一种具有定向排列纤维微结构的高强度互穿网络水凝胶血管的制备方法

1.本发明涉及一种具有定向排列纤维微结构的高强度互穿网络水凝胶血管的制备方法，属于医用材料的制备技术领域。


背景技术：

2.生物高分子水凝胶材料作为一种由三维交联网络和大量水(50-90％)组成的软性材料，已广泛应用于药物递送系统、高吸水性材料、组织工程和隐形眼镜等领域。其规则的三维网状结构能够模拟软组织，有利于细胞的三维生长，优良的生物相容性能够保证植入体内后的安全性，这些优点使其水凝胶在组织工程领域研究广泛，例如可注射型修复水凝胶、水凝胶敷贴、促进神经修复水凝胶等等。但是对于许多需要承受较大压力或张力的组织，例如软骨、肌腱、血管等，开发出仿生的水凝胶仍是较大的挑战。主要原因是用于制备水凝胶的生物源性材料(如明胶、海藻酸钠等)都是水溶性短链高分子，缺乏生物组织中大量存在的长链结构，而且合成的水凝胶内部缺少能量耗散机制，导致其韧性差，缺乏可拉伸性和可恢复性；另一方面，水凝胶高分子之间形成的共价键相对较少，交联不够充分，导致合成的生物水凝胶强度远低于生物组织。
3.血管之所以具有优异的力学性能，包括力学强度、弹性和顺应性等，与其成分和微结构密切相关。血管的力学强度主要由中层的弹性纤维、胶原纤维提供，弹性纤维和胶原纤维都形成卷曲的网络结构，当受到较大的拉力或者压力扩张到一定程度后，胶原纤维才会伸展到原有长度产生张力以对抗血管的进一步扩张。其中弹性纤维弹性模量较小，没有明显应力松弛效应，接近完全弹性体；而胶原纤维弹性模量要大很多，是抗张能力的主要提供者，存在应力松弛现象。总的来说，弹性纤维使得血管弹性和顺应性较好，胶原纤维使血管具有韧性，防止过分扩张，两者性能互补使得血管力学性能优异。
4.血管的这些性质，与互穿网络(interpenetrating polymer network,ipn)水凝胶很相似。ipn水凝胶由两种或以上不同性质的聚合物各自交联后所得的网络连续地相互穿插而成的，各个网络互相贯穿且彼此之间没有化学交联。在拉伸时，其中一个网络先断裂耗散能量，使得第二网络保持弹性。这种刚柔并济的结构使得ipn水凝胶在强度和韧性之间实现平衡并改善力学性能。传统ipn水凝胶通常采用多步自由基聚合的方式合成，整个过程较为繁琐费时，且制备过程中使用或产生的强电解质、交联剂、自由基等限制了其在生物医学方面的应用。
5.本发明联用温敏性水凝胶和光固化水凝胶，通过3d打印的方式快速制备互穿网络水凝胶血管，随后对血管进行限制性风干处理，使其内部形成微米尺度纤维结构，力学强度得到显著增强。


技术实现要素：

6.(一)要解决的技术问题
7.为了解决现有技术制备的生物源性水凝胶血管强度、韧性不足的问题，本发明提供一种具有定向排列纤维微结构的高强度互穿网络水凝胶血管的制备方法。
8.(二)技术方案
9.为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
10.一种具有定向排列纤维微结构的高强度互穿网络水凝胶血管的制备方法，其包括如下步骤：
11.(1)制备互穿网络水凝胶：利用温敏性水凝胶和光固化水凝胶，制备高强度互穿网络的管状水凝胶；
12.(2)定向排列纤维结构的生成：利用水凝胶血管在限制性风干过程中在特定方向产生的应力，使其自发形成具有分层级的定向排列纤维结构；具体包括
①
将管状水凝胶采用限制性风干的夹具和硅胶管，使管状水凝胶内部在轴向和环向都能够产生应力；
②
自然条件下进行风干处理。
13.如上所述的制备方法，优选地，在步骤(1)中，所述温敏性水凝胶为低熔点琼脂糖，光固化水凝胶为甲基丙烯酰化甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacryloyl，gelma)和聚乙二醇二丙烯酸酯(poly(ethylene glycol)diacrylate，pegda)。
14.如上所述的制备方法，优选地，所述甲基丙烯酰化明胶的制备方法是向含有a型明胶的dpbs缓冲液中加入甲基丙烯酸酐，反应后，结束反应，截留分子量为大于10kda，冻干后即为甲基丙烯酰化明胶。
15.进一步地，反应过程中a型明胶浓度为10％(w/v)，并在不断搅拌的过程中向其中以每分钟0.5ml的速度滴入甲基丙烯酸酐，滴入量为dpbs缓冲液溶液量的1.4％，反应温度为50℃，如此可得到中等甲基丙烯酸化度(约50％)的gelma。
16.如上所述的制备方法，优选地，所述聚乙二醇二丙烯酸酯的制备方法为向溶于二氯甲烷的peg溶液中逐滴加入三乙胺，充分搅拌后再逐滴加入甲基丙烯酸酐，避光搅拌反应后，透析、干燥后获得聚乙二醇二丙烯酸酯。
17.如上所述的制备方法，优选地，peg分子量为700～10000，peg溶液的浓度为25％-30％(按w/v为g/ml)，三乙胺的加入量为peg溶液体积的1.4％-1.6％，甲基丙烯酸酐的加入量为peg溶液体积的2.5％-3％。
18.如上所述的制备方法，优选地，在步骤(1)中，制备高强度互穿网络的管状水凝胶的方法为用温敏性水凝胶和光固化水凝胶配制生物水凝胶溶液，采用3d打印或者模具灌注的方法，通过控制温度变化和蓝光照射实现管状水凝胶的制备。
19.如上所述的制备方法，优选地，配制生物水凝胶溶液的方法为将琼脂糖与gelma和pegda以质量比2:10:5，在65℃的条件下溶于水，得到质量分数为15～19％的生物墨水，随后按照0.3％～0.6％(按w/v为g/ml)比例加入苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂，避光继续搅拌至完全溶解，获得生物水凝胶溶液。
20.如上所述的制备方法，优选地，3d打印先在金属轴棒表面均匀地打印一层f127水凝胶，再用生物水凝胶溶液打印，之后静置待琼脂糖完全凝胶化后，用蓝光照射生物水凝胶，后置于4℃中至f127水凝胶层完全液化，取下管状水凝胶。
21.本发明中所采用的f127水凝胶，置于4℃以下低温能液化，高于4℃固化，利用此特点将其作为水凝胶管和轴棒之间的衬垫，低温液化后方便取下，否侧水凝胶固化后会收缩，
紧紧贴在轴棒上无法取下，所以优选先在金属轴棒表面均匀地打印一层f127水凝胶。如上所述的制备方法，优选地，所述打印厚度在1.5mm以上，打印厚度可通过调整轴棒转速、打印压力、针头规格等指标来调整。
22.如上所述的制备方法，优选地，在步骤(2)中，所述限制性风干的夹具为亚克力框架和套设于亚克力框架上并可调节位置的亚克力夹具(或塑料、金属框架与夹具均可)，亚克力夹具的中间夹住硅胶管，管状水凝胶套在硅胶管上使管状水凝胶的内径和长度被限制改变。
23.如上所述的制备方法，优选地，所述风干处理是指在气温25℃，湿度40％～60％的条件下自然风干，之后放入pbs缓冲液中自然复水。
24.如上所述的制备方法，优选地，所述自然风干的时间为24h～48h，根据水凝胶管的厚度调整，自然复水时间为2h。
25.由上述制备方法获得具有定向排列纤维微结构的高强度互穿网络水凝胶血管，具有较好的弹性模量等力学强度。
26.(三)有益效果
27.本发明的有益效果是：
28.本发明提供的具有定向排列纤维微结构的高强度互穿网络水凝胶血管的制备方法，首先利用3d打印技术快速制备ipn水凝胶管，随后使用自制夹具对管状水凝胶进行限制性风干处理，在失水的过程中，水凝胶内部在特定方向会产生应力，高分子聚合物在应力作用下逐渐形成分层级的定向排列纤维结构，这一结构在水凝胶复水之后依然能够保持，极大提高了血管的强度。测试数据表明，相比于未经过限制性风干处理的水凝胶，处理后的水凝胶血管弹性模量可提升约2倍(259.4
±
16.3kpa提升至513.7
±
35.7kpa)，断裂极限应力可提升6倍以上(90.0
±
13.1kpa提升至595.0
±
40.0kpa)，极限爆破压力提升2.5倍以上(146.83
±
32.2mmhg提升至371.64
±
46.8mmhg)。
29.本发明提供的制备方法，简便易行，选用生物源性水凝胶，利用3d打印技术制备，打印过程与互穿网络形成过程同时进行；在水凝胶内部自发形成的纤维结构增强了其在特定方向的强度。本发明的方法，除制备血管外，还可用于制备各种需要较大力学强度的生物组织，例如肌肉、韧带等，以进行体内或体外的研究。
附图说明
30.图1为水凝胶血管的生物3d打印过程的示意图；
31.图2为水凝胶血管的限制性风干处理示意图；
32.图3为水凝胶血管的轴向和横截面扫描电镜结果。
33.【附图标记说明】
34.1：f127水凝胶；
35.2：金属轴棒；
36.3：生物水凝胶；
37.4：管状水凝胶；
38.5：可调亚克力夹具；
39.6：硅胶管；
40.7：亚克力框架；
41.8：无序排列的水凝胶内部纤维；
42.9：限制性风干处理后定向排列的水凝胶纤维；
43.10：限制性风干处理后的水凝胶血管。
具体实施方式
44.本发明针对水凝胶血管强度、韧性不足的难题，通过优化水凝胶成分和各组分的比例，快速、温和制备ipn水凝胶血管。随后对水凝胶血管进行限制性风干处理，使其内部形成定向排列的纤维结构，以增强血管的力学特性。
45.本发明中创新地采取了一种新型的一步法ipn水凝胶制备方式，以琼脂糖凝胶为第一网络，gelma和pegda为第二网络，通过利用琼脂糖水凝胶的温度响应特性和gelma/pegda的光致聚合特性，快速制备高强度ipn水凝胶血管。
46.其次，血管内平滑肌和纤维呈现分层级的有序排列，使得血管拥有强韧的机械性能。类似结构的生物组织还包括肌腱和韧带等。熔喷、静电纺丝等技术在制备高分子材料时可以实现纤维的取向排列，而常规水凝胶材料的纤维排列方式往往杂乱无章，想要实现各向异性实现仍是挑战。在本发明中我们受到人体组织形态发生阶段，生物聚合物例如胶原蛋白相互聚合，最终形成具有层级定向排列结构的致密组织这一过程启发。研究发现对水凝胶血管进行限制性风干处理，在失水的过程中，水凝胶血管被固定，长度和内径不会缩小，因此在特定方向会产生应力，高分子聚合物会沿着应力方向通过超分子相互作用力逐渐形成分层级的定向排列纤维结构，这一结构在水凝胶复水之后依然能够保持，极大提高了水凝胶血管的强度。
47.具体的，本发明提供了一种具有定向排列纤维微结构的高强度互穿网络水凝胶血管，其包括如下步骤：(1)通过利用具有温度相变特性的温敏性水凝胶的(例如本实例中的琼脂糖)和另一种具有光致聚合特性的光固化水凝胶(例如本实例中的gelma/pegda)，快速制备高强度互穿网络的管状水凝胶；(2)定向排列纤维结构的生成：具体是利用水凝胶血管在限制性风干过程中在特定方向产生的应力，使其自发形成具有分层级的定向排列纤维结构，具体包括
①
将高强度互穿网络水凝胶血管用管状水凝胶限制性风干的夹具和硅胶管，使其在轴向和环向都能够产生应力；
②
自然条件下进行风干处理。
48.为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。下面实施例中试剂均可采用市售产品。
49.实施例1
50.一种具有定向排列纤维微结构的高强度互穿网络水凝胶血管的制备方法，其包括如下步骤：
51.(1)制备互穿网络水凝胶：利用温敏性水凝胶和光固化水凝胶，制备高强度互穿网络的管状水凝胶；
52.具体的，光固化水凝胶的制备：
53.s1、gelma和pegda制备
54.10g a型明胶(本实施例中选用冻力300bloom的明胶)加入100ml dpbs缓冲液(其含0.01mol/l磷酸根，0.8％氯化钠，0.0002％氯化钾，不含钙镁离子)中，60℃水浴锅中充分
搅拌至完全溶解。随后温度调整至50℃，取1.4ml甲基丙烯酸酐一滴滴缓慢加入不断搅拌的明胶溶液中，反应4h。随后加入4倍体积的40℃预热dpbs稀释结束反应。随后使用截留分子量为10kda的透析袋在40℃去离子水中透析7d。使用0.22μm的真空无菌过滤器进行抽滤除菌，-80℃冷冻干燥，获得gelma，-80℃保存待用。
55.pegda制备：5g peg(分子量为4000)溶解于15ml二氯甲烷之中，逐滴加入0.25ml三乙胺，充分搅拌至完全溶解后逐滴加入0.44ml甲基丙烯酸酐，室温下避光搅拌反应4d。随后使用0.22μm滤器过滤，真空干燥过夜。随后使用截留分子量为1000的透析袋透析48h，冷冻干燥后获得pegda，于-80℃保存。
56.s2、生物水凝胶溶液配制：称取200mg琼脂糖、1000mg gelma、500mg pegda加入去离子水中，定容至10ml，65℃水浴锅中充分搅拌溶解，得到质量分数为17％(w/v)的生物墨水。随后加入50mg苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基磷酸锂(lithium phenyl-2，4，6-trimethyl-benzoyl phosphinate，lap)引发剂，避光继续搅拌至完全溶解，获得生物水凝胶溶液。其中，生物墨水可在4℃避光条件下保存一周，使用前避光水浴恢复至65℃即可。
57.s3、水凝胶血管的3d生物打印：使用挤出式3d打印机配合滚轴套件，构建可控滚轴打印系统进行管状水凝胶的制备。具体如图1所示，首先使用33％浓度(w/v，g/ml，水溶液)的f127(泊洛沙姆)水凝胶1在金属轴棒2表面均匀地打印一层温敏层，厚度在0.5mm以内，随后控制装有上述制备的生物水凝胶3溶液针筒开始打印。打印完成后首先在20℃环境下静置20min，待生物水凝胶中的琼脂糖成分完全固化，随后使用波长为405nm的蓝光手电筒照射水凝胶不少于20s。待水凝胶交联完成，将不锈钢棒取下放入4℃冰箱中5min，此时f127水凝胶层完全液化，管状水凝胶4与金属轴棒之间产生空隙，便可轻松将水凝胶血管从不锈钢棒上取下。
58.其中，打印厚度可通过调整轴棒转速、打印压力、针头规格等指标来调整。在本实施例的制备过程中，打印压力为1.5bar，轴棒转速为1r/s，针头选用27g规格，可得到1.5mm厚度的水凝胶管。
59.(2)水凝胶血管的限制性风干处理：
60.如图2，准备一根外径为3mm，长度为6cm的硅胶管6，将上述s3中制备的管状水凝胶4血管套在硅胶管6的外面。随后将血管两端约5mm长的部分使用附图2中所示的包括可调亚克力夹具5和亚克力框架7构成的设备夹住，保持夹具的位置不变。此时管状水凝胶4内部为无序排列的水凝胶内部纤维8。
61.设备是包括可调亚克力夹具5套设于亚克力框架7外，可调亚克力夹具5设有两个，可调节在亚克力框架7内的位置，且其中间可夹持住硅胶管。将设备放置在气温25℃，湿度40％-60％的条件下自然风干。48h后将血管从硅胶管上取下，此时管状水凝胶4内部为定向排列的水凝胶纤维9，获得限制性风干处理后的水凝胶血管10；将两端被夹持部分剪掉丢弃，中间部分放入pbs缓冲液中自然复水2h，即可得到限制性风干水凝胶血管。水凝胶血管内部纤维排列方式可以通过扫面电镜进行观察，本实施例中水凝胶血管的轴向和横截面扫描电镜结果见图3，图中左侧为不同标尺线的照片，右侧为左图中方框内的放大图。该结果图说明该方法制备的水凝胶内部纤维实现了定向排列，其中上半部两张图为沿着水凝胶血管长轴方向的截面，下半部两图为垂直长轴方向的横截面。
62.水凝胶血管的力学指标通过力学拉伸仪进行测定，分别测试了经过限制性风干处
理的ipn水凝胶血管即按上述方法制备(记为a组)、未经过处理的ipn水凝胶血管即按上述方法但未进行步骤(2)处理(记为b组)，和目前最常见的由单纯gelma组分即按上述方法但步骤(2)中不加琼脂糖和pegda进行(gelma的浓度为17％，w/v)制备的水凝胶血管(c组)，每组设置了6个平行样本，拉伸方法为以2mm/s的速度匀速拉伸至断裂，测定项目包括弹性模量、断裂极限应力和极限爆破压力。测定的结果用平均值
±
标准差表示，a组结果：弹性模量为513.7
±
35.7kpa，断裂极限应力595.0
±
40.0kpa,极限爆破压力371.64
±
46.8mmhg。
63.相比于b组血管，a组血管弹性模量可提升约2倍(259.4
±
16.3kpa提升至513.7
±
35.7kpa)，断裂极限应力可提升6倍以上(90.0
±
13.1kpa提升至595.0
±
40.0kpa)，极限爆破压力提升2.5倍以上(146.83
±
32.2mmhg提升至371.64
±
46.8mmhg)。相比于c组血管则提升更多，弹性模量提升了约3.2倍(160.4
±
14.6kpa提升至513.7
±
35.7kpa)，断裂极限应力可提升15.7倍以上(37.8
±
6.9kpa提升至595.0
±
40.0kpa)，极限爆破压力提升2.9倍以上(124.83
±
24.9mmhg提升至371.64
±
46.8mmhg)。可见，本发明方法中制备的ipn结构水凝胶相比单组分水凝胶强度有提升，限制性风干的方式则进一步提升力血管的力学性能。
64.目前尚未见有报道采用本发明中的流程制备水凝胶血管，现有的水凝胶血管制备技术包括模型灌注，挤出式3d打印或者光固化3d打印等，得到的水凝胶血管强度往往很低，需要后期进行长时间的体外培养以增强其力学性能，本实施例目的在于快速获取高强度的水凝胶血管，在部分对时效性要求较高的使用场景具有实际意义。
65.本发明可以扩展到其它类型的线性生物高分子，例如使用海藻酸盐、纤维素、壳聚糖等，这些高分子多含有丰富的氢键结合位点，有利于风干过程中纤维结构的形成。这些高分子材料使用本发明中的限制性风干方式进行处理，也可以使其内部产生定向排列纤维结构，力学性能得到增强。
66.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。