一种海洋真菌来源化合物在制备抗肿瘤血管生成的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种海洋真菌来源化合物在制备抗肿瘤血管生成的药物中的应用。


背景技术：

2.血管生成，包括毛细血管的形成和血管生成拟态。实体瘤的生长、扩散和发展都需要血管生成。据统计，90％以上的癌症相关死亡是由癌细胞侵袭和转移到重要器官造成的。血管生成是介导转移的重要机制。因此，抗血管生成可能是一种有潜力的癌症治疗技术。近年来，许多抗血管生成药物已在临床肿瘤治疗中应用。endostar，通过靶向血管egfr抑制肿瘤血管生成。另一种抗血管生成药物，贝伐珠单抗是一种重组人源化单克隆抗体，具有显著的抗血管生成功能，通过与vegf结合治疗多种恶性肿瘤。虽然这些治疗策略已被证明是非常成功的，但由于耐药、不同患者亚群的治疗失败以及对血管细胞和心肌细胞的毒副作用，其临床应用受到限制。因此，寻找创新的抗血管生成药物以提高治疗效果至关重要。
3.目前，具有生物活性的海洋天然产物作为治疗包括癌症和心血管类等疾病的有效疗法引起了人们的极大兴趣。一些海洋天然产物已经被证明可以防止新血管的形成用于癌症的治疗，表明海洋天然产物是发现新的抗血管生成药物的丰富且有前途的来源。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种海洋真菌来源化合物在制备抗肿瘤血管生成的药物中的应用。
5.本发明的目的还在于提供海洋真菌来源化合物chnqd-0803在制备治疗肝癌的药物中的应用。
6.本发明的目的还在于提供海洋真菌来源化合物chnqd-0803在制备hif-1α蛋白抑制剂中的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明提供了一种海洋真菌来源化合物在制备抗血管生成的药物中的应用，其为chnqd-0803，其化学结构式为：
[0009][0010]
进一步的，所述血管生成为肿瘤血管生成。
[0011]
进一步的，所述chnqd-0803的使用浓度为0.1μm-25μm。
[0012]
进一步的，所述chnqd-0803能够抑制细胞迁移、管束形成、血管生成拟态或胚胎节段间血管形成。
[0013]
进一步的，所述chnqd-0803能够通过激活ampk，抑制mtor/hif-1α，达到抑制血管生成的作用。
[0014]
进一步的，所述肿瘤为肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、胶质瘤、血管瘤、中枢神经系统肿瘤、甲状腺癌、乳腺癌中的一种。
[0015]
进一步的，所述的药物的剂型为胶囊剂、片剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。
[0016]
进一步的，所述药物的给药方式为注射、口服、吸入式喷雾或透皮给药。
[0017]
本发明还提供了所述的chnqd-0803在制备治疗肝癌的药物中的应用。
[0018]
进一步的，所述chnqd-0803通过抑制细胞迁移、血管生成拟态和hif-1α的蛋白表达达到抑制肝癌血管生成的作用。
[0019]
进一步的，所述chnqd-0803的使用浓度为5μm-20μm。
[0020]
本发明还提供了所述的chnqd-0803在制备hif-1α蛋白抑制剂中的应用。
[0021]
进一步的，所述chnqd-0803的使用浓度为3.125μm-25μm。
[0022]
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
[0023]
1、本发明首次在体内和体外同时证明了chnqd-0803的抗血管生成作用，具体为：chnqd-0803对斑马鱼和多种细胞，包括人脐静脉血管内皮细胞和肝癌细胞，都有显著的抗血管生成效果。
[0024]
2、chnqd-0803在体外具有抑制人脐静脉内皮细胞(huvecs)迁移和管束形成的抗血管生成作用，并可阻断斑马鱼胚胎节段间血管的形成。此外，chnqd-0803抑制bel-7402的迁移和血管生成拟态。本发明通过chnqd-0803抑制血管生成的机制，验证得到chnqd-0803可降低akt和mtor的磷酸化水平，抑制hif-1α的蛋白表达，进而表明，chnqd-0803是治疗癌症的抗血管生成的潜在候选药物，具有良好的应用前景。
[0025]
3、chnqd-0803能够从海洋真菌中分离，不会破坏生态平衡，易实现产业化，是非常有开发前景的可再生性抗肿瘤药物资源。
附图说明
[0026]
图1是本发明中chnqd-0803的化学结构。
[0027]
图2是本发明中chnqd-0803在体外抑制huvecs细胞迁移的结果。
[0028]
图3是本发明中chnqd-0803在体外抑制bel-7402细胞迁移的结果。
[0029]
图4是本发明中chnqd-0803在体外抑制huvecs细胞血管生成的结果。
[0030]
图5是本发明中chnqd-0803在体外抑制bel-7402细胞血管生成的结果。
[0031]
图6是本发明中chnqd-0803在体内抑制斑马鱼胚胎血管生成的结果。
[0032]
图7是本发明中chnqd-0803在huvecs中激活ampk，抑制mtor/hif-1α通路。
具体实施方式
[0033]
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
[0034]
海洋真菌中分离得到的念珠菌素a(chnqd-0803)是一种多环对联苯，其特征是末
端和中心苯环之间有一个呋喃环，化学结构如图1所示。chnqd-0803具有多种生物活性，但其对肿瘤血管生成的作用尚不清楚。
[0035]
实施例1：chnqd-0803在体外对huvecs和bel-7402细胞迁移的影响
[0036]
细胞：人脐静脉血管内皮细胞(huvecs)和肝癌细胞(bel-7402)，购自中科院上海细胞库。
[0037]
试剂：5μm、10μm、20μm chnqd-0803、4％多聚甲醛、0.1％结晶紫。
[0038]
仪器：co2培养箱，倒置显微镜，超净工作台
[0039]
细胞划痕实验方法：将适量huvecs细胞接种在12孔板中过夜生长至90％汇合。然后使用200μl移液器吸头制作划痕。用pbs洗涤三次后，用新鲜无血清的dmem和chnqd-0803处理细胞。正常培养环境下，生长0、24及48小时后，使用倒置显微镜观察并拍摄图像。
[0040]
transwell细胞迁移实验方法：在孔径为8μm的transwell小室中测试细胞迁移。将huvecs和bel-7402细胞在无血清培养基中重悬后，转移到transwell 24孔板的上室中。然后在transwell小室的下室中加入含20％fbs和chnqd-0803的细胞培养基。处理24小时后，用4％多聚甲醛固定液固定小室，用0.1％结晶紫染色，用棉签轻轻擦拭transwell小室内膜的上表面，使用倒置显微镜观察并拍摄图像。
[0041]
结果如图2显示，chnqd-0803处理24小时后，huvecs的迁移面积受到抑制。5μm、10μm和20μm药物浓度的伤口愈合率分别为54.3％、30.8％和1.2％，同样的，相应药物浓度治疗48h后伤口愈合率分别为70.5％、55.9％和3.0％，显著低于对照组。此外，chnqd-0803在transwell细胞迁移实验中也显著降低了通过膜迁移的huvecs细胞数量，与细胞划痕实验结果一致，说明chnqd-0803可以抑制huvecs迁移。
[0042]
根据图3实验结果显示，5μm、10μm和20μm的chnqd-0803浓度处理bel-7402细胞24小时后，随药物的浓度增加，bel-7402迁移到下膜的数量显著减少，表明chnqd-0803抑制bel-7402迁移。
[0043]
实施例2：chnqd-0803在体外对huvecs和bel-7402细胞血管生成的影响
[0044]
细胞：人脐静脉血管内皮细胞(huvecs)和肝癌细胞(bel-7402)，购自中科院上海细胞库。
[0045]
试剂：5μm、10μm、20μm chnqd-0803、低浓度基质胶。
[0046]
仪器：co2培养箱，倒置显微镜，超净工作台。
[0047]
实验方法：取低浓度基质胶在4℃彻底融化，按50μl/孔的量加入96孔板中，转移到培养箱中放置30分钟，促进基质胶凝固。将适量细胞接种到有基质胶的96孔板，用含10％fbs和5μm、10μm和20μm的chnqd-0803的培养基继续培养细胞。huvecs细胞孵育6小时后，bel-7402细胞孵育24小时后，通过倒置显微镜观察小管结构并拍照。
[0048]
结果如图4显示，5μm、10μm和20μm的chnqd-0803浓度处理huvecs细胞6小时后，内皮导管和导管的总长度随着药物浓度增加显著降低。同时，图5结果显示，5μm、10μm和20μm的chnqd-0803浓度处理bel-7402细胞24小时后，内皮导管和导管的总长度都随着药物浓度增加显著降低。以上实验结果表明，chnqd-0803可以抑制huvecs和bel-7402细胞的血管生成。
[0049]
实施例3：chnqd-0803对斑马鱼胚胎节间血管生成的影响
[0050]
动物：tg(flflk1:egfp)斑马鱼胚胎。
[0051]
试剂：chnqd-0803。
[0052]
仪器：恒温生化培养箱，倒置荧光显微镜，超净工作台。
[0053]
实验方法：斑马鱼受精16小时后，挑选孵化出的健康斑马鱼胚胎，放于24孔板中(每孔10个胚胎)。在28.5℃条件下，分别使用3.125μm、6.25μm、12.5μm和25μm的chnqd-0803处理胚胎10小时，然后在倒置荧光显微镜下观察节间血管长度并拍照。同时，记录斑马鱼胚胎的畸形率和死亡率并统计。
[0054]
结果如图6显示，3.125μm、6.25μm、12.5μm和25μm的chnqd-0803处理斑马鱼胚胎，节间血管生长抑制率分别为38.7％、65.8％、68.1％和90.9％。此外，在该实验条件下，chnqd-0803在0-25μm的浓度范围内对斑马鱼胚胎没有明显的致畸和致死影响(见表1)。
[0055]
表1：chnqd-0803对斑马鱼胚胎畸形和死亡的影响
[0056][0057]
实施例4：chnqd-0803对huvecs的ampk和mtor/hif-1α通路的影响
[0058]
细胞：人脐静脉血管内皮细胞(huvecs)，购自中科院上海细胞库。
[0059]
试剂：chnqd-0803，蛋白裂解液，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，蛋白电泳液，转膜液，5
×
loading buffer，4
×
浓缩胶缓冲液，4
×
分离胶缓冲液，aps，β-巯基乙醇，pvdf膜，蛋白预染marker，ecl发光试剂盒。
[0060]
仪器：co2培养箱，超净工作台，高速冷冻离心机，蛋白电泳仪，转膜仪，摇床，金属浴，多功能成像分析系统。
[0061]
实验方法：
[0062]
(1)sds-page胶的制备：将清洗干净的电泳玻璃板按仪器要求装备到制胶架上，添加适量双蒸水进行验漏。根据实验所需的凝胶浓度，在50ml的离心管中加入适量的水、30％聚丙烯酰胺以及分离胶buffer或浓缩胶buffer。加入促凝剂aps和temed后，必须立即混匀，为防止凝胶过早凝结，可以在倒板之前放在冰水混合物中。用移液枪将混匀的凝胶溶液加入预装好的玻璃板之间，分离胶需要的凝胶体积大约在5ml左右，浓缩胶大约在3ml。加入浓缩胶后，应立即插入适配玻璃板的15孔胶梳，此过程中需注意气泡。
[0063]
(2)收样：贴壁细胞收样时，先将细胞中培养基弃掉，再用pbs清洗，清洗大约2-3遍(清洗过程全程保持低温)，最后一遍清洗时需尽量吸干残余的pbs，加入细胞裂解液(已预先加入磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂以及pmsf)，冰上放置15min完全裂解细胞。收集细胞，4℃12000rpm离心15min，取上清。bca蛋白含量检测试剂盒检测上清中蛋白含量，用细胞裂解液平衡蛋白含量，加入等量2
×
loading buffer混匀，转移至金属浴中，95℃煮样10min。
[0064]
(3)电泳：按每孔15μg总蛋白的量加入sds-page胶中，上层胶的电泳条件是90v，30min。下层胶的电泳条件为120v，90min。待buffer中的溴酚蓝电泳至胶板底部时，结束电
泳。
[0065]
(4)转膜：将10
×
转膜缓冲液，无水乙醇，双蒸水混合配成1
×
转膜缓冲液(乙醇比例20％)。pvdf膜使用前需提前活化。在电转夹板上，按照正极-滤纸-pvdf膜-胶-滤纸-负极的顺序装配。装配过程需避免气泡，一旦发现胶、pvdf膜中有气泡存在，转膜之前必须要去除。转膜条件为200ma电流，90min。
[0066]
(5)封闭：将转膜完成的pvdf膜转移至孵育盒中，加入配置好的5％脱脂奶粉或bsa，脱脂奶粉或bsa的量必须完全没过膜。室温条件下，摇床上慢速封闭1h(如果使用bsa封闭，时间可以缩短到20min)。
[0067]
(6)抗体孵育：根据marker的位置裁剪出目标蛋白所在的条带，使用tbst配置的5％脱脂奶粉或bsa提前稀释一抗，孵育在一抗中的条带可直接室温条件摇床60rpm，30min或4℃孵育过夜。收集一抗进行回收，tbst清洗pvdf膜5遍(室温摇床90rpm，7min)，彻底洗去膜表面未结合的一抗。加入带有hrp标记的相应种属的二抗，室温条件摇床60rpm，45-60min。
[0068]
(7)显影：弃掉二抗后，使用tbst清洗pvdf膜5遍(室温摇床90rpm，7min)，彻底洗去膜表面未结合的二抗。按照说明书在显影前10min配置化学发光液。利用化学发光成像仪进行检测。
[0069]
结果如图7显示：检测不同浓度的chnqd-0803处理huvecs细胞12小时后，akt-mtor和hif-1α通路，包括akt、p-akt(ser473)、p-mtor(ser2448)、hif-1α、hsp90、β-catenin和vegf的表达。结果显示，vegf、β-连环蛋白、akt、mtor和hsp90的蛋白表达水平没有显著变化，但akt，mtor磷酸化水平下降，同时其下游的蛋白hif-1α蛋白表达显著降低。mtor和hif-1α是血管生成过程中的经典通路，而ampk激活后，可负调控mtor，说明ampk-mtor-hif-1α可能是chnqd-0803抑制血管生成的潜在机制。
[0070]
hif-1α是调节与肿瘤代谢、转移能力和血管生成有关的基因的重要分子。因此，hif-1α被认为是一种很有前景的抗癌药物靶点。chnqd-0803显示可降低hif-1α蛋白表达，这是抑制肿瘤血管生成的关键作用模式。hif-1α表达受蛋白质合成和降解的影响。磷酸肌醇3激酶(pi3k/akt/mtor)途径促进hif-1α翻译。通过磷酸化下游效应子和驱动帽依赖性mrna翻译，mtor调节蛋白质翻译，最终导致hif-1α蛋白产生的刺激。chnqd-0803处理通过激活ampk使mtor失活并降低hif-1α蛋白表达，表明chnqd-0803通过该途径抑制hif-1α表达。
[0071]
本发明首次验证了海洋天然产物念珠菌素a(chnqd-0803)通过在体外调节ampk/mtor/hif-1α通路来抑制huvecs迁移和血管形成。此外，chnqd-0803抑制bel-7402迁移和血管生成拟态。同时，在斑马鱼动物实验中chnqd-0803也抑制了斑马鱼胚胎节间血管的生长。这些结果明确表明，海洋天然产物chnqd-0803有很好的抗血管生成活性，是未来治疗肺癌、胃癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、胶质瘤、血管瘤、中枢神经系统肿瘤、甲状腺癌、乳腺癌等癌症的潜在药物。
[0072]
以上实施例仅用于说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案。尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的技术人员应当理解，所属技术领域的技术人员仍然可以对本发明进行修改或者等同替换，而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，均应涵盖在本发明的权利要求范围内。