Metrnl(Meteorin-like)凝胶促进皮肤伤口愈合

本发明涉及生物医学领域，具体涉及metrnl基因和该基因多肽在制备促进组织修复中的应用。

背景技术：

1、皮肤是人类身体最大的器官，是抵御病原体入侵的第一道屏障。皮肤伤口愈合是皮肤组织遭受损伤后，为降低感染和进一步受伤的风险的再生修复过程。

2、而糖尿病皮肤创口是糖尿病患者的严重并发症之一，是由于糖尿病患者由于体内糖代谢紊乱，当皮肤出现创口时无法正常自愈，甚至不愈合。目前研究表明，糖尿病状态下角质细胞和血管内皮细胞功能抑制，导致角质细胞增殖和迁移减慢，创口重建减缓；抑制血管内皮细胞会导致血管生成减少，创口处供血供氧减少，导致糖尿病皮肤创口难以愈合。而目前临床治疗中主要以清创和控制感染为主，无法有效恢复角质细胞和血管内皮细胞的功能，治疗效果较差。

技术实现思路

1、本发明具体内容如下：

2、发明的第一方面提供：

3、i)编码metrnl蛋白的核酸序列；或

4、ii)编码i)中限定的核酸序列的互补序列；或

5、iii)包含如i)或ii)中限定的核酸序列的载体；或

6、iv)分离的宿主细胞的组合物，其表达i)或ii)所述核酸序列，或为iii)所述载体转化或传导；

7、在制备治疗皮肤损伤或促进皮肤损伤愈合药物中的应用。

8、进一步优选的，其中皮肤损伤为选自放射性溃疡、压创、小腿的慢性溃疡、缺损的深度超过皮肤全层且面积较大的创面如烧伤，车祸伤，撕脱伤，或静脉输液不慎导致药物渗漏到血管外等所致创伤以及糖尿病皮肤创口等难治性创面(refractory wound)。

9、进一步优选的，其中所述难治性皮肤损伤为糖尿病皮肤创口，更进一步优选的所述糖尿病为1型或2型。

10、在本发明的某些实施例中，其中所述核酸分子编码与序列np_001004431.1、np_659046.1、np_001014126、或seq no 1-6任一有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的序列，所述核酸分子任选的在3’端或5’端修饰有用于增强表达或纯化的片段。

11、在本发明某些实施例中，所述药物为贴剂、软膏、喷雾剂等经皮给药制剂。

12、本发明第二方面提供一种核酸药物，其含有编码metrnl蛋白的核酸分子和用于经皮给药的辅料。

13、进一步优选的，所述的核酸药物中，所述核酸分子编码与序列np_001004431.1、np_659046.1、np_001014126、或seq no 1-6任一至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的序列，所述核酸分子任选的在3’端或5’端修饰有用于增强表达或纯化的片段。

14、进一步优选的，所述的核酸药物为贴剂、软膏、喷雾剂等经皮给药制剂。

15、本发明第三方面提供metrnl蛋白在制备治疗皮肤损伤中药物的应用。

16、进一步优选的，其中皮肤损伤为选自放射性溃疡、压创、小腿的慢性溃疡、缺损的深度超过皮肤全层且面积较大的创面以及糖尿病皮肤创口等难治性创面(refractorywound)。

17、进一步优选的，其中所述难治性皮肤损伤为糖尿病皮肤创口，更进一步优选的所述糖尿病为1型或2型。

18、进一步优选的，其中所述metrnl蛋白具有与序列np_001004431.1、np_659046.1、np_001014126、或seq no 1-6任一至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的序列。

19、进一步优选的，所述药物具有合适皮肤递送的载体。

20、本发明第四方面提供一种药物，其含有metrnl蛋白和用于经皮给药的辅料。

21、进一步优选的，其中metrnl蛋白具有与序列np_001004431.1、np_659046.1、np_001014126、或seq no 1-6任一至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的序列。

22、进一步优选的，所述的药物为贴剂、软膏、喷雾剂等经皮给药制剂。

23、进一步优选的，所述制剂中的储药材料其为水凝胶形态，包括由天然的亲水性高分子包括多糖类(淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸，壳聚糖等)和多肽类(胶原、聚l-赖氨酸、聚l-谷胺酸等)形成的水凝胶；或者由合成的亲水高分子包括醇、丙烯酸及其衍生物类(聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚n-聚代丙烯酰胺等)形成的水凝胶；或者由上述两者通过物理或化学方式组合形成的水凝胶；优选为羟丙基甲基纤维素(hpmc)水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、卡波姆水凝胶(carbomer)、聚氧乙烯聚氧丙烯醚三嵌段共聚物(pluronic f-127)水凝胶。

24、本发明第五方面提供metrnl蛋白或促进metrnl蛋白过表达的物质的非治疗目应用，所述应用为在体内或体外促进角质细胞，成纤维细胞增殖及内皮细胞增殖、迁移。

25、优选的，所述促进metrnl蛋白过表达的物质为含有编码metrnl蛋白核酸分子的载体或质粒。

26、术语定义

27、metrnl蛋白与基因

28、本发明的metrnl蛋白可以来源于牛、鸡、蛙、斑马鱼、小鼠、大鼠、或人；可以为包含信号肽的序列(人(np_001004431.1、小鼠(np_659046.1)、大鼠(np_001014126))、成熟序列或核心序列，上述序列皆为现有技术已知，例如cn102164611a所公开。

29、优选的，本发明中使用人(homosapiens)成熟metrnl蛋白序列(seq no.1)：

30、

31、优选的，本发明中使用小鼠(mus musculus)成熟metrnl蛋白(seq no.2)：

32、

33、优选的，本发明中使用大鼠(rattusnorvegicus)成熟metrnl蛋白(seq no.3)：

34、

35、优选的，本发明中使用人(homosapiens)metrnl蛋白核心序列(seq no.4)：

36、

37、

38、优选的，本发明中使用小鼠(mus musculus)metrnl蛋白核心序列(seq no.5)：

39、

40、优选的，本发明中使用大鼠(rattusnorvegicus)metrnl核心序列(seq no.6)：

41、

42、本发明所述的metrnl蛋白包含其变体，变体可以在氨基酸序列方面或者不涉及序列的方面与天然存在的metrnl不同，或者两方面均可以与天然存在的metrnl不同。当天然存在的metrnl的一个或多个氨基酸被不同的天然氨基酸、氨基酸衍生物或非天然氨基酸代替时，可产生氨基酸序列变体(“序列变体”)。特别优选的变体包含如下所述的天然存在的metrnl或天然存在的metrnl的生物活性片段，其序列与野生型序列相差一个或多个保守和/或半保守氨基酸取代，其通常对蛋白质或肽的二级和三级结构以及疏水特性具有最小的影响。变体还可以具有如下的序列，其相差一个或多个非保守的氨基酸替换、替代或插入，这些非保守的氨基酸替换、替代或插入不消除metrnl的生物学活性。

43、本发明所述的metrnl蛋白中的许多氨基酸，包含末端氨基酸，可以被修饰，修饰可以是通过自然过程例如糖基化和其它翻译后修饰，或者可以是通过本领域众所周知的化学修饰技术实现的。众所周知的可以在本发明多肽中存在的修饰有，仅举数例，乙酰化、酰基化、adp-核糖基化、酰胺化、黄素共价连接、血红素模块共价连接、或多核苷酸或多核苷酸衍生物共价连接、脂质或脂质衍生物共价连接、磷脂酰肌醇共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ-羧基化、糖化、糖基化、gpi锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化(prenylation)、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸化(sulfation)、转运rna介导的氨基酸向蛋白质的添加例如精氨酰化，和泛素化。这些修饰是本领域技术人员众所周知的，并且在科学文献中有非常详细地介绍。一些特别常见的修饰，例如糖基化、脂质连接(lipid attachment)、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和adp核糖基化。

44、也可以替换metrnl的天然信号序列，以便在其它哺乳动物细胞类型中重组产生时增加该蛋白的分泌。

45、本发明提供了编码metrnl蛋白的核酸序列的医疗用途，例如编码来源于牛、鸡、蛙、斑马鱼、小鼠、大鼠、或人metrnl蛋白的核酸序列，这些序列为现有技术已知例如cn102164611a所公开。

46、本发明所述的核酸序列还包括其互补序列。

47、本发明还预期了密码子优化的核酸分子，用于提高在所选宿主细胞中的表达，宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母、中国仓鼠、幼仓鼠、昆虫和真菌。

48、优选的，本发明所述的核酸分子为编码人metrnl蛋白的核酸序列。

49、优选的，本发明所述的核酸分子为编码人metrnl蛋白的cdna序列。

50、优选的，本发明所述的核酸分子为人mtrnl开放阅读框。

51、难治性创面(refractory wound)

52、难治性创面(refractory wound)是指选自放射性溃疡、压创、小腿的慢性溃疡、缺损的深度超过皮肤全层且面积较大的创面如烧伤，车祸伤，撕脱伤，或静脉输液不慎导致药物渗漏到血管外等所致创伤以及糖尿病皮肤创口等。

53、载体

54、优选的本发明所述的载体为基因治疗载体。

55、经皮给药制剂

56、本发明所述的经皮给药制剂包括核酸制剂和蛋白制剂，经皮给药制剂为现有技术已知，例如：贴剂、软膏、喷雾剂等。

57、优选的，所述经皮给药制剂中储药材料为水凝胶。

58、本发明所述的水凝胶可以为任何用于皮肤的水凝胶制品。例如，天然的亲水性高分子包括多糖类(淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸，壳聚糖等)和多肽类(胶原、聚l-赖氨酸、聚l-谷胺酸等)形成的水凝胶；或者合成的亲水高分子包括醇、丙烯酸及其衍生物类(聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚n-聚代丙烯酰胺等)形成的水凝胶；优选为羟丙基甲基纤维素(hpmc)水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、卡波姆水凝胶(carbomer)、聚氧乙烯聚氧丙烯醚三嵌段共聚物(pluronic f-127)水凝胶。

59、本发明的技术效果

60、损伤修复过程分为三个阶段：凝血和炎症阶段，增殖阶段和重塑阶段。伤口愈合的关键在于肉芽组织生长，再上皮化和血管新生，而这三个时期均处在增殖阶段。metrnl是一个新型分泌蛋白，其功能和作用在陆续发现中，本研究首次发现metrnl外源蛋白制备的pluronic f-127水凝胶可以有效的促进正常皮肤组织创口愈合，且能很好提高难愈合糖尿病皮肤的伤口愈合速率，通过增加新生血管数量和促进血管内皮细胞的增殖和迁移，促进肉芽组织生成，且能促进皮肤角质细胞的增殖和迁移。该凝胶结合pluronic f-127水凝胶的优势特点和metrnl促进皮肤创口愈合的显著特征，有效改善伤口愈合的关键阶段-增殖阶段，促进皮肤伤口快速愈合。此外，细胞水平实验显示metrnl基因也能很好促进皮肤角质细胞和血管内皮细胞的增殖和迁移。因此，本发明制备的重组蛋白metrnl水凝胶不仅可以有效促进正常皮肤组织伤口愈合，还能促进难愈合的糖尿病皮肤创口愈合，有望成为新的创面愈合调控靶点和治疗方式及有望解决该领域亟需解决的关键问题。

61、本发明选用的pluronic f-127是有环氧乙烷和聚环氧丙烷单元组成的聚合水凝胶，具有一定的柔软性和粘性，可以很好的覆盖伤口，防止外界病原菌的侵扰。水凝胶的多孔性和高含水性，保证药物输送及气体交换的同时保持伤口的湿润，有助于治疗药物更好的输送到伤口。相对于全身给药，水凝胶的局部给药提高了药物的靶向性和药效，同时达到缓释效果。