一种治疗用卡介苗菌体的分散、冻干方法及原液、半成品、成品与流程

本发明属于疫苗制备领域，特别涉及一种治疗用卡介苗菌体的分散、冻干方法及原液、半成品、成品。

背景技术：

1、治疗用卡介苗是采用卡介菌经培养收集菌体，制备高浓度卡介菌菌悬液，加入稳定剂冻干制成的制剂。目前全球有5款产品已上市，而因为监管、成本和设备等因素，北美和欧洲主要供应商赛诺菲于2017年宣布正式退出该市场，导致全球治疗用bcg处于短缺状态。当前冻干制品稳定性最高可以保持18个月，实践运用中18个月效期仍不能满足实际市场需求，产品的货架期较短，因此生产高质量及稳定性好的治疗用卡介苗是一项具有挑战的工作。

2、目前已上市的必赛吉治疗用bcg用卡介菌经培养后收集菌体，加入稳定剂分装至安瓿中冻干制成的免疫治疗剂，采用冻干保护剂为蔗糖、明胶、谷氨酸钠、氯化钾，冻干生产工艺与预防结核病用卡介苗相同(《中国药典》现行版)为行业内公认，而治疗用卡介苗制品质量指标之一卡介菌活菌数及活菌数的稳定性是影响免疫效果的关键因素，每瓶含卡介菌60mg，每1mg卡介菌含活菌数为1.0×106cfu，活菌数的质量仅能满足《中国药典》现行版三部要求“不低于1.0×106cfu/mg”的最低标准；且内包材采用安瓿，一方面因包材直立时稳定性差，冻干时半成品分装后进出冻干机无法做到自动进出，只能采用手动进出冻干机，不符合自动化生产要求，为产品安全带来风险，另一方面与国际上该类产品采用的主流包材西林瓶存在差距。

3、目前，现有技术中对卡介菌的研究中，多针对卡介菌的冷冻和冷冻干燥技术研究中保护剂处方研究和冻干工艺研究。例如公开号为cn106754376a的专利提出了涉及一种微生物低温保存保护剂，及其制备方法和用途；其中微生物低温保存保护剂的成分为：还原性糖、甘油、非离子型表面活性剂、钾盐、谷氨酸盐和水；同时建立了卡介菌低温长期保存的技术方法，为深入开展卡介菌的相关研究提供了技术支撑；但治疗用卡介苗剂型基本都是采用注射用冻干剂型，液体冷冻稳定性差，不能满足临床使用要求。公开号为cn1218750c的专利公开了治疗用卡介苗的保护剂和冻干工艺，制备联合疫苗具有强免疫原性；公布重组hifn-α-2b-bcg冻干保护剂处方：10％蔗糖、1％明胶、1％谷氨酸钠、1％氯化钾，冻干制剂活菌率高，满足生物免疫治疗标准，生物学特性和质粒具有稳定性。公开号为cn111588859a的专利提出了一种冻干保护剂及其应用和冻干苗及其制备方法，冻干保护剂各成分配制浓度为：蔗糖10％、右旋糖酐0.5～2.0％、谷氨酸钠1％、kcl1％，或者是蔗糖10％、右旋糖酐1％、海藻糖1～5％、谷氨酸钠1％、kcl1％，配制冻干保护剂的溶剂为注射用水，用10％氢氧化钠溶液调节冻干保护剂的ph值为7.3～7.5。但采用该专利方法制备的治疗用稳定性研究结果显示有效质量的时间为3个月，远远低于上市品18个月的最长效期。菌体采用保护剂分散后，半成品菌体浓度为120mg/ml。综上可以看出，菌体在保护剂中的分散方式的研究未见涉及。

4、现有的卡介苗冷冻干燥工艺一般包括冷冻、第一阶段升华干燥(一次干燥)和第二阶段解析干燥(二次干燥)三个步骤，研究表明冷冻和一次干燥是冷冻干燥过程中最关键的阶段之一。上述冷冻干燥工艺未考虑到治疗用卡介苗是一种高浓度、冻干活菌制剂，制剂处方中固态物质含量(有效成分和非有效成分含量总和)为19％(g/g)，而半成品中冻干保护剂成分及比例、菌体在保护剂中的分散方式及冻干工艺对制品冻干后活菌数含量及耐热耐存放的稳定性具有重要影响。另有冻干工艺采用常规的快速降温办法，该方法中同一瓶制品与层板接触的底层与面层的温度相差较大，底层已经达到产品共晶点而面层还相差较远，出现瞬间从底部向面层形成结晶然后再溶解、再结晶的反复冻融现象。从而造成同一瓶制品不同层的溶液浓度不一样，在面层形成高浓度的盖子，不利于产品预冻后的升华，容易造成物理性状不好、形成较大晶体、光亮的面层、底部萎缩等现象，反复冻融会对所冻菌体造成机械损伤。从而导致产品冻干损失大，活菌数测定结果显示虽不低于1.0×106cfu/mg，但数值达到临界值，有不合格的风险。因此冷冻阶段通常采用梯度降温，例如公开号为cn107543373a的专利中提出了一种活疫苗的冷冻干燥方法，在冷冻后和干燥步骤之间引入退火处理，获得的制品没有大冰晶，易于升华获得良好的产品物理性状和效价，并改善同一瓶及不同瓶间不均匀性和干燥速率，提高非晶项冻结浓缩液的玻璃化转变温度，从而提高制品的稳定性。一次干燥阶段，大部分水在这一阶段被升华；解析干燥阶段是为除去残余的水分，因治疗用卡介苗为活菌制剂，若控制不好，会直接影响产品的外观、水分、活菌数质量和稳定性。治疗用卡介苗公认的冻干工艺和公开号为cn111588859a的专利中都公开了相关阶段常规控制方法，但均未考虑对制品活菌数和耐热稳定性影响，从而影响活菌数或稳定性。

5、综上可知，目前公开有关治疗用卡介苗的半成品的浓度为120mg/ml，未公开任何在原液及半成品制备过程中有关菌体分散的控制方法，而本发明需要找到的不仅是一种通过菌体分散制备半成品方法，而且需要找到替代现有技术的含退火步骤的一种治疗用卡介苗冻干方法，以解决其质量或稳定性不高的缺点外，还需要在此基础上，获得一种能缓解当前短缺，更加具有产业化规模、安全的一种治疗用卡介苗。

技术实现思路

1、针对上述问题，第一方面，本发明提出了一种治疗用卡介苗菌体的分散方法，所述分散方法通过将15g～20g菌体分散到125g～167g冻干保护剂中，获得1单位重量菌悬液浓度为120mg/ml～140mg/ml的治疗用卡介苗原液；

2、采用冻干保护剂将所述治疗用卡介苗原液分散1.8～2.5倍，混合均匀，得1单位重量治疗用卡介苗半成品；

3、所述1单位重量治疗用卡介苗半成品中卡介菌浓度为48～72mg/ml。

4、进一步地，所述冻干保护剂包括蔗糖10％、明胶1％、谷氨酸钠1％、氯化钾1％和余量的注射用水。

5、进一步地，获得治疗用卡介苗原液包括以下步骤：

6、将15g～20g卡介苗菌体按照与1000g钢珠的质量比进行研磨；

7、研磨后加入125g～167g冻干保护剂，混匀10分钟，获得治疗用卡介苗原液。

8、更进一步地，研磨条件为：转速180～200r/min、时间3～5min。

9、进一步地，所述卡介苗菌体和冻干保护剂的质量比为17～20g：125g～135g。

10、进一步地，所述卡介苗菌体和冻干保护剂的质量比为19.8g：130g。

11、进一步地，所述1单位重量治疗用卡介苗半成品中卡介菌浓度为54～66mg/ml。

12、更进一步地，所述1单位重量治疗用卡介苗半成品中卡介菌浓度为60mg/ml。

13、第二方面，本发明提出了一种治疗用卡介苗原液，所述治疗用卡介苗原液重量为所述卡介苗原液1单位重量的1倍～120倍。

14、第三方面，本发明提出了一种治疗用卡介苗半成品，所述治疗用卡介苗半成品重量为所述治疗用卡介苗半成品1单位重量的1倍～120倍。

15、第三方面，本发明提出了一种治疗用卡介苗半成品的冻干方法，

16、所述冻干方法为将治疗用卡介苗半成品在小于等于-40℃预冷条件下进入冻干箱，全部进箱结束后保温不超过2h，依次进行退火、升华干燥和解析干燥，结束后压塞轧盖后制得治疗用卡介苗成品。

17、进一步地，所述退火为：设置隔板温度为-10～-14℃之间任一温度进行升温，达到最终温度的时间为3h，保温1h～6.5h；然后设置隔板温度不高于-40℃进行降温，达到最终温度的时间不超过0.5h，保温3h～5h；

18、所述升华干燥为：降低冷凝器温度低于-50℃时，开始抽真空，当真空度降至30pa，调节隔板温度升温至-20℃，达到最终温度的时间为4h～5h；继续调节隔板温度至-16℃，达到最终温度的时间为2.5h～3h，保温6h～11h；真空度控制在10～20pa；

19、所述解析干燥阶段为：调节隔板温度从-16℃逐渐升温至0℃，达到最终温度的时间为3h～5h；继续按15℃/h的速率调节隔板温度升温至15℃，保温1h～2.5h；继续按24℃/h的速率升温至39℃，以上过程真空度控制在10～20pa，保温4h～9h，保温过程的真空度不高于5pa。

20、更进一步地，所述退火为：设置隔板温度为-14℃进行升温，达到最终温度的时间为3h，保温1h～6.5h；然后设置隔板温度不高于-40℃进行降温，达到最终温度的时间不超过0.5h，保温3h～5h；

21、所述升华干燥为：降低冷凝器温度低于-50℃时，开始抽真空，当真空度降至10～20pa，调节隔板温度逐渐升温至-20℃，达到最终温度的时间为4h～5h；继续调节隔板温度至-16℃，达到最终温度的时间为2.5h～3h，保温6h～11h；真空度控制在10～20pa；

22、所述解析干燥阶段为：调节隔板温度从-16℃逐渐升温至0℃，达到0℃的时间为3h～5h；继续按15℃/h的速率调节隔板温度升温至15℃，保温1h～2.5h；继续按24℃/h的速率升温至39℃，以上过程真空度控制在10～20pa，保温4h～9h，保温过程的真空度不高于5pa。

23、第五方面，本发明还提出了采用所述冻干方法制得的治疗用卡介苗成品。

24、本发明的有益效果：

25、本发明制备得到的治疗用卡介苗冻干产品的质量远高于《中国药典》三部要求的标准，经试验证明，本发明涉及的治疗用卡介苗活菌数的质量均高于《中国药典》三部要求不低于1.0×106cfu/mg的标准，5批治疗用卡介苗活菌数均值为7.36×106cfu/mg；热稳定性试验结果表明活菌率的质量均高于《中国药典》三部要求不低于25％，且不低于2.5×105cfu/mg的标准，5批治疗用卡介苗活菌率均值为49.8％，活菌数均值6.86×106cfu/mg，具有更高的初始活菌数和热稳定性，并由此有可能降低灌注剂量，缓解该类制品短缺问题。

26、本发明制备得到的治疗用卡介苗冻干产品具有更高的稳定性，连续5批治疗用卡介苗在5℃±3℃条件下放置24个月，各批残存的活菌数均值为6.24×106cfu/mg，远高于1.0×106cfu/mg，热稳定性试验的活菌率均不低于25％；在25℃±2℃条件下放置6个月，各批残存的活菌数均值为3.06×106cfu/mg；37℃±2℃条件下放置3个月，各批残存的活菌数均值为1.4×106cfu/mg，以上均不低于1.0×106cfu/mg，从而在贮存、运输及高温地区使用中保持制品质量的持续稳定性。

27、本发明制备得到的治疗用卡介苗冻干产品具有更高的有效性，经试验证明，膀胱灌注雌性c57bl/6j小鼠mb49膀胱癌细胞具有抑瘤效力，能显著抑制膀胱癌mb49细胞的增殖，较对照分散方法及冻干工艺制品，明显增强细胞免疫，显著促进小鼠脾淋巴细胞分泌bcg-ppd特异性ifn-γ、il-2细胞数的增加。

28、本发明制备得到的治疗用卡介苗冻干产品采用西林瓶的内包材，与国际主流包材接轨，具有更强的国际竞争力，经试验证明，5℃±3℃条件下放置24个月，水分含量均低于2.0％，高于《中国药典》三部要求不高于3.0％的质量标准。

29、本发明针对治疗用卡介苗的冻干程序，采用特定的冻干曲线，通过预冻(退火)、升华干燥以及解析干燥各阶段中的参数控制，使得治疗用卡介苗冻干成型好，且冻干成品符合《中国药典》三部要求。

30、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书中所指出的内容来实现和获得。