SEC14样蛋白及同源配体的纳米球

本发明涉及纳米球及制备其的方法和所述纳米球的用途，所述纳米球包含相等数目的人sec14样蛋白和所述sec14样蛋白的同源配体。

背景技术：

1、sec14基因产物sec14p首先是在酵母酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)中鉴定出的，其用作使磷脂酰肌醇从高尔基体到质膜的转移蛋白。sec14蛋白中的结构域的x射线结构揭示了具有用于脂质结合的疏水口袋的特征性α-β-α夹心。sec14p对于通过将脂质信号传导事件与涉及囊泡出芽的蛋白质整合的来自跨高尔基体网络的分泌囊泡的生物发生是必需的。sec14p(sfh2、sfh3、sfh4和sfh5)的酵母同源物通过调节ptdins激酶和磷脂酶d活性和通过促进磷酸肌醇生成来实现互补功能(lli,x.等，mol biol cell.2000 11：1989-2005和其中引用的参考文献)。

2、在高等真核生物中，酵母sec14p的功能同源物构成具有相关功能的sec14样蛋白家族(peterman,t.k.等，plant physiol.2004 136：3080-3094)。interpro综合数据库(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)的蛋白质序列分析和分类预测了sec14样蛋白家族的所有成员共同具有来源于cralbp的主要结构和三重功能trio蛋白的特征性cral-trio(ipr001251)结构域。cral-trio结构域代表用于螯合小亲脂性分子的结构支架(panagabkoc等，biochemistry 2003 42：6467-6474和其中引用的参考文献)。该结构域可以构成sec14样蛋白的全部或仅其一部分。cral-trio-only蛋白如sec14p、cralbp或α-ttp已被鉴定为分别用于磷脂酰肌醇、11-顺式视黄醛和α-生育酚(α-tol)的膜间转移的细胞溶质因子(panagabko c等，biochemistry2003 42：6467-6474和其中引用的参考文献)。

3、α-生育酚转移蛋白(α-ttp)是一种胞质32kda蛋白，其促进亲脂性维生素e分子通过亲水介质转运并被生物体吸收。它属于已知参与脂质调节的sec14样蛋白家族(panagabko c等，biochemistry 200342：6467-6474；l.aravind等，curr.biol.1999 9：195-197和其中引用的参考文献)。折叠由构成结合腔底部的五条平行的β-股线、可变数目的α-螺旋和在羧基末端区域的可移动螺旋门组成，其允许亲脂性同源配体进入结合口袋(stocker a.ann ny acad sci.20014 1031：44-59；meier r等，j mol biol 2003 331：725-734)。α-ttp在大鼠和人中均已分离，其主要在肝中表达，但其也存在于胎盘中和脑中(kaempf-rotzoll等，placenta 2003 24,439-444和其中引用的参考文献)。α-ttp在调节肝细胞中的维生素e中起关键作用，并且对生物体的健康至关重要，因为其不良表达或突变与aved遗传疾病的发生直接相关(ouahchi k.等，nat.genet.1995 9：141-145)。

4、在1987年，细胞视黄醛结合蛋白(cralbp)被鉴定为对9-顺式-视黄醛(kd＝53nm)、11-顺式-视黄醛(kd＝20nm)和11-顺式-视黄醇(kd＝60nm)具有纳摩尔亲和力的高亲和力结合剂(saari jc和bredberg dl，j biol chem.1987 262：7618-22)。同一研究表明cralbp不结合13-顺式或全反式-视黄醛。cralbp的另一功能是通过其保护其同源顺式同源配体免受过早异构化的能力而给出的。cralbp还增加视觉周期的视黄醛通量，即从全反式-视黄醛到11-顺式-视黄醛的眼睛的生化再生途径。在该途径中，cralb刺激rpe65的异构酶活性(p.d.kiser等，2015nature chemical biology 11：409-415)并且促进11-顺式视黄醇结合到rdh5脱氢酶中(gamble mv1等，j lipid res.1999 40：2279-92)。最后，其确保通过未知机制将来自rdh5的11-顺式-视黄醛转移通过细胞质移出细胞。表征人cralbp的基因突变可以表明该蛋白质对于棒和锥中的有效暗适应是必需的(m.s.brstedt等，2003visionres.43：2559-2571)。

5、sec14样clavesin 1和2都只在神经元中表达。这些蛋白质是胞质的，但也通过它们的cral-trio结构域通过与内体膜中丰富的磷脂酰肌醇3,5-二磷酸相互作用而结合到内体/溶酶体区室(katoh y等，j biol chem.2009 284：27646-54)。clavesin富含网格蛋白包被的囊泡，在那里它们与网格蛋白重链和衔接蛋白-1(网格蛋白包被的囊泡的主要外壳成分)形成复合物。使用干扰rna的慢病毒递送在神经元中异构体特异性击倒clavesin表明对晚期内体/溶酶体形态学的独特神经元特异性调节(katoh y等，j biol chem.2009 284：27646-54)。

6、sec14样蛋白如α-ttp和cralbp以低纳摩尔亲和力结合特定的天然同源配体。这样的同源配体与血浆隔离，并被选择为克服阻碍不溶性脂质的自由扩散的热力学屏障(cohn,w.,am j clin nutr 199969：156-157)。cralbp介导的眼内11-顺式视黄醛转移对于持续视力是必不可少的(m.s.brstedt等，2003vision res.43：2559-2571)。α-ttp通过选择性保留α-维生素e、具有最高抗氧化能力的维生素e异构体而对维生素e体内平衡至关重要(kono,n.和arai,h.traffic2015 16：19-34)。

7、众多可遗传的疾病与sec14样蛋白相关。据报道，ttpa的人α-ttp基因产物中的缺陷导致具有孤立维生素e缺乏症的常染色体隐性共济失调(aved)的表型(ouahchi k.等，nat.genet.1995 9：141-145)。该疾病的特征在于维生素e的血浆水平检测不到或显著降低、脊髓小脑变性、共济失调、无反射和本体感觉丧失。具有相关神经表型的共济失调的另一种形式是由atcay的sec14样caytaxin基因产物中的突变引起的(bomar j.m.等，nat.genet.2003 35：264-269)。rlbp1基因的cralbp基因产物中的缺陷导致严重的视网膜病变(maw m.a.等，1997nat.genet.17：198-200)。

技术实现思路

1、本发明涉及惊人发现，是以前未知的具有它们的同源配体的sec14样蛋白家族的纳米球聚集体、其制备方法及其用途。

2、因此，本发明的第一方面提供纳米球，其包含相等数目的(i)人sec14样蛋白、和(ii)所述sec14样蛋白的同源配体，优选由其组成。优选地，所述相等数目为3至60，进一步优选地，所述相等数目为9至60。在本发明的非常优选的实施方式中，所述人sec14样蛋白选自(a)α-生育酚转移蛋白(α-ttp)；(b)细胞视黄醛结合蛋白(cralbp)；(c)clavesin1(clvs1)；(d)clavesin2(clvs2)；和(e)α-生育酚转移蛋白样(ttpal)。

3、在另一方面，本发明提供生产本发明的纳米球的方法和本发明的纳米球的用途。

4、因此，在另一方面，本发明提供制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的(i)人sec14样蛋白、和(ii)所述sec14样蛋白的同源配体，优选由其组成，其中所述方法包括以下步骤：(a)在水溶液i中提供所述sec14样蛋白，其中所述溶液i中所述sec14样蛋白的浓度为1μm至5mm，并且其中所述溶液i的ph为6至9，并且其中优选所述溶液i包含盐，其中所述盐的浓度为10mm至500mm；(b)在溶液ii中提供所述sec14样蛋白的同源配体，其中所述溶液i中所述sec14样蛋白的同源配体的浓度为5μm至500mm，并且其中所述溶液ii的溶剂为水溶性溶剂；(c)通过组合所述溶液i和所述溶液ii以产生溶液iii，其中所述溶液iii中所述sec14样蛋白的浓度与所述sec14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4：1至1：4(摩尔/摩尔)，并且其中所述溶液iii中所述水溶性溶剂的体积为0.5-8％(体积/体积)；(d)使所述sec14样蛋白和所述sec14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球；(e)从所述溶液iii中分离所述纳米球；(f)任选地纯化所述纳米球。

5、再一方面，本发明提供制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的(i)人sec14样蛋白、和(ii)所述sec14样蛋白的同源配体，优选由其组成；其中所述方法包括以下步骤：(a)在水溶液i中提供所述sec14样蛋白，其中所述溶液i中所述sec14样蛋白的浓度为1μm至5mm，并且其中所述溶液i的ph为6到9；(b)在水溶液ii中提供所述sec14样蛋白的同源配体，其中所述溶液i中所述sec14样蛋白的同源配体的浓度为5μm至500mm；并且其中所述溶液ii包含洗涤剂；(c)通过组合所述溶液i和所述溶液ii以产生溶液iii，其中所述溶液iii中所述sec14样蛋白的浓度与所述sec14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4：1至1：4(摩尔/摩尔)；(d)从所述溶液iii中去除所述洗涤剂，其中从所述溶液iii中去除所述洗涤剂使所述sec14样蛋白和所述sec14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球；(e)从所述溶液iii中分离所述纳米球；(f)任选地纯化所述纳米球。

6、再一方面，本发明提供制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的(i)人sec14样蛋白、和(ii)所述sec14样蛋白的同源配体，优选由其组成；其中所述方法包括以下步骤：(a)在水溶液i中提供所述sec14样蛋白，其中所述溶液i中所述sec14样蛋白的浓度为1μm至5mm，并且其中所述溶液i的ph为6至9，并且其中优选所述溶液i包含盐，其中所述盐的浓度为10mm至500mm；(b)在溶液ii中提供所述sec14样蛋白的同源配体，其中所述溶液i中所述sec14样蛋白的同源配体的浓度为5μm至500mm，并且其中所述溶液ii的溶剂为水溶性溶剂；(c)通过组合所述溶液i和所述溶液ii以产生溶液iii，其中所述溶液iii中所述sec14样蛋白的浓度与所述sec14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4：1至1：4(摩尔/摩尔)，并且其中所述溶液iii中所述水溶性溶剂的体积为0.5-8％(体积/体积)；(d)使所述sec14样蛋白和所述sec14样蛋白的所述同源配体形成由所述sec14样蛋白之一和所述sec14样蛋白的所述同源配体之一组成的单体复合物；(e)从所述溶液iii中分离所述单体复合物；(f)任选地纯化所述单体复合物；(g)产生水溶液iv，其中所述溶液iv包含所述单体复合物，并且其中所述溶液iv中所述单体复合物的浓度为5mg/ml至50mg/ml；并且其中所述溶液iv的ph为6至9，并且其中优选所述溶液iv包含盐，其中所述盐的浓度为10mm至500mm；(h)使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体。

7、再一方面，本发明提供制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的(i)人sec14样蛋白、和(ii)所述sec14样蛋白的同源配体，优选由其组成；其中所述方法包括以下步骤：(a)在水溶液i中提供所述sec14样蛋白，其中所述溶液i中所述sec14样蛋白的浓度为1μm至5mm，并且其中所述溶液i的ph为6到9；(b)在水溶液ii中提供所述sec14样蛋白的同源配体，其中所述溶液i中所述sec14样蛋白的同源配体的浓度为5μm至500mm；并且其中所述溶液ii包含洗涤剂；(c)通过组合所述溶液i和所述溶液ii以产生溶液iii，其中所述溶液iii中所述sec14样蛋白的浓度与所述sec14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4：1至1：4(摩尔/摩尔)；(d)从所述溶液iii中去除所述洗涤剂，其中从所述溶液iii中去除所述洗涤剂使所述sec14样蛋白和所述sec14样蛋白的所述同源配体形成由所述sec14样蛋白之一和所述sec14样蛋白的所述同源配体之一组成的单体复合物；(e)从所述溶液iii中分离所述单体复合物；(f)任选地纯化所述单体复合物；(g)产生水溶液iv，其中所述溶液iv包含所述单体复合物，并且其中所述溶液iv中所述单体复合物的浓度为5mg/ml至50mg/ml，并且其中所述溶液iv的ph为6至9，并且其中优选所述溶液iv包含盐，并且其中所述盐的浓度为10mm至500mm；(h)使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体。

8、再一方面，本发明提供药物组合物，其包含(a)本发明的纳米球；和(b)药学上可接受的载体。

9、再一方面，本发明提供本发明的纳米球或药物组合物在治疗或预防、优选治疗具有维生素e缺乏症的共济失调(aved)、肌肉营养不良、低脂血症、低脂蛋白血症、血脂异常、人类不育症、伤口愈合受损或炎性疾病的方法中的用途，其中优选所述炎性疾病为关节炎。

10、具体地，本发明涉及以下各项：

11、1、一种纳米球，其包含相等数目的：

12、(i)人sec 14样蛋白，和

13、(ii)所述sec 14样蛋白的同源配体，

14、所述纳米球优选由以上组成。

15、2、根据第1项所述的纳米球，其中所述相等数目为3至60。

16、3、根据第1或2项所述的纳米球，其中所述人sec14样蛋白选自：

17、(a)α-生育酚转移蛋白(α-ttp)；

18、(b)细胞视黄醛结合蛋白(cralbp)；

19、(c)clavesin1(clvs1)；

20、(d)clavesin2(clvs2)；和

21、(e)α-生育酚转移蛋白样(ttpal)。

22、4、根据第1至3项中任一项所述的纳米球，其中所述人sec14样蛋白是α-生育酚转移蛋白(α-ttp)。

23、5、根据第5项所述的纳米球，其中所述相等数目为24。

24、6、根据第4或5项所述的纳米球，其中所述α-生育酚转移蛋白(α-ttp)的所述同源配体是生育酚，其中优选所述生育酚是α-生育酚，并且其中进一步优选所述α-生育酚是r,r,r-α-生育酚。

25、7、根据第1至3项中任一项所述的纳米球，其中，所述sec14样蛋白是细胞视黄醛结合蛋白(cralbp)。

26、8、根据第7项所述的纳米球，其中所述cralbp的所述同源配体是顺式-视黄醇或顺式-视黄醛，其中优选所述顺式-视黄醇或所述顺式-视黄醛选自9-顺式-视黄醛、11-顺式-视黄醛、9,13-二顺式-视黄醛、9-顺式-视黄醇、11-顺式-视黄醇和9,13-二顺式-视黄醇。

27、9、根据第1至8项中任一项所述的纳米球，其中所述sec14样蛋白包含氨基酸序列，其中所述sec14样蛋白的所述氨基酸序列包含：

28、(a)与seq id no：3的位置56对应的位置上的选自l和i的氨基酸残基；

29、(b)与seq id no：3的位置61对应的位置上的氨基酸残基f；

30、(c)与seq id no：3的位置63对应的位置上的选自l、v、q、h和y的氨基酸残基；

31、(d)与seq id no：3的位置67对应的位置上的选自w、y、f和l的氨基酸残基；

32、(e)与seq id no：3的位置70对应的位置上的氨基酸残基l；或

33、(f)与seq id no：3的位置74对应的位置上的选自y、v、f和h的氨基酸残基；

34、其中所述sec14样蛋白的所述氨基酸序列包含至少两个、优选至少三个、进一步优选至少四个、再进一步优选至少五个所述氨基酸残基(a)-(f)中的任一者；

35、并且其中优选地，为所述纳米球所包含的所述数目的sec14样蛋白中第一个sec14样蛋白的所述氨基酸序列的(a)-(f)中的任一者的至少四个氨基酸残基结合为所述纳米球所包含的所述数目的sec14样蛋白中第二和第三个sec14样蛋白的所述氨基酸序列的(a)-(f)中的任一者的至少四个氨基酸残基。

36、10、一种制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的：

37、(i)人sec14样蛋白，和

38、(ii)所述sec14样蛋白的同源配体，

39、所述纳米球优选由以上组成，

40、其中所述方法包括以下步骤：

41、(a)在水溶液i中提供所述sec14样蛋白，其中所述溶液i中所述sec14样蛋白的浓度为1μm至5mm，并且其中所述溶液i的ph为6至9，并且其中优选所述溶液i包含盐，其中所述盐的浓度为10mm至500mm；

42、(b)在溶液ii中提供sec14样蛋白的所述同源配体，其中所述溶液i中sec14样蛋白的所述同源配体的浓度为5μm至500mm，并且其中所述溶液ii的溶剂为水溶性溶剂；

43、(c)通过组合所述溶液i和所述溶液ii产生溶液iii，其中所述溶液iii中所述sec14样蛋白的浓度与所述sec14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4：1至1：4(摩尔/摩尔)，并且其中所述溶液iii中所述水溶性溶剂的体积为0.5-8％(体积/体积)；

44、(d)使所述sec14样蛋白和所述sec14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球；

45、(e)从所述溶液iii中分离所述纳米球；

46、(f)任选地纯化所述纳米球。

47、11、一种制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的：

48、(i)人sec14样蛋白，和

49、(ii)所述sec14样蛋白的同源配体，

50、所述纳米球优选由以上组成；

51、其中所述方法包括以下步骤：

52、(a)在水溶液i中提供所述sec14样蛋白，其中所述溶液i中所述sec14样蛋白的浓度为1μm至5mm，并且其中所述溶液i的ph为6到9；

53、(b)在水溶液ii中提供sec14样蛋白的所述同源配体，其中所述溶液i中sec14样蛋白的所述同源配体的浓度为5μm至500mm；并且其中所述溶液ii包含洗涤剂；

54、(c)通过组合所述溶液i和所述溶液ii产生溶液iii，其中所述溶液iii中所述sec14样蛋白的浓度与所述sec14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4：1至1：4(摩尔/摩尔)；

55、(d)从所述溶液iii中去除所述洗涤剂，其中从所述溶液iii中去除所述洗涤剂使所述sec14样蛋白和所述sec14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球；

56、(e)从所述溶液iii中分离所述纳米球；

57、(f)任选地纯化所述纳米球。

58、12、一种制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的：

59、(i)人sec14样蛋白，和

60、(ii)所述sec14样蛋白的同源配体，

61、所述纳米球优选由以上组成；

62、其中所述方法包括以下步骤：

63、(a)在水溶液i中提供所述sec14样蛋白，其中所述溶液i中所述sec14样蛋白的浓度为1μm至5mm，并且其中所述溶液i的ph为6至9，并且其中优选所述溶液i包含盐，其中所述盐的浓度为10mm至500mm；

64、(b)在溶液ii中提供sec14样蛋白的所述同源配体，其中所述溶液i中sec14样蛋白的所述同源配体的浓度为5μm至500mm，并且其中所述溶液ii的溶剂为水溶性溶剂；

65、(c)通过组合所述溶液i和所述溶液ii产生溶液iii，其中所述溶液iii中所述sec14样蛋白的浓度与所述sec14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4：1至1：4(摩尔/摩尔)，并且其中所述溶液iii中所述水溶性溶剂的体积为0.5-8％(体积/体积)；

66、(d)使所述sec14样蛋白和所述sec14样蛋白的所述同源配体形成由所述sec14样蛋白之一和所述sec14样蛋白的所述同源配体之一组成的单体复合物；

67、(e)从所述溶液iii中分离所述单体复合物；

68、(f)任选地纯化所述单体复合物；

69、(g)产生水溶液iv，其中所述溶液iv包含所述单体复合物，并且其中所述溶液iv中所述单体复合物的浓度为5mg/ml至50mg/ml；并且其中所述溶液iv的ph为6至9，并且其中优选所述溶液iv包含盐，并且其中所述盐的浓度为10mm至500mm；

70、(h)使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体。

71、13、一种制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的：

72、(i)人sec14样蛋白，和

73、(ii)所述sec14样蛋白的同源配体，

74、所述纳米球优选由以上组成；

75、其中所述方法包括以下步骤：

76、(a)在水溶液i中提供所述sec14样蛋白，其中所述溶液i中所述sec14样蛋白的浓度为1μm至5mm，并且其中所述溶液i的ph为6到9；

77、(b)在水溶液ii中提供sec14样蛋白的所述同源配体，其中所述溶液i中sec14样蛋白的所述同源配体的浓度为5μm至500mm；并且其中所述溶液ii包含洗涤剂；

78、(c)通过组合所述溶液i和所述溶液ii产生溶液iii，其中所述溶液iii中所述sec14样蛋白的浓度与所述sec14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4：1至1：4(摩尔/摩尔)；

79、(d)从所述溶液iii中去除所述洗涤剂，其中从所述溶液iii中去除所述洗涤剂使所述sec14样蛋白和所述sec14样蛋白的所述同源配体形成由所述sec14样蛋白之一和所述sec14样蛋白的所述同源配体之一组成的单体复合物；

80、(e)从所述溶液iii中分离所述单体复合物；

81、(f)任选地纯化所述单体复合物；

82、(g)产生水溶液iv，其中所述溶液iv包含所述单体复合物，并且其中所述溶液iv中所述单体复合物的浓度为5mg/ml至50mg/ml，并且其中所述溶液iv的ph为6至9，并且其中优选所述溶液iv包含盐，并且其中所述盐的浓度为10mm至500mm；

83、(h)使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体。

84、14、一种药物组合物，其包含：

85、(a)根据第1至9项中任一项所述的纳米球；和

86、(b)药学上可接受的载体。

87、15、根据第1至9项中任一项所述的纳米球或根据第14项所述的药物组合物在治疗或预防、优选治疗具有维生素e缺乏症的共济失调(aved)、肌肉营养不良、低脂血症、低脂蛋白血症、血脂异常、人类不育症、伤口愈合受损或炎性疾病的方法中的用途，其中优选所述炎性疾病为关节炎。

88、随着该说明书的进行，本发明的其它方面和优选实施方式将变得明显。