四氢咪唑并[4,5-C]吡啶衍生物作为PD-L1内在化诱导剂的制作方法

本技术关于药学活性化合物以及其组合物和使用方法。所述化合物引起pd-l1从细胞表面内在化并且可用于治疗多种疾病，包括癌症。

背景技术：

1、免疫系统在控制和消除如癌症等疾病方面起重要作用。然而，癌细胞往往发展出诸多策略来回避或抑制免疫系统以便有利于其生长。一种此类机制为改变免疫细胞上表达的共刺激和共抑制分子的表达(postow等,j.clinical oncology 2015,1-9)。已经证明阻断如程序性细胞死亡-1(pd-1)等抑制性免疫检查点的信号传导是一种有前景而且有效的治疗形态。

2、pd-1也称为cd279，是一种表达于活性t细胞、自然杀伤t细胞、b细胞和巨噬细胞上的细胞表面受体(greenwald等,annu.rev.immunol 2005,23:515-548；okazaki和honjo,trends immunol 2006,(4):195-201)。它发挥内在负反馈系统的功能，从而防止t细胞激活，这又降低了自身免疫性并且促进了自身耐受性。另外，还已知pd-1在抑制如癌症和病毒感染等疾病中的抗原特异性t细胞应答中起重要作用(sharpe等,nat immunol 2007 8,239-245；postow等,j.clinical oncol 2015,1-9)。

3、pd-1的结构由细胞外免疫球蛋白可变区样结构域以及随后的跨膜区和细胞内结构域组成(parry等,mol cell biol 2005,9543-9553)。该细胞内结构域含有位于基于免疫受体酪氨酸的抑制基序和基于免疫受体酪氨酸的转换基序中的两个磷酸化位点，这表明pd-1负调控t细胞受体介导的信号。pd-1具有两个配体，即pd-l1和pd-l2(parry等,molcell biol 2005,9543-9553；latchman等,nat immunol2001,2,261-268)，并且它们在其表达模式方面不同。pd-l1蛋白响应于脂多糖和gm-csf治疗而在巨噬细胞和树突状细胞上以及在t细胞受体和b细胞受体信号传导后在t细胞和b细胞上被上调。pd-l1还高度表达于几乎所有肿瘤细胞上，并且该表达在ifn-γ治疗之后进一步增加(iwai等,pnas2002,99(19):12293-7；blank等,cancer res 2004,64(3):1140-5)。事实上，已证明肿瘤pd-l1表达状态在多个肿瘤类型中具有预后性(wang等,eur j surg oncol 2015；huang等,oncol rep2015；sabatier等,oncotarget 2015,6(7):5449-5464)。相比之下，pd-l2表达更受限制并且主要由树突状细胞表达(nakae等,j immunol 2006,177:566-73)。pd-1与其配体pd-l1和pd-l2在t细胞上连接传递出抑制il-2和ifn-γ产生的信号以及在t细胞受体激活后诱导细胞增殖(carter等,eur j immunol 2002,32(3):634-43；freeman等,j exp med 2000,192(7):1027-34)。该机制包括募集shp-2或shp-1磷酸酶以抑制t细胞受体信号传导，如syk和lck磷酸化(sharpe等,nat immunol 2007,8,239-245)。pd-1信号传导轴激活还减弱了nf-κb和ap1途径激活以及如il-2、ifn-γ和tnf等细胞因子产生所必需的pkc-θ激活环磷酸化(sharpe等,nat immunol 2007,8,239-245；carter等,eur j immunol 2002,32(3):634-43；freeman等,j exp med 2000,192(7):1027-34)。

4、得自临床前动物研究的若干条证据表明pd-1及其配体负调控免疫应答。已经证明pd-1缺乏型小鼠罹患狼疮样肾小球性肾炎和扩张型心肌病(nishimura等,immunity 1999,11:141-151；nishimura等,science 2001,291:319-322)。使用lcmv慢性感染模型，已经证明pd-1/pd-l1相互作用抑制病毒特异性cd8 t细胞的激活、扩增和效应功能获取(barber等,nature 2006,439,682-7)。已经证明通过结合至pd-1或结合至pd-l1来阻断pd-1信号传导的抗体在治疗癌症方面有效。总的来说，这些数据支持开发旨在阻断pd-1介导的抑制性信号传导级联以便增强或“拯救”t细胞应答的治疗方法。因此，需要防止pd-1/pd-l1蛋白质/蛋白质相互作用的新化合物。

技术实现思路

1、本发明尤其提供引起细胞表面pd-l1内在化的化合物。本发明化合物可以由本文所描述的化学式和/或实施方案中的任一个来表示。减少pd-l1的细胞表面表达使得可用于与相对细胞上的pd-1发生配体接合的pd-l1减少，从而减少了由pd-1-pd-l1相互作用引起的抑制性信号传导。通过减少pd-1抑制性信号传导，本发明化合物增加了免疫应答并且可以用于治疗pd-1相关疾病或病状，如癌症。

2、在一个方面，本发明提供了一种治疗有需要的人受试者的pd-1相关疾病或病状的方法，所述方法是通过对所述人受试者施用治疗有效量的结合至细胞表面pd-l1并且诱导pd-l1内在化的化合物。

3、如本文所使用，“内在化”是指pd-l1蛋白从细胞表面转运至细胞内部。如本文所使用，如果化合物在实施例3a中所描述的cho/pd-l1内在化测定中引起pd-l1内在化或在如实施例12a中所描述的来自癌症患者的原代细胞中引起pd-l1内在化，则它诱导pd-l1内在化。在一些实施方案中，所述化合物引起至少50％(例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的细胞表面pd-l1被内在化。在一些实施方案中，如果化合物在实施例3a中所描述的mda-mb231/pd-l1内在化测定中引起pd-l1内在化，则它诱导pd-l1内在化。在一些实施方案中，如果化合物在本文的实施例中所描述的来自癌症患者的原代细胞中引起pd-l1内在化，则它诱导pd-l1内在化。

4、在一些实施方案中，所述pd-1相关疾病或病状是癌症(例如，黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、鳞状细胞癌、头颈癌、尿路上皮癌或与高微卫星不稳定性(msi高)相关的癌症)。

5、在一些实施方案中，所述pd-1相关疾病或病状是败血症。

6、在一些实施方案中，所述pd-1相关疾病或病状是病毒、细菌、真菌或寄生虫感染。

7、在另一方面，本发明提供了一种减少细胞表面pd-l1的量的方法，所述方法是通过使表达pd-l1的细胞与有效量的结合至细胞表面pd-l1并且诱导pd-l1内在化的化合物接触。

8、在另一方面，本发明提供了一种降低或减少pd-1与pd-l1的相互作用的方法，所述方法是通过使表达pd-l1的细胞与有效量的结合至细胞表面pd-l1并且诱导pd-l1内在化的化合物接触。

9、在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞(例如，单核细胞或巨噬细胞)或肿瘤细胞。

10、在另一方面，本发明提供了一种增强、刺激和/或增加有需要的人受试者的免疫应答的方法，所述方法是通过对所述人受试者施用治疗有效量的结合至细胞表面pd-l1并且诱导pd-l1内在化的化合物。

11、在一些实施方案中，所述免疫应答是t细胞免疫应答(例如，细胞毒性或效应t细胞应答)。

12、在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，施用第二治疗剂(例如，化学治疗剂、免疫调节剂或激酶抑制剂)与所述化合物的组合。

13、在另一方面，本发明提供了一种评价化合物诱导pd-l1内在化于细胞中的能力的方法，其中所述方法包括：使表达pd-l1的细胞与化合物接触；以及测定存在所述化合物时内在化于所述细胞中的pd-l1的量，与不存在所述化合物时相比较。

14、在另一方面，本发明提供了一种评价化合物诱导pd l1内在化于细胞中的能力的方法，其中所述方法包括：鉴定结合至pd-l1的化合物；使细胞与所述化合物接触；以及测定存在所述化合物时内在化于所述细胞中的pd-l1的量，与不存在所述化合物时相比较。

15、在另一方面，本发明提供了一种评价化合物诱导pd-l1二聚化以及内在化于细胞中的能力的方法，其中所述方法包括：测量化合物诱导pd-l1二聚化的能力；使表达pd-l1的细胞与所述化合物接触；以及测定存在所述化合物时内在化于所述细胞中的pd-l1的量，与不存在所述化合物时相比较。

16、在另一方面，本发明提供了一种评价化合物诱导pd-l1二聚化以及内在化于细胞中的能力的方法，其中所述方法包括：鉴定结合至pd-l1的化合物；测量所述化合物诱导pd-l1二聚化的能力；使表达pd-l1的细胞与所述化合物接触；以及测定存在所述化合物时内在化于所述细胞中的pd-l1的量，与不存在所述化合物时相比较。

17、在一些实施方案中，通过使表达pd-l1的细胞与所述化合物接触并且在将所述细胞与所述化合物一起孵育之后检测内在化于所述细胞中的pd-l1的量来测量所述化合物诱导细胞表面pd-l1内在化的能力。

18、在一些实施方案中，通过使表达pd-l1的细胞与所述化合物接触并且在将所述细胞与所述化合物一起孵育之后检测保留在所述细胞的表面上的pd-l1的量来测量所述化合物诱导细胞表面pd-l1内在化的能力。

19、在一些实施方案中，所述方法还需要将所述化合物配制成适合施用至人受试者的无菌药物组合物。

20、在一些实施方案中，所述药物组合物为片剂、丸剂、胶囊或静脉内制剂。

21、在一些实施方案中，所述药物组合物适合口服、经静脉内、经皮下施用。

22、在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，所述化合物为小分子。在一些实施方案中，所述化合物的分子量小于1000道尔顿。在一些实施方案中，所述化合物的分子量在300与700道尔顿之间。

23、在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，所述化合物诱导pd-l1内在化，其中ic50为500nm或更低。

24、在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，所述化合物诱导pd-l1内在化，其中ic50为100nm或更低。

25、在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，所述化合物诱导pd-l1内在化，其中ic50为50nm或更低。

26、可以任选地在实施例3a中所描述的全血间接内在化测定中测量内在化。

27、在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，所述化合物诱导pd-l1二聚化，并且所述二聚化发生在pd-l1内在化之前。

28、如本文所使用，如果化合物在实施例2a中所描述的pd-l1均质时间分辨荧光二聚化测定中产生在1.75至2.29的范围内的评分，则它诱导pd-l1二聚化。

29、在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，所述化合物诱导pd-l1二聚化，其中在实施例2a中所描述的pd-l1均质时间分辨荧光二聚化测定中的评分在2.0至2.2的范围内。

30、在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，所述化合物抑制pd-l1与pd-1之间的结合。在一些实施方案中，所述化合物抑制pd-l1与pd-1之间的结合，其中ic50小于10nm、小于1nm或小于0.5nm。

31、本文所提到的所有公布、专利申请、专利和其他参考文献都以引用的方式整体并入。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在存在矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。以下描述合适的方法和材料，但与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中。所述材料、方法和实施例仅为说明性的而不希望具有限制性。

32、本发明的其他特征和优点将从以下详细描述和权利要求书中显而易知。