范围之内。例如，在制备mpc内核时，先制备cpg的递送载体ma-pei，需要羧基化ma，利用ma所带羧基接枝到pei上，但对ma羧基化的方法和接枝到pei上的具体方法和条件则不限于下述实施例所举，只要能制备出递送载体ma-pei的方法都应涵盖在本发明的专利范围之内。
63.实施例1
64.本实施例为对本发明制备多功能ppd/mpc纳米佐剂胶束的举例，制备方法如下：
65.1、制备胶束内核ma-pei-cpg(简称mpc)：
66.①
ma-cooh的合成
67.首先，称取1.0g mannan溶解于10ml氢氧化钠溶液中(3m naoh)，碱化反应搅拌0.5小时。将2.5ml氯乙酸溶液(0.16g/ml)加入反应体系，55℃搅拌反应10小时。反应完成后，用1m hcl溶液将反应体系的ph调至2-3，混合液随后逐滴加入预冷的甲醇溶液中，4℃放置过夜，随后，离心去除沉淀(11000rpm，10分钟)。收集上清，减压蒸发去除溶剂，用无水乙醇重悬沉淀，离心收集(11000rpm，10分钟)，无水乙醇清洗3次，真空干燥，得到羧基功能化的mannan产物，简记为ma-cooh。结构如下：
[0068][0069]
②
ma-pei的制备
[0070]
将0.5mmol ma-cooh重悬于10ml pbs溶液(ph 6.5)，加入0.75mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，室温搅拌反应1.5小时，将ma-cooh活化。反应完成后，将3ml溶解有0.08mmol pei(重均分子量mw1800da)的pbs溶液加入上述体系，室温搅拌反应48小时。最后，将反应溶液转移至透析袋(截留分子量为3500da)，纯水透析3天，冷冻干燥收集最终产物，则合成了共聚物ma-pei。结构如下：
[0071][0072]
其中，pei的mw值会影响mpc内核的粒径，本实施例要制备的目标粒径是50nm，因此选用mw1800da的pei。但实际使用时，mpc内核是40-60nm的粒径也满足应用要求，此时可选用mw＝1700-1900da的pei。
[0073]
③
ma-pei-cpg的合成及优化
[0074]
将1nmol cpg溶解于50μl depc水(焦碳酸二乙酯)。随后，将200μl溶解有不同浓度ma-pei的depc溶液加入上述体系，制备一系列不同n/p比的混合体系，其中ma-pei与cpg的质量比分别为1、2、3、4、5、10、15、20。将混合体系涡旋30s，静置放置0.5h，所得的产物即为ma-pei-cpg，简记为mpc。
[0075]
2、共聚物外壳peg-pll-dmma的制备
[0076]
①
lys-nca的合成
[0077]
首先，将n6-苄氧羰基-l-赖氨酸(25mmol)溶解在四氢呋喃中，50℃搅拌10分钟。将14mmol的三光气缓慢加入上述溶液中，再搅拌5小时后得到澄清溶液。随后转移到正己烷溶液中，-20℃静置过夜。过滤收集沉淀，随后用正己烷清洗3-5遍，室温下真空干燥24小时收
集产物n6-苄氧羰基-l-赖氨酸环内酸酐，简记为lys-nca。结构如下：
[0078]
上述lys-nca为已知化合物，可以市场采购来使用。
[0079]
②
peg-pllz的合成
[0080]
该过程以mpeg-nh2为引发剂，通过lys-nca的酸酐环发生开环聚合反应生成peg-pllz。具体步骤如下：mpeg-nh2(0.2mmol,mw 5000)和lys-nca(5mmol)溶解于15ml的dmf中，25℃持续反应3天。随后，将反应混合液逐滴加入到200ml的乙醚中得到沉淀，收集沉淀于真空干燥箱内干燥，收集产物，简记为peg-pllz。产物结构如下：
[0081][0082]
③
peg-pll的合成
[0083]
将1.0g的peg-pllz溶于10ml三氟乙酸中。加入3ml的33.3wt％hbr/hac溶液于上述体系中，室温搅拌1小时后，酰胺键水解脱除掉n6-苄氧羰基，使产物侧链具有端氨基，随后反应混合液逐滴加入到200ml乙醚中得到沉淀后，真空干燥。随后，将沉淀溶于双蒸水中透析3天(截留分子量＝3500da)，冷冻干燥收集产物peg-pll。结构如下：
[0084][0085]
④
peg-pll-dmma的合成
[0086]
首先，用氢氧化钠将peg-pll水溶液的ph调节至8.5。随后将二甲基马来酸酐dmma(用量为peg-pll侧链氨基2倍摩尔量)逐滴加入peg-pll水溶液中，用1.0m的氢氧化钠将ph维持在8-9。待ph稳定后，在室温下继续反应12小时。随后用双蒸水透析36小时(mwco＝3500da)，冷冻干燥收集产物，即为peg-pll-dmma简称ppd。结构如下：
[0087][0088]
本实施例中，以上各步骤中透析袋选择截留分子量为3500da的规格，决定了目标产物的粒径大小。因此，其他实施例可根据需要的产物粒径，具体灵活选择其他规格的透析袋，如3000-4000da的透析袋进行透析。
[0089]
3、ppd/mpc纳米佐剂胶束的制备
[0090]
称取10mg ma-pei-cpg胶束内核和20mg peg-pll-dmma共聚物外壳材料溶解于10ml depc溶液中，室温搅拌12小时，共聚物外壳材料以静电作用结合在胶束内核表面。随后，将反应液在depc溶液中透析(mwco＝8000da)2天。最后，将反应液冷冻干燥收集最终产物，简记为ppd/mpc。
[0091]
本步骤中，透析袋选择截留分子量为8000da的规格，其决定了目标产物ppd/mpc纳米佐剂胶束的粒径大小。因此其他实施例可根据需要的产物粒径，具体灵活选择其他规格的透析袋，如7500-8500da的透析袋进行透析。
[0092]
实施例2
[0093]
将实施例1各步骤得到的产物经tem、1h nmr、dls和zeta电位分析仪、gpc、ftir等现代纳米测试分析技术对其形貌、成分和化学键进行系统地进行化学手段检测和表征，以证明各步骤确已成功制备目标产物，检测结果如下：
[0094]
(1)通过透射电镜及动态光散射对第1步制备的mpc和第3步制备的ppd/mpc进行表征。如图2a所示，mpc呈球形结构，其尺寸约50nm。上述结果证实，已成功合成合适尺寸的mpc纳米颗粒。经第3步采用peg-pll-dmma功能化修饰mpc内核后，ppd/mpc纳米颗粒显示出与mpc内核相似的球形形貌(参见图2a)，颗粒直径直接从50nm增加到100nm，这是由于成功接枝了peg-pll-dmma外壳导致的粒径尺寸变大。该结果与dls统计分析相一致(参见图2b，左侧曲线对应mpc+ph7.4，右侧曲线为ppd/mpc+ph7.4，中间曲线为ppd/mpc+ph6.8)。上述结果确认了ppd/mpc的成功制备。
[0095]
(2)本发明采用核磁光谱、gpc和ftir分析了实施例1制得的ma-pei、peg-pll和peg-pll-dmma的化学结构。如图1a所示，在ma-pei的核磁图谱中，各个基团的特征信号峰的位置及积分面积均准确无误，表明ma-pei的成功合成；如图1b所示，peg-pll的核磁谱图在3.32ppm和3.62ppm出现明显的信号峰，分别归因于peg中-och3甲氧基峰和-och2ch2o-亚甲基质子峰，并且各个特征峰积分面积准确，表明peg-pll已合成成功。dmma和peg-pll偶联后，在peg-pll-dmma核磁图谱中出现dmma的特征峰(g’，如图1c所示)，且其积分面积准确无误，表明peg-pll-dmma已成功合成。
[0096]
(3)再如图1d(图中左侧曲线对应peg-pll-dmma，右侧曲线对应ma-pei)所示，peg-pll-dmma的gpc谱图里只有单一的洗脱峰；且如表1所示，经计算平均分子量为16800g/mol，与核磁的计算结果及下表中的理论分子量相符，该结果再次表明peg-pll-dmma的成功合成。
[0097]
表1：共聚物peg-pll-dmma理论分子量mn与nmr和gpc检测分子量的比较
[0098][0099]
(4)采用ftir分析了实施例中各步骤得到的peg-pllz、peg-pll和peg-pll-dmma的化学结构。如图1e所示，去除peg-pllz的苯环后，peg-pll在738cm-1
和696cm-1
处苯环的吸收峰直接消失，而1651cm-1
和1545cm-1
处酰胺键特征峰仍然存在，证明peg-pll成功合成。将dmma引入peg-pll后，在2900cm-1
和1705cm-1
处出现了羧基的独特吸收峰，证实了dmma的成功修饰，即peg-pll-dmma已经成功合成。
[0100]
实施例3
[0101]
本实施例验证实施例1制备的ppd/mpc纳米佐剂胶束确实具有ph响应性尺寸减小/电荷反转的特点，在肿瘤微环境弱酸性刺激下可特异性释放带有cpg寡脱氧核酸的免疫佐剂内核mpc。实验方法和结果如下：
[0102]
(1)ppd/mpc纳米胶束ph响应性尺寸减小
[0103]
利用dls和zeta考察ppd/mpc控释系统ph响应的尺寸减小&电荷反转特性。如图2a所示，ppd/mpc在ph 7.4(模拟正常生理条件)条件下的尺寸为100nm，而在ph 6.8(模拟肿瘤微环境低酸刺激)条件下孵育4h后，颗粒尺寸减小到55nm，与mpc的大小相近，该结果与dls相符，证实该体系具有ph响应的尺寸减小特性。
[0104]
(2)ppd/mpc纳米胶束ph响应性电荷反转特性
[0105]
测试zeta电位结果表明，在ph 6.8刺激下，ppd/mpc的表面电荷从-7.82mv反转为+23.29mv(图2c，左侧柱为mpc+ph7.4，中间柱为ppd/mpc+ph7.4，右侧柱为ppd/mpc+ph6.8)，证实了该体系具有ph响应的电荷反转特性。
[0106]
实施例4
[0107]
本实施例主要研究ppd/mpc纳米佐剂胶束体外生物学特点，内容包括纳米佐剂胶束的细胞水平的生物安全性、体外肿瘤渗透和细胞摄取率、体外抗肿瘤效果、tams与tidcs及mdscs再教育及免疫刺激作用、体外抗肿瘤迁移性等方面。研究方法和实验结果如下：
[0108]
1、ppd/mpc纳米佐剂胶束的细胞安全性
[0109]
细胞培养：本实验选用的中国科学院细胞研究所提供小鼠黑色素瘤高转移细胞(b16f10)。b16f10细胞在含有10％fbs和1％双抗(100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的dmem高糖培养基中培养，培养环境为37℃、5％ co2的细胞孵箱中。
[0110]
为了评估ppd/mpc佐剂胶束的体外生物安全性，本实验首先将tams、tidcs和mdscs细胞以2
×
104cells/cm2的密度接种至24孔板，当细胞融合度达到约60-70％，分别用不同浓度的ppd/mpc纳米胶束与上述细胞共培养24h和48h，用pbs清洗细胞，随后加入200μl新鲜培养基和20μl cck8的混合溶液。在37℃条件下继续反应1.5-2h，随后将孔板内反应溶液转移至96孔板中，用酶标仪检测450nm波长下的溶液吸光度，由此计算细胞活性。结果如图3a所示，不同浓度的ppd/mpc处理的tams细胞的活力与pbs处理的细胞(对照)在24h和48h均无差异。此外，在tidcs和mdscs中也显示出类似的结果(图3b及3c)，证明了ppd/mpc在体外具有良好的生物安全性。其中图3a-图3c中上方的曲线对应48h，下方的曲线为24h。
[0111]
2、ppd/mpc纳米佐剂胶束在体外肿瘤渗透性和细胞摄取情况
[0112]
首先构建基于b16f10细胞的3d多细胞球体(mcs)，即肿瘤球模型。将80μl的1.5％的热琼脂糖溶液加入到96孔板中，待其冷却凝固成凝胶后，紫外照射灭菌过夜。随后将b16f10细胞以2
×
103cells/well的初始密度接种在上述孔板中，共培养6d后，形成肿瘤球。随后将fitc标记的ppd/mpc控释系统与肿瘤球共孵育，clsm监测控释系统在ph7.4(生理条件)和ph 6.8(模拟弱酸性肿瘤微环境)条件下的mcss渗透，考察控释系统ph增强的肿瘤渗透行为。如图3d所示，在ph 7.4的条件下，孵育4h后。绿色荧光标记的ppd/mpc多数分散在mcss外边界周围；即使孵育时间延长到12h，仍是上述情况，且仅有少量绿色荧光进入mcs的内部。在ph6.8条件下，孵育4h后，绿色荧光标记的ppd/mpc广泛分布在mcss核心区域；孵育12h时，整个mcs球体均分散了较强的绿色荧光。定量分析进一步证实了ppd/mpc纳米胶束具有ph增强的肿瘤渗透特性(参见图3e)。
[0113]
为进一步考察细胞摄取效率，将三种免疫抑制细胞tams、tidcs和mdscs分别与ppd/mpc-fam纳米胶束共孵育12h，利用激光共聚焦扫描显微镜(clsm)和流式细胞仪(fcm)对细胞水平的内吞效率进行视觉成像和定量分析。如图4a、图4b和图4c所示，无论孵育ph值如何，所有tams、tidcs和mdscs都能明显内吞ppd/mpc。此外，在ph为6.8时，上述细胞内吞的纳米胶束数量高于ph值为7.4时，这也在相应的fcm定量分析中得到验证(图4d、图4e和图4f，图4d从左到右依次为control、ma预处理+ppd/mpc-fam+ph6.8、ppd/mpc-fam+ph7.4、ppd/mpc-fam+ph6.8；图4e与图4d曲线顺序相同，但第二和第三条接近重合；图4f从左到右依次为control、ppd/mpc-fam+ph7.4、ppd/mpc-fam+ph6.8、ma预处理+ppd/mpc-fam+ph6.8，后两条曲线接近重合)。ph改变提高了免疫抑制细胞的摄取可能是因为ma介导的靶向摄取和pei介导的静电吸附内吞作用，这是由于ph6.8时的尺寸减小和ma修饰的pei聚阳离子mpc内核暴露所致。为了明确ma或pei介导的胞吞途径，实验将ma分子预处理tams、tidcs和mdscs以阻断ma受体，然后利用clsm和fcm研究其摄取效率。事实上，ma预处理后，过表达ma受体的tams和tidcs对ppd/mpc的内吞量均急剧下降，而未过表达ma受体的mdscs内吞量无显著差异(图4c和图4f)。前述实验再次证明了弱酸性肿瘤微环境是通过ma和pei介导的靶向及静电吸附内吞途径提高免疫抑制细胞的内吞作用。
[0114]
3、ppd/mpc体外抗肿瘤效果、tams、tidcs和mdscs再教育免疫刺激作用tams、tidcs和mdscs通过分泌大量免疫抑制因子，抑制效应t细胞活性，促进肿瘤生长，在维持肿瘤免疫抑制微环境中发挥重要作用。因此，同时靶向再教育tams、tidcs和mdscs，将促进肿瘤生长的m2-tams/mdscs极化为抑制肿瘤生长的m1-tams/mdscs，同时活化tidcs，将大幅恢复效应t细胞活性，并通过重塑复杂的肿瘤免疫抑制微环境和增强抗肿瘤免疫反应杀死肿瘤细胞。具体如下：
[0115]
(1)体外抗肿瘤效果
[0116]
构建b16f10肿瘤细胞与tams、tidcs或mdscs共培养体系。评价ppd/mpc纳米胶束激活极化tidcs&tams&mdscs对肿瘤的杀伤效果。一方面，与对照组(control组)相比，cpg在含有b16f10细胞的tams和tidcs共孵育组中均诱导了中等程度的肿瘤细胞杀伤(图5a与图5b)，这可能与cpg佐剂与tlr9识别介导tams极化和tidcs成熟有关，另一方面，ma-pei还对tams和mdscs共培养系统中的b16f10细胞产生了细胞毒性(图5a与图5c)，这是由于pei聚阳离子通过tlr4识别通路介导tams和mdscs的极化。此外，mpc组在所有处理组中b16f10活力最低，这是由于综合了cpg和pei以及ma的靶向能力。在纳米体系中引入ppd外壳后，由于外
壳的屏蔽作用，ppd/mpc在所有共培养体系中诱导的肿瘤杀伤能力均低于mpc组。
[0117]
(2)elisa及fcm检测
[0118]
为了阐明纳米胶束基于tams、tidcs和mdscs重编程的抗肿瘤机制。实验采用fcm和elisa分别检测与不同处理组共孵育24h后这些细胞的表型变化以及相应细胞因子分泌情况。在表型变化分析中，实验直接观察到cpg组和ma-pei组均增加了m1-tams的数量，减少了m2-tams的数量(图6a、图6b与图6c)，证实了cpg佐剂和pei成功的介导了tams极化。此外，mpc处理组介导了最高水平的tams极化，这是由于cpg、pei和ma靶向分子的协同优势。而ppd/mpc中由于ppd外壳的屏蔽作用m1-tams极化数量显著减少。此外，tams极化的金指标m1-tams/m2-tams也证实了上述趋势具有显著性差异(图6d)。因此，利用cpg和ma的优势，mpc内核和ppd/mpc纳米胶束均能有效诱导tidcs的成熟(图6e与图6f)，且ppd/mpc组成熟的tidcs数量明显低于mpc组。此外，pei共轭形成的ma-pei和mpc可以有效地引起mdscs的极化，得益于pei聚阳离子内在的极化mdscs的特性，mdscs的数量减少。并且在ppd/mpc纳米胶束中，这一趋势有所减缓。这些结果证实了mpc内核和ppd/mpc纳米胶束都能显著促进tams与mdscs极化和tidcs的成熟，从而有效的肿瘤杀伤。
[0119]
为进一步验证纳米胶束基于tams、tidcs和mdscs重编程的抗肿瘤机制，通过elisa检测被重编程的上述细胞所分泌的具有代表性的免疫反应相关细胞因子。如图5d与图5e，tams经过cpg、ma-pei、mpc和ppd/mpc治疗后，免疫促进因子il-12分泌上调，免疫抑制因子il-10分泌下调。tidcs经过同样的处理后，免疫促进因子il-12和tnf-α分泌均上调(图5f与图5g)。mdscs经过ma-pei、mpc和ppd/mpc治疗后，免疫促进因子il-12和tnf-α分泌上调，免疫抑制因子il-10和tgf-β分泌下调(图5h、图5i、图5j与图5k)。以上结果证实了mpc内核和ppd/mpc纳米胶束能够有效地再极化tams和mdscs同时活化tidcs。提高免疫促进因子的分泌，抑制免疫抑制因子的分泌。通过免疫刺激作用显著的杀伤肿瘤细胞。
[0120]
4、体外抗肿瘤迁移性
[0121]
由于tams和mdscs在肿瘤迁移过程中都发挥了重要作用。因此，本实施例采用划痕愈合、迁移和侵袭实验评估ppd/mpc纳米胶束对b16f10细胞的抗迁移作用。
[0122]
将tams、mdscs分别接种在6孔板中，用pbs、cpg、ma-pei、mpc、ppd/mpc处理24h后，收集上清液备用。同时，将b16f10细胞接种在6孔板中，当细胞密度达到70％-80％左右，用黄枪头轻轻的在单层的培养细胞间划痕(枪头与六孔板的底部垂直不倾斜，使划痕在同一方向成一直线)，随后除去培养基，加入上述上清液。再过24h后，pbs清洗，最后用显微镜拍摄划痕愈合的图像。结果如图7a及图7b所示，在含有tams和b16f10细胞的愈合实验中，对照组(control组)的b16f10细胞划痕消失，显示肿瘤细胞固有较强的愈合能力。而cpg、ma-pei、mpc和ppd/mpc的抗迁移效果不同，愈合率分别为61.62％、47.24％、24.75％和56.59％。
[0123]
在细胞迁移实验中，将1
×
105cells/cm2的b16f10细胞接种在transwell上室并于无血清培养基中培养，同时，在transwell下室接种经过上述处理的2
×
105cells/cm2的tams和mdscs并于完全培养基中培养。对于侵袭实验：将2
×
105cells/cm2的b16f10细胞接种在transwell预包被的基质凝胶上。在该测试中，将含有10％血清的培养基作为化学引诱剂添加至下腔室。将细胞孵育24h后，用棉签除去transwell上表面的细胞，并用结晶紫将下表面的细胞染色。染色后，计数细胞，然后在显微镜下成像。实验规定未经处理的对照组的细胞
迁移/侵袭率为100％。
[0124]
结果如图7a、图7c及图7d所示，在含有tams和b16f10细胞的迁移和侵袭实验也显示出与上述划痕愈合实验相似的趋势，其中，mpc组对b16f10细胞迁移和侵袭的抑制作用最强，该处理组肿瘤细胞迁移和侵袭相应的比率分别为23.73％和24.16％。值得注意的是，ppd/mpc组在迁移和入侵检测中的覆盖率分别提高到44.77％和45.34％，这是由于ppd外壳的实际屏蔽作用。在另一种由mdscs和b16f10细胞组成的伤口愈合、迁移和侵袭试验中也得到了类似的结果(图7e、图7f、图7g及图7h)，ma-pei、mpc和ppd/mpc均显示出明显的抗迁移作用。以上结果表明ppd/mpc纳米胶束可以有效抑制体外肿瘤的转移。
[0125]
实验例5
[0126]
本实施例主要研究ppd/mpc纳米佐剂胶束在动物体内的抗肿瘤评价，内容包括纳米佐剂胶束的体内生物安全性、药物干预和组织病理学分析、肿瘤转移与复发效率及免疫效应的持续性等方面。研究方法和实验结果如下：
[0127]
1、构建荷瘤小鼠模型
[0128]
本实验所有动物实验均按照实验动物管理与使用委员会工作手册相关规定进行。5-6周龄的18g左右的雌性c57bl/6小鼠购自中国北京药品检验所。本实验采用指数生长期的b16f10细胞制备了100μl的细胞悬液，将悬液皮下接种在每只小鼠的右侧腹股沟皮下，建立荷瘤小鼠模型每天观察小鼠的健康状况和行为，每2天记录荷瘤小鼠的体重以及肿瘤体积，根据以下的公式计算肿瘤体积(v)：v＝a
×
b2/2(a，肿瘤的长径；b，肿瘤的短径)。
[0129]
2、药物干预和组织病理学分析
[0130]
将成功构建的荷瘤小鼠荷瘤小鼠依据重量随机的原则分为五组，静脉注射生理盐水、cpg、ma-pei、mpc和ppd/mpc，每周给药2次，持续20天。给药结束后，安乐死小鼠。收集小鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，进行he、tunel、ki-67及其他免疫荧光染色进行组织病理学分析。
[0131]
处死小鼠后，收集主要器官和肿瘤组织，结果如图8a所示，cpg组和生理盐水组的肿瘤大小相似，肿瘤在给药期间呈现出快速的生长趋势，表明裸cpg没有明显的抗肿瘤作用；ma-pei组和mpc组分别显示出对肿瘤生长轻微和中等程度的抑制作用，在所有处理组中，ppd/mpc组诱导了最显著的肿瘤生长抑制作用，且b16f10恶性肿瘤在给药处理18天后几乎消失，这表明ppd/mpc介导的肿瘤免疫治疗能高效杀伤肿瘤。图8b的肿瘤体积统计结果证实了相同的肿瘤生长抑制趋势。此外，与其他处理组相比，ppd/mpc组不仅显著延长了荷瘤小鼠的存活时间(30天存活率为67％，图8c，明显高于其他治疗组)，而且给药期间荷瘤小鼠体重没有减轻(图8d)，这表明ppd/mpc控释系统具有良好的生物安全性及优异的抗肿瘤作用。图8b的曲线从上至下依次对应saline组、cpg组、ma-pei组、mpc组和ppd/mpc组。图8b从右到左依次对应ppd/mpc组、mpc组、ma-pei组、cpg组和saline组。图8c上方重合的两条曲线对应saline和cpg组，中间曲线对应ma-pei组、下方第四-五条曲线分别对应mpc和ppd/mpc组。
[0132]
组织病理学分析的结果如图8e所示，与对照组(saline组)和cpg组相比，ma-pei组和mpc组均诱导了一定程度的肿瘤组织凋亡；ppd/mpc组诱导了最为严重的肿瘤组织凋亡，表现为肿瘤切片he图中明显的细胞塌陷、变形和染色质浓缩以及tunel图中标记dna损伤的大量品红色荧光点。此外，ki-67免疫荧光染色结果表明，mpc组和ppd/mpc组均有效下调了
肿瘤细胞ki-67的表达，其中，ppd/mpc组呈现出ki-67的最弱表达，这再次佐证了ppd/mpc控释系统有良好的抗肿瘤作用。
[0133]
3、体内免疫响应检测
[0134]
本实验采用fcm量化分析肿瘤部位浸润性的各类免疫细胞比例来验证ppd/mpc控释系统通过三重重编程tams、tidcs和mdscs激活抗肿瘤免疫反应和抑制免疫逃逸。具体实验过程如下：
[0135]
在给药处理后，安乐死小鼠，收集肿瘤组织，在37℃的摇床按照美天旎肿瘤组织解离试剂盒说明书消化肿瘤组织45min。随后将裂解后的溶液通过75μm的滤膜以此分离单分散的淋巴细胞，离心收集，并用清洗液进行清洗，把细胞重悬于pbs溶液中。接着，将细胞用live/dead染料染色20min。检测项目如下：
[0136]
①
对于肿瘤浸润cd4
+
及cd8
+
t细胞的检测：将上述收集的细胞与anti-cd3-apc/cy7、anti-cd4-fitc和anti-cd8-percp-cy5.5在4℃条件下共孵育30min，随后用fcm检测肿瘤浸润cd4
+
及cd8
+
t细胞水平。
[0137]
②
对于tregs细胞的检测：将上述收集细胞与anti-cd25-apc和anti-cd4-fitc共孵育染色30min后，再参照foxp3试剂盒上的步骤进行固定、透化，随后将细胞与anti-foxp3-pe在4℃孵育30min，并用fcm检测肿瘤浸润treg细胞(cd25
+
cd4
+
foxp3
+
)的水平。
[0138]
③
对于肿瘤浸润成熟的dc细胞的检测：将上述收集细胞与anti-cd11b-fitc、anti-cd80-apc和anti-cd86-pe共染色30min，并用fcm分析dc细胞(cd11b
+
cd80
+
cd86
+
)的水平。
[0139]
④
对于肿瘤浸润nk细胞的检测：将上述收集细胞与anti-cd3-apc/cy7和anti-cd49b-fitc共染色30min，并用fcm分析nk细胞(cd3-cd49b
+
)的水平。
[0140]
⑤
对于肿瘤浸润b细胞的检测：将上述收集细胞与anti-cd3-apc/cy7和anti-cd45r/b220-pe共染色30min，并用fcm分析b细胞(cd3-cd45r/b220
+
)的水平。
[0141]
⑥
对于肿瘤浸润m1-tams的检测：将上述收集细胞与anti-cd11b-fitc、anti-f4/80-apc和anti-cd86-pe共染色30min，并用fcm分析m1-tams(cd11b
+
f4/80
+
cd86
+
)的水平。
[0142]
⑦
对于肿瘤浸润mdscs的检测：将上述收集细胞与anti-cd11b-fitc和anti-gr-1-pe共染色30min，并用fcm分析mdscs(cd11b
+
gr-1
+
)的水平。实验结果如下：
[0143]
如图9-图10所示，由于固有的免疫抵抗，对照组(saline组)出现了大量的免疫抑制细胞(tregs、mdscs)和少量的免疫促进型细胞(肿瘤浸润的细胞毒性t细胞(ctls)、m1-tams和成熟的dcs)。同时，cpg组表现出与对照组(saline组)相似的趋势，这是因为cpg在血液循环中易被酶水解或失活，无法发挥其功效。ma-pei组m1-tams和ctls的数量呈中度上升，而tregs和mdscs的数量呈中度下降，这是由于pei阳离子聚合物可以极化tams和mdscs，有助于激活免疫反应。此外，mpc组呈更高比例的m1-tams、ctls和tidcs以及更少的tregs和mdscs，这是由于cpg佐剂在具有ma靶向性的mpc中引起tams的额外复极和tidcs的激活。此外，ppd/mpc组的m1-tams、ctls和tidcs的数量最多且mdscs和tregs的数量最低，证明ppd/mpc组诱导了最强的免疫反应激活。另外如图11所示，免疫促进细胞自然杀伤细胞(nks)和b细胞也被招募到肿瘤部位，且在ppd/mpc组的比例最高。进一步提高肿瘤免疫反应和肿瘤杀伤效率。其原因可能是ppd/mpc纳米体系响应弱酸性的肿瘤微环境通过尺寸减小&电荷反转和ma靶向性策略，能克服肿瘤渗透和细胞摄取屏障，提高药物递送效率及生物利用度。暴露
的mpc内核带有强正电荷且具有ma靶向性可以被免疫抑制细胞(tams、mdscs、tidcs)内吞，通过cpg和pei的协同作用，同时极化tams&mdscs和激活tidcs并相应地调节相关细胞因子/免疫因子的分泌。伴随其他免疫促进细胞(ctls、nk和b细胞)的募集以及免疫抑制细胞(tregs)的清除，导致免疫反应的激活和免疫逃逸的抑制。因此，ppd/mpc纳米胶束可以通过重编程tams&mdscs&tidcs有效的重塑免疫耐受微环境，增强抗肿瘤免疫应答，在体内抑制肿瘤生长和提高肿瘤免疫治疗方面显示出巨大的潜在优势。
[0144]
4、生物安全性
[0145]
本实验深入研究了本发明的生物安全性。如图12a，主要脏器器官h&e分析结果表明，ppd/mpc处理组与对照组(saline组)相似，心脏、肝脏、脾脏和肾脏主要组织结构特征均显示正常完整，证实了ppd/mpc纳米胶束在体内具有良好的生物安全性。此外，实验在尾静脉给药(生理盐水和ppd/mpc)24h后通过眼眶静脉丛取血。然后将血液放在含有edta的抗凝管中做血常规分析。如图12b所示，与对照组(saline组)相比，所有血常规指标均正常，这再次表明该纳米胶束具有良好的血液安全性。
[0146]
5、抗肿瘤转移、复发效率及免疫效应的持续性
[0147]
本实验构建肺转移模型来进一步考察ppd/mpc控释系统的抗肿瘤转移作用。在小鼠的尾静脉注射100μl含有1
×
106b16f10肿瘤细胞的pbs溶液，7d后，将小鼠随机分为5组，分别进行不同的给药处理，第10d后，结束给药，安乐死小鼠。收集小鼠的肺组织，用pbs清洗并用相机拍照，计算肺转移结节的数量以此来评估控释系统的抗肿瘤转移效率。之后将小鼠的肺组织保存在10％的福尔马林溶液中，进行he染色分析。
[0148]
结果如图13a所示，可以观察到在所有处理组中，ppd/mpc组的肺组织中仅有极少量的肿瘤转移性结节，且量化统计具有统计学差异(图13b)。这表明ppd/mpc控释系统显著性高效的抑制肿瘤转移。相反，在其他给药处理组中，小鼠肺组织中均有不同程度的肿瘤转移性结节。该结果表明，ppd/mpc体系具有显著性的抗肿瘤转移作用。
[0149]
为了评价ppd/mpc控释系统抗肿瘤复发效率及诱导机体免疫效应的持续性，首先，将给药处理后的荷瘤小鼠肿瘤切除，随后，皮下二次注射肿瘤细胞，通过检测二次成瘤小鼠的数量以及机体免疫记忆t细胞水平来揭示机体二次免疫效果及抗肿瘤复发水平，实验操作时间轴如14a所示。实验结果如图14b所示，对照组、cpg组、ma-pei组以及mpc组处理的小鼠均呈现出较高的肿瘤复发率(83.3％-100％)；而ppd/mpc处理组将机体的肿瘤复发率显著地降低至50％，远远低于其他处理组，表明该组有效地抑制了肿瘤复发(图14b中从右至左依次对应ppd/mpc组、mpc组、ma-pei组、cpg组和saline组)。另外，ppd/mpc组小鼠体内效应记忆t细胞(即可立即提供保护的t
em
，cd3
+
cd8
+
cd62l-cd44
+
)水平显著性增多，同时中枢记忆t细胞(t
cm
，cd3
+
cd8
+
cd62l
+
cd44
+
，只有在抗原刺激的克隆扩增，分化和运输过程中提供保护)水平相应下降(图14c)，且与其他处理组具有统计学差异(图14d及图14e)。结果表明，ppd/mpc控释系统成功激活了免疫记忆反应，对肿瘤复发具有长期有效的作用。
[0150]
综上所述，本发明构建了一种ph响应的可拆卸外壳和ma修饰的cpg共轭聚阳离子内核组成的多功能佐剂胶束，用于靶向tams、mdscs及tidcs三联免疫治疗。从实施例4-5详细的体内外实验结果表明，ppd/mpc纳米胶束不仅通过弱酸性肿瘤微环境响应的尺寸减小&电荷反转，可以克服肿瘤渗透屏障和免疫抑制细胞摄取屏障，而且通过三重极化tams及mdscs和激活tidcs策略有效逆转了复杂的肿瘤免疫耐受微环境同时提高抗肿瘤免疫应答。
由于这些优点，ppd/mpc纳米胶束有效地抑制肿瘤生长、转移和复发，并激活了免疫记忆反应。因此，本发明展示了一种具有良好生物安全性的纳米佐剂系统，可以同时再教育tams、mdscs和tidcs进而逆转复杂的肿瘤免疫耐受微环境并且增强免疫反应应答，是一种新型的多功能三联免疫治疗佐剂。
[0151]
本发明方案的主要技术优点在于：
①
本发明构建ph响应材料peg-pll-dmma，与ma-pei-cpg通过静电吸附作用自组装形成纳米佐剂胶束，该体系能响应肿瘤微环境低酸刺激，诱导peg-pll-dmma脱落和胶束尺寸减小、电荷反转，特异性释放免疫佐剂内核ma-pei-cpg，克服肿瘤渗透和细胞摄取屏障，提高药物递送效率。
②
本发明制备的纳米反应器表面功能化有peg-pll-dmma外壳，能避免非特异性吸附并延长血液循环时间，克服血液循环屏障；该纳米佐剂胶束还具有ph响应性尺寸减小及电荷反转特性，能克服肿瘤渗透和细胞摄取屏障，提高递送效率；此外，该体系还具有三重靶向免疫耐受细胞的作用。实验体外构建肿瘤多细胞球模型，clsm和fcm量化统计结果表明，ppd/mpc纳米胶束显著性增强肿瘤渗透水平和细胞摄取效果。在ph7.4条件下共孵育4h后，标记绿色荧光的ppd/mpc胶束主要分布在肿瘤球周围，即使时间延长到12h，也只有少量位于肿瘤球内部。然而在模拟肿瘤微酸条件下(ph 6.8)，绿色荧光标记的纳米胶束渗透到整个肿瘤内部，随着培养时间延长到12h，穿透肿瘤球内部的趋势进一步增强且表现出更强的荧光强度。
③
本发明以ma-pei作为核酸载体将cpg靶向到肿瘤微环境中的免疫耐受细胞，借此提高免疫耐受细胞对核酸药物的摄取效率和克服脱靶效应，增强的机体抗肿瘤免疫应答水平。同时，免疫佐剂cpg和pei协同极化tams和mdscs并活化tidcs。fcm量化统计表明，ppd/mpc纳米胶束有效的增强机体抗肿瘤免疫应答效果。相比对照组，ppd/mpc纳米胶束处理组的小鼠肿瘤浸润性cd8
+
t细胞细胞水平提高了约2.0倍，成熟dc细胞水平提高约2.8倍，m1-tams细胞水平提高约4.2倍，b细胞水平提高约2.6倍，nk细胞水平提高约4.8倍。
④
本发明制备的ppd/mpc纳米控释系统成功激活了机体免疫记忆，对肿瘤复发长期有效，具有长效的免疫记忆功能。fcm量化统计表明，ppd/mpc纳米胶束能激活机体长效的免疫记忆功能，抑制肿瘤复发。相比对照组，小鼠体内脾脏记忆效应t细胞水平提高约2倍，术后27天内肿瘤复发率降低至50％。
⑤
有效的体外及体内肿瘤治疗效果。量化统计表明，ppd/mpc纳米胶束有效杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长及转移，延长荷瘤小鼠存活时间。相比对照组，ppd/mpc纳米胶束诱导体外肿瘤转移和侵袭率降低至23.73％和24.16％。体内肿瘤生长抑制率是对照组的约20倍，有效抑制肿瘤的肺转移，30天的小鼠存活率提高至67％。
[0152]
由于聚合物胶束具有可降解、易改性和高负载率的优势，聚合物胶束为重新编程tams&mdscs&tidcs所需的cpg和pei的纳米平台提供了可靠的保证。因此，构建具有大小/电荷变化和甘露糖(ma)靶向特性功能化的纳米佐剂胶束给药系统，使其克服体内递送屏障，三重逆转免疫耐受微环境并增强肿瘤免疫应答，将为新型功能化佐剂胶束的开发及提高肿瘤免疫治疗效果提供新的解决方案和实践指导，具有重要的科学意义和潜在的应用前景。
[0153]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。