用于基因编辑试剂递送的脂质组合物及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种用于递送基因编辑试剂的脂质组合物，所述脂质组合物以及其中的可电离脂质化合物在制备基因编辑用试剂中的应用。

背景技术：

1、基因组靶向修饰技术是指通过某种途径对基因组dna特定位点进行改造的一种手段。自1987年thompsson等建立起完整的es细胞基因敲除小鼠模型至今经过20多年的发展，该技术已经建立起许多理论与方法，包括例如锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，zfn)技术，类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator like effectornucleases，talen)技术，crispr/cas9(clustered regulatory interspaced shortpalindromic repeats/crispr-associated protein 9)技术等。

2、与目前其他的技术相比，crispr/cas9技术是通过一段rna来识别靶位点，因而在设计和构建上更加简单。只需合成定制的crrna，将其插入到合适的质粒中，与分别表达tracrrna和cas9蛋白的质粒共转染细胞，或在体外转录成rna后注射到特定细胞中，就可以建立基因敲除的细胞系或动物模型。如今科学家发现，将crrna：tracrrna的双链rna结构改造成单链导向rna(single-guide rna，sgrna)同样能够指导cas9蛋白特异切割双链dna，这进一步提高了操作简便性。

3、而如何高效地将crispr/cas9技术中所用到的dna或者rna送入目标细胞中，成为进一步提升所述方法基因靶向修饰效率的一个关键点。在基因治疗中，可电离脂质化合物已经被证明是治疗各种疾病的核酸的优良递送载体。将由可电离脂质化合物等脂质在内形成的脂质纳米颗粒作为crispr/cas9技术的试剂的递送载体，或许是一个可以考虑的技术方向。

技术实现思路

1、本发明的发明人研究获得了一种新型可电离脂质化合物，其可用于递送生物活性分子(例如，mrna，sirna，micrna，蛋白质，多肽等)。鉴于胺基结构可质子化形成带正电荷的阳离子基团，本发明的可电离脂质化合物尤其适用于传递带负电荷的活性物质，例如dna、rna或其它核苷酸分子，使其在递送crispr/cas9技术的试剂上具有优异的应用效果。

2、在此基础上，本发明提供了一种crispr/cas9技术用试剂的递送系统或组合物，所述递送系统或组合物包含含有脂质的递送体，和位于所述递送体中的crispr/cas9用试剂。本发明还提供了所述新型可电离脂质化合物在制备crispr/cas9技术用试剂的递送系统或组合物中的应用。所述递送系统中的递送体可以是微粒、纳米粒子、脂质体、脂质纳米颗粒或微泡。在本发明的一个实施方式中，所述递送体是脂质纳米颗粒。本发明还提供一种在体外进行基因编辑的方法，其使用本发明所述的递送系统或组合物。

3、一种crispr/cas9技术用试剂的递送系统或组合物，所述递送系统或组合物包含含有脂质的递送体，和位于递送体中的crispr/cas9用试剂。

4、所述递送体可以是微粒、纳米粒子、脂质体、脂质纳米颗粒或微泡。在本发明的一个实施方式中，所述递送体是脂质纳米颗粒。

5、在本发明的一个实施方式中，所述递送体由脂质组成。

6、根据本发明，所述递送体中含有式i所示的可电离脂质化合物其中：

7、q为其中，r8、r9彼此独立的选自经取代或未取代的直链c1-10亚烷基，所述亚烷基的1个或1个以上c原子任选被独立地选自o、s和n的杂原子所替换；r7为氢，卤素，-oh，直链或支链c1-20烷基，直链或支链c2-20烯基，直链或支链c2-20炔基，或-ch2ch(oh)r5，或所述取代的取代基团为卤素、-oh、直链或支链的c1-10烷基、直链或支链的c1-10烷氧基；

8、r1、r2、r3、r4可以相同或不同，各自独立的选自氢，经取代或未取代的直链或支链c1-30烷基，经取代或未取代的直链或支链c2-30烯基，经取代或未取代的直链或支链c2-30炔基，所述烷基、烯基或炔基的1个或1个以上c原子任选被独立地选自o、s和n的杂原子所替换，或-ch2ch(oh)r5；所述取代的取代基团选自卤素、-oh、直链或支链的c1-10烷基、直链或支链的c1-10烷氧基；

9、条件是，r1、r2、r3、r4中至少一个为

10、r5选自氢，经取代或未取代的直链或支链c1-30烷基，经取代或未取代的直链或支链c2-30烯基，经取代或未取代的直链或支链c2-30炔基，所述烷基、烯基或炔基的1个或1个以上c原子任选被独立地选自o、s和n的杂原子所替换；所述取代的取代基团选自卤素、-oh、直链或支链的c1-10烷基、直链或支链的c1-10烷氧基；

11、r6选自氢，c1-3烷基，c1-3烷氧基，-oh；

12、n选自1～8的整数，m选自0～8的整数，n和m彼此独立，可以相同也可以不同；

13、当r1、r2、r3、r4中至少两个为时，每个所述基团中的n和m彼此独立，可以相同也可以不同。

14、优选，q为其中：x和y可以相同或者不同，独立地选自1～8的整数；r7定义和前述相同；优选，x或y相同或不同，选自1～3的整数，例如为1、2或3；优选，r7为直链或支链c1-4烷基，例如为甲基、乙基、正丙基、正丁基等。

15、在本发明的优选实施方式中，r6为-oh。

16、在本发明的优选实施方式中，n选自4～8的整数，m选自4～8的整数。

17、在本发明的优选实施方式中，所述式i化合物为下式a、b、c或d：

18、a，其中每个n1都彼此独立，可以相同或不同，每个n1选自1～8的整数，每个m1都彼此独立，可以相同或不同，每个m1选自0～8的整数；优选，每个n1选自4～8的整数，每个m1选自4～8的整数；优选，每个n1都彼此相同，每个m1都彼此相同。

19、b，其中每个n2都彼此独立，可以相同或不同，每个n2选自1～8的整数，每个m2都彼此独立，可以相同或不同，每个m2选自0～8的整数；优选，每个n2选自4～8的整数，每个m2选自4～8的整数；优选，每个n2都彼此相同，每个m2都彼此相同。

20、c，其中每个n3都彼此独立，可以相同或不同，每个n3选自1～8的整数，每个m3都彼此独立，可以相同或不同，每个m3选自0～8的整数；优选，每个n3选自4～8的整数，每个m3选自4～8的整数；优选，每个n3都彼此相同，每个m3都彼此相同。

21、d，其中每个n4都彼此独立，可以相同或不同，每个n4选自1～8的整数，每个m4都彼此独立，可以相同或不同，每个m4选自0～8的整数；优选，每个n4选自4～8的整数，每个m4选自4～8的整数；优选，每个n4都彼此相同，每个m4都彼此相同。

22、在本发明的一些具体实施方式中，所述式i化合物选自表1所示的以下化合物：

23、表1

24、

25、

26、

27、

28、

29、

30、

31、

32、

33、

34、根据本发明，所述递送体中进一步包含其他脂质分子，所述其他脂质分子是中性脂质分子、胆固醇类脂质分子和peg化的脂质分子。

35、根据本发明，所述递送体中含有占其总体脂质分子30-60mol％的式i的脂质分子，优选32-55mol％，例如可以为30mol％，31mol％，32mol％，33mol％，34mol％，35mol％，36mol％，37mol％，38mol％，39mol％，40mol％，41mol％，42mol％，43mol％，44mol％，45mol％，46mol％，47mol％，48mol％，49mol％，50mol％，51mol％，52mol％，53mol％，54mol％，55mol％等，进一步优选34-46mol％。

36、根据本发明，所述中性脂质分子是不带电脂质分子或两性离子型脂质分子，例如磷脂酰胆碱类化合物，或/和磷脂酰乙醇胺类化合物。

37、磷脂酰胆碱类化合物的结构如式e所示：e；磷脂酰乙醇胺类化合物的结构如式f所示：f，其中ra、rb、rc、rd独立的选自直链或支链的c1-30烷基，直链或支链的c2-30烯基，优选为直链或支链的c10-30烷基，直链或支链的c10-30烯基，例如ch3(ch2)17ch2-、ch3(ch2)15ch2-、ch3(ch2)13ch2-、ch3(ch2)11ch2-、ch3(ch2)9ch2-、ch3(ch2)7ch2-、ch3(ch2)7-ch＝ch-(ch2)7-、ch3(ch2)4ch＝chch2ch＝ch(ch2)7-、ch3(ch2)7-ch＝ch-(ch2)9-。

38、中性脂质分子的实例包括但不限于5-十七基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、磷酸胆碱(dopc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、磷脂酰胆碱(plpc)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dapc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、卵磷脂酰胆碱(epc)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(dlpc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(mppc)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(pmpc)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(pspc)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dbpc)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(sppc)、1,2-二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(depc)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(popc)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)、溶血磷脂酰乙醇胺以及它们的组合。

39、在一个实施方案中，中性脂质分子可选自由以下组成的组：二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe)。在另一个实施方案中，中性脂质分子可为二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(dmpe)。在另一个实施方案中，中性脂质分子可为二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)。

40、根据本发明，所述递送体中可以含有占其总体脂质分子5-30mol％的中性脂质分子，例如8-20mo l％，例如可以为8mol％，9mol％，10mol％，11mol％，12mol％，13mol％，14mol％，15mol％，16mol％，17mol％，18mol％，19mol％，20mol％，进一步优选9-16mol％。

41、根据本发明，胆固醇类脂质分子是指甾醇以及含有甾醇部分的脂质，包括但不限于胆固醇，5-十七基间苯二酚，粪甾醇，谷甾醇，麦角甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，菜子甾醇，番茄次碱，番茄碱，熊果酸，α-生育酚及其混合物、胆固醇半琥珀酸酯。在一个实施方案中，胆固醇类脂质分子为胆固醇(chol)。在一个实施方案中，胆固醇类脂质分子为胆固醇半琥珀酸酯。

42、根据本发明，所述递送体中可以含有占其总体脂质分子30-50mol％的胆固醇类脂质分子，例如可以为30mol％，31mol％，32mol％，33mol％，34mol％，35mol％，36mol％，37mol％，38mol％，39mol％，40mol％，41mol％，42mol％，43mol％，44mol％，45mol％，46mol％，47mol％，48mol％，49mol％，50mol％等，优选35-50mol％，进一步优选37-49mol％。

43、根据本发明，peg化的脂质分子包含脂质部分和基于peg的聚合物部分。在一些实施方案中，peg化的脂质分子可表示为“脂质部分-peg-数均分子量”或者“peg-脂质部分”或者“peg-数均分子量-脂质部分”，所述脂质部分是二酰基甘油或二酰基甘油酰胺，选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二棕榈酰甘油、二硬脂酰甘油、二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、二棕榈酰甘油酰胺、二硬脂酰甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；peg的数均分子量为约130至约50,000，例如约150至约30,000，约150至约20,000，为约150至约15,000，为约150至约10,000，为约150至约6,000，为约150至约5,000，为约150至约4,000，为约150至约3,000，为约300至约3,000，为约1,000至约3,000，为约1,500至约2,500，例如约2000。

44、在一些实施方案中，peg化的脂质分子可选自peg-二月桂酰甘油、peg-二肉豆蔻酰甘油(peg-dmg)、peg-二棕榈酰甘油、peg-二硬脂酰甘油(peg-dspe)、peg-二月桂基甘油酰胺、peg-二肉豆蔻基甘油酰胺、peg-二棕榈酰甘油酰胺和peg-二硬脂酰甘油酰胺、peg-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、peg-dmb(3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](dmg-peg2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](dspe-peg2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(dsg-peg2000)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(dma-peg2000)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](dsa-peg2000)。在一个实施方案中，peg化的脂质分子可为dmg-peg2000。在一些实施方案中，peg化的脂质分子可为dsg-peg2000。在一个实施方案中，peg化的脂质分子可为dspe-peg2000。在一个实施方案中，peg化的脂质分子可为dma-peg2000。在一个实施方案中，peg化的脂质分子可为c-dma-peg2000。在一个实施方案中，peg化的脂质分子可为dsa-peg2000。在一个实施方案中，peg化的脂质分子可为peg2000-c11。在一些实施方案中，peg化的脂质分子可为peg2000-c14。在一些实施方案中，peg化的脂质分子可为peg2000-c16。在一些实施方案中，peg化的脂质分子可为peg2000-c18。

45、根据本发明，所述递送体中可以含有占其总体脂质分子0.4-10mol％的peg化的脂质分子，例如0.5-5mol％，例如可以为0.4mol％，0.5mol％，0.6mol％，0.7mol％，0.8mol％，0.9mol％，1.0mol％，1.1mol％，1.2mol％，1.3mol％，1.4mol％，1.5mol％，1.6mol％，1.7mol％，1.8mol％，1.9mol％，2.0mol％，2.1mol％，2.2mol％，2.3mol％，2.4mol％，2.5mol％，2.6mol％，2.7mol％，2.8mol％，2.9mol％，3.0mol％，3.1mol％，3.2mol％，3.3mol％，3.4mol％，3.5mol％，3.6mol％，3.7mol％，3.8mol％，3.9mol％，4.0mol％，4.1mol％，4.2mol％，4.3mol％，4.4mol％，4.5mol％，4.6mol％，4.7mol％，4.8mol％，4.9mol％，5.0mol％等，进一步优选1.3-2.7mol％。

46、在本发明的一些实施方式中，所述递送体的脂质由式i的脂质分子、中性脂质分子、胆固醇类脂质分子和peg化的脂质分子组成。

47、根据本发明，所述递送系统或组合物中，递送体中的脂质分子的总质量与crispr/cas9用试剂的质量之比为(5-20):1。

48、根据本发明，所述crispr/cas9用试剂包含编码cas9蛋白的dna或mrna，识别靶位点的crrna，tracrrna，和/或，识别靶位点的sgrna。

49、在本发明的一些实施方式中，所述crispr/cas9用试剂包含编码cas9蛋白的mrna和识别靶位点的sgrna，其中mrna与sgrna的摩尔比为1:(1-10)。

50、在本发明的一个实施方式中，所述编码cas9蛋白的mrna包含编码cas9蛋白的orf，所述orf具有与seq id no:1所示核苷酸序列至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或约100％同源性的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述orf的序列如seq id no:1所示。

51、seq id no:1(ha-cas9 mrna的orf序列)：auggcccccaagaagaagcggaaggugggcauccacggcgugcccgccgccgacaagaaguacagcaucggccuggacaucggcaccaacagcgugggcugggccgugaucaccgacgaguacaaggugcccagcaagaaguucaaggugcugggcaacaccgaccggcacagcaucaagaagaaccugaucggcgcccugcuguucgacagcggcgagaccgccgaggccacccggcugaagcggaccgcccggcggcgguacacccggcggaagaaccggaucugcuaccugcaggagaucuucagcaacgagauggccaagguggacgacagcuucuuccaccggcuggaggagagcuuccugguggaggaggacaagaagcacgagcggcaccccaucuucggcaacaucguggacgagguggccuaccacgagaaguaccccaccaucuaccaccugcggaagaagcugguggacagcaccgacaaggccgaccugcggcugaucuaccuggcccuggcccacaugaucaaguuccggggccacuuccugaucgagggcgaccugaaccccgacaacagcgacguggacaagcuguucauccagcuggugcagaccuacaaccagcuguucgaggagaaccccaucaacgccagcggcguggacgccaaggccauccugagcgcccggcugagcaagagccggcggcuggagaaccugaucgcccagcugcccggcgagaagaagaacggccuguucggcaaccugaucgcccugagccugggccugacccccaacuucaagagcaacuucgaccuggccgaggacgccaagcugcagcugagcaaggacaccuacgacgacgaccuggacaaccugcuggcccagaucggcgaccaguacgccgaccuguuccuggccgccaagaaccugagcgacgccauccugcugagcgacauccugcgggugaacaccgagaucaccaaggccccccugagcgccagcaugaucaagcgguacgacgagcaccaccaggaccugacccugcugaaggcccuggugcggcagcagcugcccgagaaguacaaggagaucuucuucgaccagagcaagaacggcuacgccggcuacaucgacggcggcgccagccaggaggaguucuacaaguucaucaagcccauccuggagaagauggacggcaccgaggagcugcuggugaagcugaaccgggaggaccugcugcggaagcagcggaccuucgacaacggcagcaucccccaccagauccaccugggcgagcugcacgccauccugcggcggcaggaggacuucuaccccuuccugaaggacaaccgggagaagaucgagaagauccugaccuuccggauccccuacuacgugggcccccuggcccggggcaacagccgguucgccuggaugacccggaagagcgaggagaccaucacccccuggaacuucgaggaggugguggacaagggcgccagcgcccagagcuucaucgagcggaugaccaacuucgacaagaaccugcccaacgagaaggugcugcccaagcacagccugcuguacgaguacuucaccguguacaacgagcugaccaaggugaaguacgugaccgagggcaugcggaagcccgccuuccugagcggcgagcagaagaaggccaucguggaccugcuguucaagaccaaccggaaggugaccgugaagcagcugaaggaggacuacuucaagaagaucgagugcuucgacagcguggagaucagcggcguggaggaccgguucaacgccagccugggcaccuaccacgaccugcugaagaucaucaaggacaaggacuuccuggacaacgaggagaacgaggacauccuggaggacaucgugcugacccugacccuguucgaggaccgggagaugaucgaggagcggcugaagaccuacgcccaccuguucgacgacaaggugaugaagcagcugaagcggcggcgguacaccggcuggggccggcugagccggaagcugaucaacggcauccgggacaagcagagcggcaagaccauccuggacuuccugaagagcgacggcuucgccaaccggaacuucaugcagcugauccacgacgacagccugaccuucaaggaggacauccagaaggcccaggugagcggccagggcgacagccugcacgagcacaucgccaaccuggccggcagccccgccaucaagaagggcauccugcagaccgugaaggugguggacgagcuggugaaggugaugggccggcacaagcccgagaacaucgugaucgagauggcccgggagaaccagaccacccagaagggccagaagaacagccgggagcggaugaagcggaucgaggagggcaucaaggagcugggcagccagauccugaaggagcaccccguggagaacacccagcugcagaacgagaagcuguaccuguacuaccugcagaacggccgggacauguacguggaccaggagcuggacaucaaccggcugagcgacuacgacguggaccacaucgugccccagagcuuccugaaggacgacagcaucgacaacaaggugcugacccggagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgugcccagcgaggagguggugaagaagaugaagaacuacuggcggcagcugcugaacgccaagcugaucacccagcggaaguucgacaaccugaccaaggccgagcggggcggccugagcgagcuggacaaggccggcuucaucaagcggcagcugguggagacccggcagaucaccaagcacguggcccagauccuggacagccggaugaacaccaaguacgacgagaacgacaagcugauccgggaggugaaggugaucacccugaagagcaagcuggugagcgacuuccggaaggacuuccaguucuacaaggugcgggagaucaacaacuaccaccacgcccacgacgccuaccugaacgccguggugggcaccgcccugaucaagaaguaccccaagcuggagagcgaguucguguacggcgacuacaagguguacgacgugcggaagaugaucgccaagagcgagcaggagaucggcaaggccaccgccaaguacuucuucuacagcaacaucaugaacuucuucaagaccgagaucacccuggccaacggcgagauccggaagcggccccugaucgagaccaacggcgagaccggcgagaucgugugggacaagggccgggacuucgccaccgugcggaaggugcugagcaugccccaggugaacaucgugaagaagaccgaggugcagaccggcggcuucagcaaggagagcauccugcccaagcggaacagcgacaagcugaucgcccggaagaaggacugggaccccaagaaguacggcggcuucgacagccccaccguggccuacagcgugcuggugguggccaagguggagaagggcaagagcaagaagcugaagagcgugaaggagcugcugggcaucaccaucauggagcggagcagcuucgagaagaaccccaucgacuuccuggaggccaagggcuacaaggaggugaagaaggaccugaucaucaagcugcccaaguacagccuguucgagcuggagaacggccggaagcggaugcuggccagcgccggcgagcugcagaagggcaacgagcuggcccugcccagcaaguacgugaacuuccuguaccuggccagccacuacgagaagcugaagggcagccccgaggacaacgagcagaagcagcuguucguggagcagcacaagcacuaccuggacgagaucaucgagcagaucagcgaguucagcaagcgggugauccuggccgacgccaaccuggacaaggugcugagcgccuacaacaagcaccgggacaagcccauccgggagcaggccgagaacaucauccaccuguucacccugaccaaccugggcgcccccgccgccuucaaguacuucgacaccaccaucgaccggaagcgguacaccagcaccaaggaggugcuggacgccacccugauccaccagagcaucaccggccuguacgagacccggaucgaccugagccagcugggcggcgacagcggcggcaagcggcccgccgccaccaagaaggccggccaggccaagaagaagaagggcagcuaccccuacgacgugcccgacuacgccuga

52、在本发明的一个实施方式中，所述sgrna是识别egfp的sgrna，其序列如seq idno:2所示。

53、seq id no:2(sgegfp序列)：gtgaaccgcatcgagctgaaagg。

54、根据本发明，所述递送体上还可修饰上靶向分子，使其成为靶向剂而能靶向特定细胞、组织或器官。靶向分子可位于递送体中或可仅位于其表面上。靶向分子可为蛋白质、肽、糖蛋白、脂质、小分子、核酸等，其实例包括(但不限于)抗体、抗体片段、低密度脂蛋白(ldl)、转铁蛋白(transferrin)、脱唾液酸糖蛋白(asialycoprotein)、受体配体、唾液酸、适体等。

55、根据本发明，所述递送系统或组合物中可以进一步含有一种或一种以上的医药赋形剂。术语“医药赋形剂”的意思是任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂等，包括但不限于糖，诸如乳糖、海藻糖、葡萄糖和蔗糖；纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；醇，诸如丙二醇、乙醇等；缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液；抗氧化剂等。

56、在本发明的一个实施方式中，所述递送体是脂质纳米颗粒。所述脂质纳米颗粒的直径在1nm到1000nm范围内，例如，在20nm到800nm范围内，或者在50nm到500nm范围内，或者在80nm到200nm范围内，或者在1nm到100nm范围内，或者在1nm到10nm范围内。所述脂质纳米颗粒可使用所属领域中已知的任何方法来制备。这些方法包括(但不限于)喷雾干燥、单一和双重乳液溶剂蒸发、溶剂萃取、相分离、纳米沉淀、微流控、简单和复杂凝聚以及所属领域的普通技术人员熟知的其它方法。

57、在本发明的一些实施方式中，制备所述crispr/cas9技术用试剂的递送系统或组合物的方法包括：1)制备含有式i化合物、中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、peg化的脂质分子的有机相；2)制备含有crispr/cas9技术用试剂的水相；3)将有机相和水相进行混合，制备脂质纳米颗粒混悬液。所述步骤1)中，优选，使用无水乙醇或乙醇的水溶液作为溶剂。所述步骤2)中，优选使用水作为溶剂。所述步骤3)中，优选有机相和水相的体积比为1:2～4。

58、一种在体外进行基因编辑的方法，其使用式i所述的化合物作为crispr/cas9技术用试剂的递送脂质。在本发明的一些实施方式中，体外进行基因编辑的方法，其使用本发明前文所述的递送系统或组合物。

59、本发明的可电离脂质化合物可以采用本领域已有的方法进行合成，例如，使一当量或一当量以上的胺与一当量或一当量以上的环氧基封端化合物在合适的条件下反应形成。可电离脂质化合物的合成是在有或无溶剂的情况下进行，并且所述合成可在25-100℃范围内的较高温度下进行。可任选纯化制得的可电离脂质化合物。举例来说，可纯化可电离脂质化合物的混合物，得到特定的可电离脂质化合物。或可纯化混合物，得到特定立体异构体或区域异构体。所述环氧化物可以商业购买，或者合成制备。

60、在本发明的一些实施方式中，本发明的可电离脂质化合物可以采用如下的一般制备方法进行制备。

61、

62、式a、b、c或d

63、步骤1：还原

64、在还原剂的存在下，将化合物a1的羧基还原成羟基以获得化合物a2。还原剂的实例包括但不限于氢化铝锂、二异丁基氢化铝等。反应所用溶剂的实例包括但不限于醚类(如乙醚、四氢呋喃和二氧六环等)，卤代烃(如氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷等)，烃类(如正戊烷、正己烷、苯和甲苯等)，及这些溶剂的两种或以上形成的混合溶剂。

65、步骤2：氧化

66、在氧化剂的存在下，将化合物a2的羟基氧化成醛基以获得化合物a3。氧化剂的实例包括但不限于2-碘酰基苯甲酸(ibx)、氯铬酸吡啶(pcc)、二氯铬酸吡啶盐(pdc)、戴斯-马丁氧化剂、二氧化锰等。反应所用溶剂的实例包括但不限于卤代烃(如氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷等)，烃类(如正戊烷、正己烷、苯和甲苯等)，腈类(例如乙腈等)，及这些溶剂的两种或以上形成的混合溶剂。

67、步骤3：卤代-还原

68、首先在酸性条件下，将化合物a3的醛α-氢与卤代试剂发生卤代反应以获得α-卤代醛中间体，然后在还原剂存在下，将α-卤代醛的醛基还原成羟基以获得化合物a4。提供酸性条件的实例包括但不限于dl-脯氨酸。卤代试剂的实例包括但不限于n-氯代丁二酰亚胺(ncs)和n-溴代丁二酰亚胺(nbs)。还原剂的实例包括但不限于硼氢化钠、氰基硼氢化钠和三乙酰氧基硼氢化钠。

69、步骤4：环氧化

70、将化合物a4在碱的存在下进行分子内的亲核取代反应以获得环氧化合物a5。碱的实例包括但不限于碱金属的氢氧化物或氢化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾和氢化钠。反应所用溶剂的实例包括但不限于二氧六环和水的混合物。

71、步骤5：开环反应

72、使化合物a5与胺(例如n,n-二(2-氨基乙基)甲胺)发生开环反应以获得最终化合物。反应用溶剂的实例包括但不限于乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷、己烷、甲苯、乙醚等。

73、所述制备方法中的原料a1可以商购也可以采用常规方法合成。

74、本发明的可电离脂质分子结构中含有两个相邻的顺式双键，使其在后续应用于递送系统包裹活性物质时，具有较高的包封率，较好的细胞转染率；此外，在制备脂质纳米颗粒时，得到的脂质纳米颗粒粒径更均匀。本发明的可电离脂质化合物尤其适合于制备实心结构的纳米颗粒。

75、如本文中所使用，术语“烷基”是指从含有1到30个碳原子的烃部分通过去除单个氢原子得到的饱和烃基。烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基和正十二烷基。

76、术语“烯基”表示从具有至少一个碳-碳双键的烃部分通过去除单个氢原子得到的单价基团。烯基包括例如例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。

77、术语“炔基”是指从具有至少一个碳-碳三键的烃通过去除单个氢原子得到的单价基团。代表性炔基包括乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等。

78、术语“烷氧基”是指如前文所定义的烷基通过氧原子连接于母体分子。烷氧基的实例包括(但不限于)甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、新戊氧基和正己氧基。

79、术语“卤基”和“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。

80、术语“经取代”(无论前面是否存在术语“任选地”)和“取代基”是指将一个官能团变为另一个官能团的能力，条件是维持所有原子的价数。当任何特定结构中的一个以上位置可经一个以上选自指定群组的取代基取代时，所述取代基可在每一位置相同或不同。

81、在本发明中，“cas9-ha”和“ha-cas9”含义相同。