一种原位亚单位水凝胶疫苗制剂及其制备方法和应用

本发明涉及医药，尤其是涉及一种原位亚单位水凝胶疫苗制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、疫苗是预防sars-cov-2感染的最有效策略，因为我们自身的免疫系统是防止病毒感染的最重要的防线。sars-cov-2变种高突变率、无症状传播率和缺乏有效治疗手段使病毒传播难以控制，因此部署安全和有效的疫苗来终止sars-cov-2感染及切断病毒传播是必不可少的。

2、sars-cov-2含有许多蛋白质目标候选物，在s蛋白的各个区域中，位于s1亚单位的受体结合域rbd蛋白是开发疫苗的良好候选者，通过与宿主细胞上血管紧张素转化酶2(ace2)受体相互作用进而在病毒进入细胞中发挥重要作用。此外，rbd蛋白的制造效率高，高度稳定。鉴于rbd蛋白在病毒/细胞相互作用中的重要性，在b细胞和t细胞水平上的免疫原性以及在受感染病人中诱导中和抗体的能力，疫苗开发中将其作为抗原成分的主要靶点。然而rbd的免疫原性较低，通过免疫佐剂cpg odn来提高其免疫应答效力，即使使用较低剂量的抗原，也能提高疫苗接种所引起的免疫反应的程度、质量和持久性。然而，rbd和佐剂cpg odn在给药后都因机体快速地清除机制而出现短的半衰期，导致抗原的暴露时间较短，往往不足以引起强大的免疫反应。若能单次接种后实现rbd抗原和佐剂cpg odn的可控持续递送，诱导高浓度和持久的中和抗体，将极大提高亚单位疫苗的有效力和耐用性，有效帮助建立人群免疫屏障，阻断病毒变异，尽早结束疫情。因此，开发能够提高亚单位疫苗可控释放的递送平台是当下的迫切需求。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了克服现有疫苗技术存在的缺陷而提供一种原位亚单位水凝胶疫苗制剂及其制备方法和应用，现有新型冠状病毒疫苗存在依赖冷链、多次接种、毒副作用大等问题，本发明通过构建一种超分子多肽水凝胶用于递送亚单位疫苗，制备一种安全性好、稳定性高、载药量高的水凝胶疫苗递释体系，从而实现亚单位疫苗组分的可控和长效递送，诱导高浓度和持久的中和抗体，从而有效预防sars-cov-2的感染及传播。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、一种超分子多肽水凝胶载体，通过以下方法得到：由多肽在溶剂中自组装形成纳米纤维，进而在生理环境中形成超分子多肽水凝胶载体；

4、多肽分子序列如下包括但不限于：kkfkfefef，aeaeakakaeaeakak，agedqlkhvfs，fffrgdr，fkfefkff，fefefkfk，fhfdfhfd，gv2q2hkd，ggvvvrgdr，gsfsiqytyhv，ikvav，kfkfefkfe，ikvkikvkvpptkikvkik，kyfil，k2(ql)6k2，k2(sl)6k2，k(sl)6kgprklydy，vkvkvpptkvkvkvkvkvkv，kldlpvgligkldl，k2w(ql)6k2，knefkaafdi，kfdlkkdlkldl，rgdsrgds，radaradaradarada，fmoc-ffvpgvgqgk，vltkvktkvplptkvevkvlv，fmoc-ffrgd，fmoc-frgdf，nap-gffygrgd，nap-gffygrgdh。

5、一种原位亚单位水凝胶疫苗制剂，包括上述超分子多肽水凝胶载体和负载在超分子多肽水凝胶载体上的亚单位疫苗组分；所述亚单位疫苗组分包括抗原、佐剂和免疫调节剂。

6、本发明还提供一种原位亚单位水凝胶疫苗制剂的制备方法，具体步骤如下：

7、s1、合成自组装多肽；

8、s2、将步骤s1中得到的自组装多肽溶于溶剂中，得到自组装纳米纤维溶液；

9、s3、将亚单位疫苗组分添加到步骤s2中得到的自组装纳米纤维溶液中孵育，再在生理环境中形成原位亚单位水凝胶疫苗制剂。

10、进一步地，步骤s1中，所述自组装多肽通过固相合成法得到。

11、进一步地，步骤s1中，所述自组装多肽分子序列如下包括但不限于：kkfkfefef，aeaeakakaeaeakak，agedqlkhvfs，fffrgdr，fkfefkff，fefefkfk，fhfdfhfd，gv2q2hkd，ggvvvrgdr，gsfsiqytyhv，ikvav，kfkfefkfe，ikvkikvkvpptkikvkik，kyfil，k2(ql)6k2，k2(sl)6k2，k(sl)6kgprklydy，vkvkvpptkvkvkvkvkvkv，kldlpvgligkldl，k2w(ql)6k2，knefkaafdi，kfdlkkdlkldl，rgdsrgds，radaradaradarada，fmoc-ffvpgvgqgk，vltkvktkvplptkvevkvlv，fmoc-ffrgd，fmoc-frgdf，nap-gffygrgd，nap-gffygrgdh；

12、其中，a丙氨酸，d天门冬氨酸，e谷氨酸，f苯丙氨酸，g甘氨酸，h组氨酸，i异亮氨酸，k赖氨酸，l亮氨酸，n天门冬酰胺，p脯氨酸，q谷氨酰胺，r精氨酸，s丝氨酸，t苏氨酸，v缬氨酸，w色氨酸，y酪氨酸。

13、进一步地，步骤s2中，所述溶剂选自水、生理盐水或磷酸盐缓冲液。

14、进一步地，步骤s2中，所述自组装多肽在溶剂中的浓度为1-100mm。

15、进一步地，步骤s3中，所述孵育温度为4-50℃，所述孵育时间为0-3h。

16、进一步地，步骤s3中，所述亚单位疫苗组分包括抗原、佐剂和免疫调节剂。

17、上述更进一步地，所述疫苗抗原包括但不限于rbd蛋白、s蛋白、s1蛋白、s2蛋白、n蛋白、e蛋白、m蛋白。

18、上述更进一步地，所述疫苗佐剂包括但不限于cpg odn、cpg 1018、poly(i:c)、r837、r848、mf59、as03、as01b、mpla、adu-s100、mavu-140、gsk3745417、imsa-101、mk-1454、e7766、sb11285、bms-986301、sr-717lithium、msa-2、c-di-gmp、c-di-amp、tautomerism、3',3'-cgamp、2',3'-cgamp、hg381、明矾、脂多糖、铝盐。

19、上述更进一步地，所述免疫调节剂包括但不限于gm-csf、il-2、ifn-α、ifn-γ、ifn-β、cxcl-9、cxcl-10、cxcl-11、sotigalimab、cifurtilimab、tecaginlimab、cdx-1140、yh-003、amg-994、sl-172154、il-12、il-21、il-22、ccl27、ccl28、qs-21。

20、上述更进一步地，所述疫苗组分抗原为rbd蛋白，所述rbd质量为0.001-50mg；

21、所述疫苗佐剂为cpg odn，所述cpg odn质量为0.001-50mg；

22、所述免疫调节剂为gm-csf，所述gm-csf质量为0.001-50mg。

23、此外，本发明还提供一种原位亚单位水凝胶疫苗制剂的应用，由上述原位亚单位水凝胶疫苗制剂在制备终止sars-cov-2感染及阻断病毒传播的疫苗中的应用。

24、进一步地，所述sars-cov-2包括但不限于wild、alpha、beta、gamma、delta、omicron、b.1.1.7、b.1.351、p.1、b.1.617.2、b.1.1.529、ba.2、ba.1、ba.1.1、ba.3、ba.4、ba.5。

25、水凝胶是一类能实现可控递送疫苗组分的极具潜力的“智能”药物递送载体，具有可调节的机械性能和良好的生物相容性，其中自组装多肽构建的超分子水凝胶因具有良好的安全性，生物降解性，易制备及功能性而受到广泛的关注，其能够实现多组分的共同递送，控制有效载荷的释放并防止不希望的免疫反应发生。

26、本发明涉及一种原位亚单位水凝胶疫苗，通过局部递送可以增加疫苗组分在接种部位的滞留，并控制和持续释放疫苗组分，在提高药物浓度和生物利用度同时，大大降低疫苗组分在血液中的暴露时间，减少其毒副作用。

27、本发明基于超分子多肽自组装体可以实现其在生理条件下的即时“溶液-凝胶”转变，以液体状态直接皮下接种，然后原位发生相转变，形成水凝胶疫苗制剂。

28、与现有技术相比，本发明有益效果如下：

29、(1)本发明运用超分子多肽的“溶液-凝胶”转变特性，以溶液态接种后，在注射部位触发形成超分子亚单位水凝胶疫苗(rcg/kkfe8)，构建原位药物储库，控制疫苗组分(rbd、cpg odn和gm-csf)的缓慢和持久释放并防止不希望的免疫反应发生；

30、(2)本发明制备的水凝胶疫苗可作为“人工三级淋巴结构”，在接种部位招募和编程免疫细胞，激活的免疫细胞进一步迁移到淋巴结，诱导高滴度的结合和中和抗体，阻断病毒和ace2的识别从而有效预防sars-cov-2的感染；

31、(3)本发明制得的原位亚单位水凝胶疫苗制剂制备简易、给药便捷且易于运输和保存，为疫苗的运输、储存、接种提供了有利条件。