中药组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及中药领域，尤其涉及中药组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.新型冠状肺炎(covid-19)给全球各国造成了严重经济负担和医疗负担。而且，随着新冠肺炎病毒奥密克戎亚型的流行和传播，全球新冠肺炎患者又见新高，新冠肺炎的治疗已迫在眉睫。虽然目前已有一些单克隆抗体及抗病毒小分子用于临床治疗，但都有一定的副作用，且价格十分昂贵。
3.covid-19是一种由新型冠状病毒(sars-cov-2)引起的疾病，sars-cov-2通过与肺上皮细胞表面的ace2受体结合，进而侵入人体，并造成感染。当人体为了对抗病毒感染发生炎症时，细胞因子(例如il6等)会浸润到肺部，进而造成肺上皮细胞的炎症和损伤。
4.此外，covid-19发生过程中，sars-cov-2引发的高炎症反应是当前重症患者致病的主要原因。巨噬细胞作为免疫系统先天免疫中最重要的细胞之一，在机体抵御病毒感染的过程中发挥着重要作用。它们主要通过产生炎症介质来去除病原体和修复组织损伤来响应病毒抗原。然而，在由sars-cov-2引起的急性呼吸窘迫综合征病例中，其功能的异常改变(例如细胞因子风暴)可能对宿主非常有害。而且，sars-cov-2刺激的炎症反应已经影响了身体的其他重要器官，包括肺、心脏等。在感染过程中，单核细胞和巨噬细胞可能参与过敏反应和加重反应，导致组织损伤，尤其是肺损伤导致其功能障碍和呼吸障碍。当病毒侵染细胞后，病毒表面蛋白或释放到细胞质内的核酸，都能作为抗原引起细胞先天免疫信号通路被激活，比如toll-like receptor signalingpathway，nod-like receptor signaling pathway等，进而引起下游nf-kappab signalingpathway、jak-stat signalingpathway等通路被激活，造成细胞因子白介素6(il6)，肿瘤坏死因子(tnf)，白介素1b(il1b)等上调，而这些细胞因子又会进一步与细胞表面受体结合，引起其它基因的表上调，如：stat3、mapk8、cd4、adar、nfkb1、rela、nlrp3、adam17、tlr2、keap1、tlr8、f3、oas1、tlr4、stat1、il1r1；恶性循环，最终造成人体细胞因子风暴。因此，开发一款疗效确作、机制清晰、价格低廉的中药复方对新冠治疗来说意义非凡。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了中药组合物及其制备方法和应用。本发明提供的中药组合物的功能主治为：疏风解毒、芳香化湿。适用于无症状感染者及轻型、普通型新型冠状病毒肺炎的治疗，临床表现为感染sars-cov-2后引发的咳嗽、发热、乏力、咽痛等。本发明还提供了中药组合物在抗炎方面的作用，以及在新型冠状病毒肺炎治疗和辅助治疗方面的应用。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了中药组合物，以重量份数计，包括如下组分：
[0008][0009]
在本发明的一些实施方案中，上述中药组合物，以重量份数计，包括如下组分：
[0010][0011]
本发明还提供了上述中药组合物的制备方法，取配方量的所述组分粉碎，醇提，收集提取液。
[0012]
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述收集提取液后还包括浓缩和/或冷冻干燥的步骤。
[0013]
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述浓缩的温度为50～80℃，浓缩比为10:1；所述冷冻干燥的压强为10～1000pa，温度为-110～-50℃，冷冻时间为24h。
[0014]
具体的，在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述浓缩的温度为56℃，浓缩比为10:1；所述冷冻干燥的压强为10pa，温度为-55℃，时间为24h。
[0015]
本发明还提供了上述中药组合物和/或上述制备方法获得的中药组合物在制备预防、治疗和/或辅助治疗新型冠状病毒肺炎的药物和/或制剂中应用。
[0016]
本发明还提供了上述中药组合物和/或上述制备方法获得的中药组合物在制备调
控和/或抑制与新型冠状病毒肺炎有关的细胞因子和/或基因表达的药物和/或制剂中的应用。
[0017]
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述细胞因子和/或基因包括：tnf、stat3、mapk8、cd4、adar、nfkb1、rela、nlrp3、adam17、tlr2、keap1、tlr8、il6、f3、oas1、tlr4、il1b、stat1或il1r1中的一种或多种。
[0018]
本发明还提供了药物、药物组合或制剂，包括上述中药组合物和/或上述制备方法获得的中药组合物以及药学上可接受的辅料。
[0019]
在本发明的一些实施方案中，上述药物、药物组合或制剂中所述药物组合包括上述中药组合物和/或上述制备方法获得的中药组合物及其他任意有效成分。
[0020]
在本发明的一些实施方案中，上述药物、药物组合或制剂的剂型包括：内服汤剂、片剂或丸剂中的一种或多种。
[0021]
本发明提供了中药组合物及其制备方法和应用，该中药组合物，以重量份数计，包括如下组分：连翘3～30份、豨莶草4～20份、大黄1～30份、木蝴蝶1～10份、苍术1～20份、厚朴1～20份、石菖蒲1～20份、牛蒡子3～20份、荆芥穗2～20份、甘草1～20份、百部1～20份、陈皮1～20份和生姜1～20份。
[0022]
本发明的有益效果包括：
[0023]
(1)本发明提供的中药组合物疏风解毒、芳香化湿。中药组合物中连翘清热解毒、疏散风热，豨莶草祛风解毒，牛蒡子疏散风热，解毒利咽，用之为君药。大黄清热泻火，凉血解毒，助连翘、豨莶草清热解毒之功；荆芥穗解表散风，强方剂疏风之效；木蝴蝶清肺利咽，与牛蒡子共筑方剂利咽之功效，三药合用为臣药。苍术燥湿健脾，厚朴燥湿消痰，石菖蒲化湿开胃，与连翘、豨莶草、牛蒡子、大黄联用，解湿毒疫疠之气；百部润肺下气止咳，陈皮健脾化痰，共筑方剂化痰止咳之功效，共为佐药。生姜解表散寒，可引药达表；甘草清热解毒，祛痰止咳，又能调和诸药，共为使药。诸药合用，共奏清热解毒、疏散风热之效。
[0024]
(2)本发明提供了具有抗炎功能的中药组合物，每味药单独提取有效成分，开发一种具有抑制细胞因子风暴相关基因表达的药物，并从细胞分子水平阐明了其作用效果，以期应用于新型冠状病毒肺炎疾病的治疗或辅助治疗。
[0025]
(3)本发明提供的中药组合物的功能主治为：疏风解毒、芳香化湿。适用于无症状感染者及轻型、普通型新型冠状病毒肺炎的治疗，临床表现为感染sars-cov-2后引发的咳嗽、发热、乏力、咽痛等。
[0026]
(4)本发明提供的中药组合物能够抑制细胞因子风暴相关的多个基因表达，且不同配比的中药组合物均能够抑制炎症因子表达，方剂作用机制清晰。
附图说明
[0027]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0028]
图1示方剂中药物对新型冠状病毒肺炎相关基因的调控结果；
[0029]
其中：从左至右依次为：厚朴、豨莶草、苍术、木蝴蝶、百部、陈皮、连翘、甘草、大黄、牛蒡子、石菖蒲、荆芥穗、生姜；
[0030]
从上到下依次为：tnf、stat3、mapk8、cd4、adar、nfkb1、rela、nlrp3、adam17、tlr2、
keap1、tlr8、il6、f3、oas1、tlr4、il1b、stat1、il1r1；
[0031]
图2示不同配比中药组合物对新型冠状病毒肺炎相关基因的调控；
[0032]
其中：从左至右依次为配比1～配比11；从上到下依次为：tnf、cd4、il6、stat3、mapk8、f3、adar、oas1、nfkb1、rela、tlr2、stat1、adam17、tlr8、il1r1、tlr4、il1b、keap1、nlrp3；
[0033]
图3示现有技术组合物与本中药组合物对新型冠状病毒肺炎相关基因的调控；
[0034]
其中：从左至右依次为本中药组合物和现有技术组合物；从上到下依次为：tnf、cd4、il6、adar、tlr8、stat1、tlr4、il1r1、nlrp3、f3、oas1、adam17、stat3、nfkb1、il1b、mapk8、rela、keap1、tlr2；
[0035]
图4示缺药后的中药组合物对新型冠状病毒肺炎相关基因的调控；
[0036]
其中：从左至右依次为：本中药组合物、本中药组合物缺木蝴蝶、本中药组合物缺豨莶草以及本中药组合物同时缺木蝴蝶、豨莶草；从上到下依次为：tnf、cd4、il1r1、tlr4、il1b、keap1、adar、tlr2、il6、mapk8、nfkb1、stat3、rela、nlrp3、adam17、tlr8、f3、oas1、stat1；
[0037]
图5示实施例6中的qpcr结果，其中新冠治疗方指的是实施例3中配比10的组合物。
具体实施方式
[0038]
本发明公开了中药组合物及其制备方法和应用。
[0039]
应该理解，表述
“……
中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
[0040]
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
[0041]
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
[0042]
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
[0043]
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
[0044]
本发明中药提取物的制备、提取物对pma(佛波酯)诱导的thp1细胞的调控及基因调控验证试验中，所用原料及试剂均可由市场购得。
[0045]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0046]
实施例1组方各中药提取物的制备
[0047]
中药提取物的制备方法：将配方中连翘、豨莶草、大黄、木蝴蝶、苍术、厚朴、石菖蒲、牛蒡子、荆芥穗、甘草、百部、陈皮、生姜分别粉碎成90目粉末，对每味药称量10g药物饮片粉末，加150ml的90％乙醇水溶液，标准索氏提取3h，提取液在56度烘箱中浓缩20min至体积为2ml，浓缩比为10，浓缩液被转移至冻干机减压冻干24h，制成提取物冻干粉，13味药分别提取得到13个药物冻干粉，冻干温度在-55℃，压强10pa。
[0048]
实施例2提取物对pma(佛波酯)诱导的thp1细胞的调控
[0049]
(1)将实施例1获得的提取物冻干粉溶解于dmso当中，得到20mg/ml中药提取物母液；
[0050]
(2)将thp1细胞4000个/孔铺板于384孔板当中，同时加入100ng/ml pma(佛波酯)诱导thp1贴壁，成为巨噬细胞，37℃培养48h；
[0051]
(3)将步骤(1)获得的13个中药提取物母液分别加入细胞当中，每种药物终浓度为100μg/ml；对照组加入等体积dmso，一共14组在37℃培养24h；
[0052]
(4)将14组细胞裂解，检测tnf、stat3、mapk8、cd4、adar、nfkb1、rela、nlrp3、adam17、tlr2、keap1、tlr8、il6、f3、oas1、tlr4、il1b、stat1、il1r1等基因表达，基因介绍见表1。
[0053]
(5)检测方法为：
[0054]
1)65℃5min，实现rna变性，利用链霉素偶联的磁珠吸附生物素标记的rna；
[0055]
2)45℃1h完成退火，使每一个基因的上游探针和下游探针(序列信息见表2)退火到相应rna上；
[0056]
3)利用磁力架吸附rna，完成清洗；
[0057]
4)37℃1h，实现连接，退火到rna上的上游和下游基因探针被连接成一个完整的核酸链；
[0058]
5)利用磁力架吸附核酸链，完成清洗；
[0059]
6)65℃，8min，实现释放，核酸链从磁珠上被释放下来；
[0060]
7)以核酸链为模板进行pcr扩增，实现建库；
[0061]
8)二代测序。
[0062]
(6)数据处理：测序结果使用bowtie2进行比对，差异基因表达分析使用deseq2完成，以溶剂对照dmso处理组为对照组，药物处理组的基因变化倍数≥1.5倍或≤0.67，p值《0.05定义为基因表达被显著变化。结果如图1和表3所示，其中数据展示了13种中药在pma诱导的thp1细胞上对19个关键基因的表达影响情况，图1的蓝色深浅表示基因被药物下调程度，每个色块对应表3中的具体数值，即某个药物下调某个基因的log2fc。
[0063]
表1检测基因与新型冠状病毒肺炎的关联调研
[0064][0065]
表2 19个新型冠状病毒肺炎相关基因探针序列
[0066]
[0067]
[0068][0069]
表3中药组合物中每味药对新型冠状病毒肺炎相关基因的下调log2fc
[0070]
[0071][0072]
结果如图1和表3所示，厚朴可以特异性下调两个炎症转录因子nfkb1和rela；豨莶草特异性下调新冠相关基因adam17；苍术特异性下调关键细胞因子il1b和tlr4；木蝴蝶特异性下调tlr8，防止细胞因子风暴，同时辅助豨莶草下调nlrp3；百部特异性下调tlr2；tlr家族基因为toll like信号通路上游基因，抑制表达可防止细胞因子风暴；陈皮特异性下调keap1，从而防止过度氧化应激，减轻细胞因子风暴；连翘特异性下调2个covid-19关键基因f3和oas1，同时与豨莶草、牛蒡子一起下调covid-19关键细胞因子il6；甘草特异性下调细胞因子受体il1r1，缓解炎症；大黄特异性下调炎症相关细胞因子stat1，减轻炎症；荆芥穗特异性下调covid-19关键基因adar，能够分别与石菖蒲一起下调covid-19关键基因cd4、与豨莶草、生姜一起下调核心细胞因子tnf；生姜特异性下调covid-19关键基因stat3与mapk8。多药联用，分别从多个方面抑制细胞因子风暴，治疗covid-19，且每味药作用特殊，均不可缺少。
[0073]
实施例3不同配比的中药组合物在pma(佛波酯)诱导的thp1细胞上对新型冠状病毒肺炎相关基因的调控
[0074]
根据实施例2的实验结果，按表4所示11种配比计算中药组合物对新冠相关基因的调控情况，结果见表5和图2。11种配比的中药组合物均能够对新型冠状病毒肺炎相关基因进行调控，其中配比10对所有基因的调控作用相对更强。
[0075]
表4不同配比的中药组合物称量重量
[0076][0077]
表5不同配比中药组合物对新型冠状病毒肺炎相关基因的调控
[0078]
[0079][0080]
实施例4对比现有技术组合物与本中药组合物对新冠相关基因的调控
[0081]
根据实施例2的实验结果，以一个现有的中药组合物(鱼腥草、野菊花、牛蒡子、砂仁、干姜、苍术、茯苓、金荞麦、炙甘草、白茅根等比配制)为例，分别将组方中单个药物对基因调控的log2fc相加，计算得到整个组方对基因调控的log2fc，得到表6和图3。
[0082]
如表6和图3所示，现有技术的中药组合物(各味药等比配制)在本专利讨论的19个与新冠肺炎相关的基因调控上，抑制了tnf、cd4、il6、adar、tlr8、stat1、tlr4、il1r1、nlrp3、f3、oas1、adam17、stat3、nfkb1等14个基因表达，但上调了另外的il1b、mapk8、rela、keap1、tlr2等5个基因表达，而本中药组合物可以抑制全部基因表达，由此证明本中药组合物相较于现有技术组合物的优势。
[0083]
表6现有技术组合物与本中药组合物对新型冠状病毒肺炎相关基因调控的log2fc
[0084]
本中药组合物现有技术组合物tnf-11.891-4.937cd4-8.817-3.402il6-6.891-4.058adar-4.360-3.262
tlr8-4.144-3.259stat1-2.441-3.920tlr4-3.326-3.326il1r1-3.135-3.254nlrp3-4.647-8.850f3-2.032-7.866oas1-2.598-6.076adam17-5.048-0.733stat3-5.177-1.903nfkb1-4.967-1.427il1b-3.3071.388mapk8-5.6290.635rela-5.0731.299keap1-4.1648.629tlr2-4.3414.352
[0085]
实施例5本中药组合物缺药后对新型冠状病毒肺炎相关基因的调控效果
[0086]
根据实施例2的实验结果，分别将组方中单个药物对基因的调控fc相乘，计算得到整个组方对基因的调控fc，再进一步转化成log2fc得到表7和图4，本中药组合物缺少木蝴蝶后，原组成治疗方能够抑制的与新冠相关的tlr8基因无法再被下调，且对新冠相关的nlrp3基因抑制效果被削弱；本中药组合物缺少豨莶草后，原组成治疗方能够抑制的与新冠相关的adam17基因无法再被下调，且对新冠相关的tnf、il6及nlrp3等3个基因的抑制效果均被削弱。
[0087]
因此，随机缺少木蝴蝶或(和)豨莶草后的中药组合物，对新冠相关基因调控不如原组成中药组合物(划线部分)，证明本中药组合物中每味药物作用的独特性。
[0088]
表7缺药后的中药组合物对新型冠状病毒肺炎相关基因的调控
[0089]
[0090][0091]
实施例6利用qpcr技术，发现配比10的中药组合物对il-1b基因的表达影响
[0092]
以thp1细胞为例，thp1是人单核细胞系，在pma作用下可体外诱导分化为巨噬细胞。在正常情况下，巨噬细胞的炎症因子表达量处于一个很低的水平。在新冠肺炎炎症发生过程中，巨噬细胞表达的炎症因子水平迅速升高，我们用lps诱导巨噬细胞分泌大量炎症因子，旨在模拟人体内炎症发生的病态过程，即lps组。在lps诱导的基础上，再加入实施例3中表4所示的配比10的中药组合物加以“治疗”，结果显示细胞表达的炎症水平又降低到正常水平。
[0093]
具体实验过程为：
[0094]
(1)thp1细胞以40万/孔铺于12孔板中，同时加入100ng/ml pma处理细胞24h，将细胞诱导为巨噬细胞；
[0095]
(2)加入终浓度为100μg/ml的实施例3中表4所示的配比10的中药组合物，同时设置溶剂对照组；
[0096]
(3)向培养基中加入终浓度1μg/ml lps刺激炎症发生，与药物共同处理细胞24h。
[0097]
(4)利用试剂盒(品牌appliedbiosystems，货号4387406)提取rna并反转为cdna。
[0098]
(5)qpcr反应，程序：95℃，3min；(95℃，3s；60℃，30s)40个循环。
[0099]
其中，引物序列如表8所示；
[0100]
表8引物序列
[0101][0102]
(6)数据处理：以溶剂对照组的基因表达量为1，lps组与药物处理组基因表达量大于1为基因表达上调，小于1为下调。
[0103]
qpcr结果显示，与溶剂对照组相比，lps组炎症因子il-1b表达上调，在配比10的中
药组合物作用后，il-1b基因的表达下调，结果如表9和图5所示。
[0104]
表9qpcr结果
[0105][0106]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。