苜蓿素在制备治疗/预防帕金森病的药物中的应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及苜蓿素在制备治疗/预防帕金森病的药物中的应用。


背景技术：

2.帕金森病(parkinson's disease，pd)是神经系统最常见的退行性疾病之一，其发病率随着年龄的增长而上升。帕金森的病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元大量进行性变性缺失，残存的多巴胺能神经元内形成以不溶性α-synuclein为主要成分的嗜酸性包涵体，即路易小体。另外，帕金森病最显著的生化特征改变是纹状体区多巴胺含量减少，乙酰胆碱系统功能相对亢进。临床上主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态异常等，严重影响患者生活质量。pd的病因和发病机制相当复杂，目前研究尚未彻底明确，临床上通过药物和外科手术等治疗可缓解临床症状，但没有任何治疗方法能够确切证明减缓或阻止pd的进程，所以迫切需要更多针对此疾病的有效治疗。
3.目前，治疗pd的药物主要有抗胆碱能药、复方左旋多巴、da受体激动剂、金刚烷胺、单胺氧化酶b型抑制剂、儿茶酚-氧位-甲基转移酶抑制剂等。目前临床使用的药物虽然能暂时控制患者的临床症状，却不能控制疾病的进程，长期的治疗还会致使药效降低，伴随严重的不良反应。越来越多的学者将目光转移到预防或阻止多巴胺能神经元变性及阻止疾病的发展上。
4.细胞自噬是一种利用溶酶体降解完成细胞降解以及大块胞浆蛋白和受损细胞器循环再利用的高度稳定的细胞过程。重要的是，基础自噬对于神经元的稳态以及确保神经元正常的细胞功能是必需的。随着近年来对于细胞自噬研究的深入，发现自噬与神经退行性疾病的发生、发展相关。细胞自噬在pd发病机制中的作用是通过观察pd患者的大脑和pd动物模型中自噬通路的失调指出的，自噬缺陷或不足将导致变性的α-synuclein等有害物质的集聚，这可能是pd发生的重要原因，自噬调节可能是pd治疗的潜在靶标。如果能通过药物或基因等手段来调节自噬，达到抑制神经元中有缺陷蛋白和功能异常细胞器集聚，从而使神经元免于损伤，是pd有较好前景的治疗方法。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了苜蓿素在制备治疗/预防帕金森病的药物中的应用。本发明通过实验证实苜蓿素具有自噬诱导及清除α-synuclein蛋白聚合物的功效，可用于制备治疗/预防帕金森病的药物。
6.本发明提供了苜蓿素在制备治疗/预防帕金森病的药物中的应用。
7.优选地，所述药物包含苜蓿素和药学上可接受的辅料。
8.更优选地，所述药学上可接受的辅料包括渗透压调节剂、ph值调节剂、增溶剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、粘合剂或助悬剂中的至少一种。
9.优选地，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、颗粒剂、口服液或注射剂。
10.优选地，所述药物的给药方式为口服或注射；所述注射的方式为静脉注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。
11.优选地，所述药物的给药剂量为20-80mg/kg。
12.本发明还提供了苜蓿素在制备自噬诱导剂中的应用。
13.本发明还提供了苜蓿素在制备α-synuclein蛋白聚合物清除剂中的应用。
14.本发明还提供了苜蓿素在制备预防帕金森病的保健品中的应用。
15.我国的天然产物资源丰富,天然产物有着极其丰富的化学结构，是药物发现与发展的重要源泉，同时也是研发抗帕金森病药物的宝贵来源。苜蓿素(tricin)，其化学名为5，7，4'-三羟基-3'，5'-二甲氧基黄酮，是一种天然黄酮，广泛分布于禾本科、大戟科植物中，其结构式如下所示：
[0016][0017]
现有研究证实苜蓿素表现出广泛的生物学活性，能抑制小肠蠕动收缩，并有显著的抗过敏、抗氧化、抗肿瘤等生物活性。此外，苜蓿素具有清除自由基、抗氧化、降血脂，预防心脑血管疾病的作用。而本发明以α-synuclein为靶点进行促自噬的新型抗帕金森病的药物研发，并发现苜蓿素具有自噬诱导及清除α-synuclein蛋白聚合物的功效，因而具有预防和治疗帕金森病的突出潜力。
[0018]
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
[0019]
本发明指出苜蓿素在体内体外实验中具备增强细胞自噬的作用，对引起帕金森病的α-synuclein蛋白的表达具有抑制作用，能够用于制备治疗/预防帕金森病的药物。
附图说明
[0020]
图1为苜蓿素对pc12大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞的细胞毒性、细胞存活率的影响。
[0021]
图2为苜蓿素对pc12细胞中诱导自噬的免疫印迹检测结果；其中，(a)为蛋白条带；(b)为量化的蛋白条带统计学分析结果柱状图。
[0022]
图3为苜蓿素对gfp-lc3稳转的u87细胞中诱导自噬的免疫荧光检测结果；其中，(a)为免疫荧光照片；(b)为显示gfp-lc3绿色荧光颗粒阳性细胞的比率的柱状图。
[0023]
图4为苜蓿素处理后的da2123 adis2122和bc12921两种线虫株系的免疫荧光检测结果；其中，(a)为免疫荧光照片；(b)为显示荧光斑点数量和自噬底物的荧光强度的柱状图。
[0024]
图5为苜蓿素诱导pc12细胞自噬的信号通路的免疫印迹检测结果；其中，(a)为cc(ampk抑制剂)对苜蓿素诱导的ampk磷酸化及自噬发生的影响；(b)为各组p9-ampk条带相对于β-actin的表达强度分析的柱状图。
[0025]
图6为苜蓿素处理的atg7野生型mef细胞和atg7基因敲除mef细胞中的自噬蛋白lc3-i/ii表达情况；其中，(a)为蛋白条带；(b)为量化的蛋白条带统计学分析结果柱状图。
ii的表达，表明苜蓿素具有诱导细胞自噬的效应。
[0040]
实施例3：gfp-lc3稳转u87细胞系中苜蓿素诱导自噬的效果
[0041]
向培养的gfp-lc3稳转的u87细胞(由澳门科技大学竺晓明博士组构建，使用lipofectaminetm 2000和gfp-lc3质粒转染u87细胞构建得到)内分别加入不同浓度的苜蓿素进行处理，形成的gfp-lc3绿色荧光颗粒，并依据文献中的方法进行量化(klionsky dj等.autophagy.2016；12(1):1-222)。将gfp-lc3稳转的u87细胞种植在6孔板的盖玻片上，苜蓿素药物处理后，4％多聚甲醛室温固定细胞20分钟，pbs洗涤两次。fluor save tm封片液(calbiochem，san diego，ca，usa)封闭空气中晾干的玻片。荧光显微镜分析系统(applied precision delta vision elite，applied precision，inc，usa)观察和计量gfp-lc3绿色荧光颗粒形成的阳性细胞数。gfp-lc3绿色荧光颗粒阳性细胞数除以总细胞数，得到阳性细胞比率。随机选取三个视野的150个细胞进行计数。
[0042]
测试结果如图3所示，20-80μm的苜蓿素能促进gfp-lc3ii绿色荧光颗粒形成(如图3中(a)的明亮区域)，且其促进效果表现出浓度依赖性和时间依赖性，可诱导自噬的发生。
[0043]
实施例4：苜蓿素对线虫模型自噬活性的增强效果
[0044]
采用da2123 adis2122和bc12921两种线虫株系(从caenorhabditis genetics center(cgc)获取)：
①
da2123是表达gfp标记的lgg-1的转基因菌株，在自噬过程中，lgg-1::gfp融合蛋白定位成绿色荧光点，表示自噬体形成，因此lgg-1::gfp可用作自噬标记，以检测秀丽隐杆线虫的自噬，荧光显微镜下观察其荧光强度。
②
在bc12921线虫中，sqst-1-gfp融合蛋白(哺乳动物p62的线虫同源物)在sqst-1启动子的控制下表达。随着自噬活性的增强，sqst-1-gfp的降解程度增加，bc12921的荧光强度减弱，荧光显微镜下拍摄，统计分析其荧光强度。
[0045]
采用rapa(雷帕霉素)作为阳性对照组。对照组和实验组的ngm培养基加入100μl op50大肠杆菌菌液，吹干备用。将同步化后的线虫da2123和bc12921置于20℃培养箱放置16～20h，放入离心机，3000rpm离心2min后去除大部分上清只留取约1ml液体，取10μl镜下观察计数。按照每个ngm培养皿80条线虫计算，在对照组和实验组ngm培养皿中加入适当体积的液体，置于超净工作台吹干后放入20℃培养箱中培养48h。挑取适宜数量的线虫麻醉后，在荧光显微镜下(10倍)拍摄。统计分析其荧光强度。
[0046]
与对照组相比，实验组秀丽隐杆线虫c.elegans的lc3-ii水平升高了，自噬底物p62的水平下降了，这证实苜蓿素体内模型中增加了自噬。
[0047]
实施例5：苜蓿素通过ampk依赖信号通路诱导自噬
[0048]
ampk信号通路能够促进自噬，compound c(cc)是一种ampk抑制剂。向培养的pc12细胞中加入药物tricin、tricin+cc、cc进行处理，tricin浓度为60μm，cc浓度为5μm，以不加药物的空白组作为对照。药物处理后，参照如实施例2中免疫印迹法，检测药物处理对pc12细胞中p-ampkα1、ampk、lc3i、lc3ii蛋白表达的影响。
[0049]
测试结果如图5所示，由图5中(a)和(b)可知，cc明显的降低tricin诱导的p-ampkα1表达，继而显著地抵消苜蓿素诱导的lc3i向lc3ii转化。本试验结果显示，在pc12细胞中，tricin诱导的自噬发生是ampk依赖性的。
[0050]
实施例6：苜蓿素诱导细胞自噬是atg7依赖性的
[0051]
为进一步探明苜蓿素的分子机制，本实验利用atg7野生型(atg7+/+)和atg7基因
敲除型(atg7-/-)mefs细胞(由masaaki komatsu(juntendo university,tokyo,japan)提供)，来研究苜蓿素诱导自噬的途径。其中，atg7是自噬诱导的关键因子，对自噬泡的形成具有重要的作用(juh
á
sz g等.genes&development.2007；21(23):3061-6)。
[0052]
用egfp-lc3质粒转染atg7野生型(atg7+/+)和atg7基因敲除型(atg7-/-)mefs细胞用指示浓度的tricin处理24小时。收集细胞裂解液，分析lc3
‑ⅱ
和β-actin的蛋白水平。
[0053]
测试结果如图6所示，苜蓿素可以诱导atg7野生型mefs细胞自噬发生，但是不能诱导atg7基因敲除型mefs细胞的自噬发生。该结果说明化合物苜蓿素诱导自噬是atg7依赖性的。
[0054]
实施例7：苜蓿素通过清除细胞中的α-synuclein过表达蛋白产生神经保护作用
[0055]
残存的多巴胺能神经元内会形成以不溶性α-synuclein为主要成分的嗜酸性包涵体，即路易小体，而路易小体是帕金森病的典型特征，另外，变性的α-synuclein集聚，进而产生神经毒性，因此，研究药物对细胞内α-synuclein的表达影响对于帕金森病的治疗具有重要意义。
[0056]
α-synuclein质粒的转染：将pc12细胞接种到6孔板上，每孔细胞数量约为20万个，24h后，待细胞密度达到70％左右时，按照lipofectamine tm 2000(invitrogen，usa)转染试剂的说明操作，将α-synuclein-a53t-gfp质粒(购买自addgene公司)瞬时转染入细胞中，转染6h后，换新的培养基，加入不同浓度的苜蓿素进行干预处理。24小时后收集细胞裂解液。
[0057]
免疫印迹法分析：细胞裂解液在4℃高速离心10min，吸取上清液，按蛋白测定试剂盒(bio-rad protein assay，usa)说明书测定每个样品的蛋白浓度。取30μg的蛋白样品，加入上样缓冲液于100℃煮5分钟，用10％的sds-page进行凝胶电泳，300ma恒流湿转法电转2h至pvdf膜(millipore，bedford，ma，usa)。用5％的脱脂奶粉震摇封闭1h，然后加入含5％的bsaα-synuclein抗体，4℃孵育过夜。次日加入二抗，室温震摇孵育1h，tbst洗5次，每次5min。加入ecl发光液显色，bio-rad chemi doc成像系统显影。最后应用image j软件对条带进行定量分析。
[0058]
测试结果如图7所示，由图7中(a)和(b)可知，免疫印迹法数据显示，苜蓿素(40-100μm)有降低过表达的α-synuclein的作用。
[0059]
实施例8：tricin可以改善a53t转基因小鼠的行为学能力
[0060]
a53t转基因小鼠可以较好地模拟帕金森病的发病情况，是研究帕金森病发病机制的一种较好的小鼠模型。a53t突变指的是α-synuclein基因第4位外显子第209位胞嘧啶(g)突变为胸腺嘧啶(a)，导致其氨基酸序列发生改变，使第53位丙氨酸突变为苏氨酸。α-synuclein的空间结构被影响，α螺旋转变成β-片层结构，致使蛋白质聚集。本试验使用a53t转基因小鼠(jax004479)，是将突变的人源的α-synuclein基因通过显微注射转入小鼠。小鼠在9月龄左右出现运动障碍，认知功能损伤，甚至发病后期会出现部分肢体开始瘫痪、颤抖、不能站立等症状。9-12月龄a53t转基因小鼠脊髓、脑干和小脑等区域出现大量的α-synuclein包涵体，且这些包涵体的结构、位置都与家族性pd患者都极为相似。其次，pd的病理变化主要在脑组织，如果能使用pd患者脑组织进行研究可以获得更准确的结果，但pd患者脑组织数量有限，因此这种品系小鼠是研究pd病理变化常用小鼠模型。
[0061]
建立8月龄a53t转基因小鼠模型后，采用不同剂量的tricin进行处理，并以l-dopa
(左旋多巴)作为阳性对照，通过旷场实验、y-迷宫、双下肢抱紧实验、筑巢试验测试各组小鼠的行为学能力。
[0062]
y型迷宫
[0063]
y型迷宫由3个水平臂组成，相互之间呈120度角。臂长40厘米，宽10厘米，高15厘米，由不透明的聚乙烯塑料制成。小鼠被放在y型迷宫的中间，然后记录进入每个手臂的顺序和总次数。小鼠连续进入3个不同的手臂被记录为自发的交替反应。
[0064]
筑巢实验
[0065]
实验前，将一只小鼠养在笼子里适应环境至少24小时。在小鼠笼子里放入约2厘米厚的垫料，每个笼子里放一只小鼠，用6个棉球放入笼子的一角作为小鼠的筑巢材料。然后将小鼠放在笼子里，照常喂食。筑巢实验从19:00到第二天7:00进行并观察。
[0066]
旷场试验
[0067]
在一个40cm
×
40cm
×
40cm的立方体箱内进行开放性野外试验，上面没有悬挂摄像机。箱子的底部和四壁均为白色。实验前，打开自动视频跟踪软件，设定实验箱内的观察区、中心区和边缘区。适应期过后，实验开始，将小鼠放入实验箱的中心区域，然后启动视频记录系统，自动记录每只小鼠在中心和边缘区域的运动时间、距离、速度和停留时间。
[0068]
双下肢抱紧试验
[0069]
抬起小鼠的尾巴，使小鼠的头垂到空中。5秒后记录每只小鼠的后肢紧握程度并进行分级。分级标准如下。0级＝两个后肢向外伸展，远离腹部；1级＝有一个后肢被卷入腹部；2级＝两个后肢没有完全被卷入腹部；3级＝两个后肢完全被卷入腹部。有些情况可以用0.5分来评分。
[0070]
测试结果如图8-11所示，可知tricin可以改善a53t转基因小鼠的行为学能力。
[0071]
实施例9：tricin可以增强a53t转基因小鼠的自噬活性和改善pd靶点指标
[0072]
通过免疫印迹法研究在给予不同剂量(40μm、60μm)苜蓿素后a53t转基因小鼠lc3
‑ⅱ
、α-synuclein和酪氨酸羟化酶(th)的表达情况，并以l-dopa(左旋多巴)作为阳性对照。参照实施例2中的免疫印迹法，制备动物组织样品，sds-page蛋白电泳，将蛋白转移到pvdf膜上，使用抗体孵育后，使用ecl免疫印迹检测液(invitrogen，paisley，scotland，uk)曝光显影蛋白条带。
[0073]
测试结果如图12所示，苜蓿素可升高lc3
‑ⅱ
和酪氨酸羟化酶(th)的表达，并且能降低α-synuclein的表达。
[0074]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。