一种功能性多模态SERS纳米探针及其制备方法和应用

本发明属于生命科学，涉及一种功能性多模态sers纳米探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤是严重危害全世界人类健康的重要疾病，循环肿瘤细胞(circulatingtumor cells,ctcs)是自发或者因诊疗操作由实体瘤亦或转移灶释放进入外周血循环系统中的肿瘤细胞，是引发肿瘤转移的必要条件，ctcs的检测作为一种重要的体外液体活检技术具有快速、简便、动态、实时检测等优点，可以大大缩短从检查到治疗的时间，为乳腺癌、肺癌、食管癌、宫颈癌及肝癌等实体瘤患者早诊、早治和个体化诊疗提供高度可行性且高信息含量的新型诊断手段。

2、表面增强拉曼散射(sers)是基于贵金属或金属化合物纳米结构的局域等离子共振，对拉曼信号显著增强的现象，可增强106-1010倍，sers光谱技术具有选择性好、灵敏度高、无光漂白、抗干扰、快速无损等优点，在环境分析和生物医学领域中有着广泛的应用。但是用于检测ctcs的具有表面增强拉曼散射功能的纳米材料普遍存在检测灵敏度低且要求待检液具有较高的待检癌细胞浓度的问题，这无疑在一定程度上限制了循环肿瘤细胞的高效检测。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中的不足，提供一种功能性多模态sers纳米探针及其制备方法和应用。

2、本发明的一个目的通过以下技术方案来实现：

3、一种功能性多模态sers纳米探针，所述功能性多模态sers纳米探针从内到外依次包括：磁性颗粒、拉曼/荧光信号分子层、高分子层、靶向抗体层；

4、磁性颗粒为过渡金属掺杂的铁基纳米粒子。

5、作为优选，过渡金属为锌、钛、钴、镍、锰、钒、铬中的一种或多种；铁基纳米粒子为铁纳米粒子、氧化铁纳米粒子、四氧化三铁纳米粒子中的一种或多种。

6、作为优选，过渡金属与铁的摩尔比为1：(0.01～1000)。进一步优选为1：(0.1～100)，进一步优选为1：(1～10)。

7、作为优选，过渡金属为锌和钴，锌和钴的摩尔比为1：(0.1-10)。

8、作为优选，过渡金属为锌和锰，锌和锰的摩尔比为1：(0.1-10)。

9、锌和钴，或者，锌和锰双掺杂铁基纳米粒子时，获得的sers纳米探针具有更好的性能。

10、作为优选，磁性颗粒的粒径为1～1000nm。

11、作为优选，磁性颗粒的粒径为1、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000nm中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

12、所述拉曼/荧光信号分子层为连接在磁性颗粒表面的拉曼/荧光信号分子形成的层状结构，作为优选，拉曼/荧光信号分子为同时具有荧光和拉曼性质的物质，包括但不限于ir783、ir780、3,3'-二乙基硫代三碳菁碘化物(dttc)、罗丹明、结晶紫、茜素红、耐尔蓝中的一种或多种。

13、所述高分子层为包覆在拉曼/荧光信号分子层表面的高分子形成的层状结构；作为优选，所述高分子为聚多巴胺、牛血清白蛋白、聚乙二醇中的一种或多种。

14、所述靶向抗体层为偶联在高分子层表面的抗体形成的层状结构，作为优选，所述抗体为肿瘤标志物的抗体，肿瘤标志物可列举为肿瘤细胞、蛋白标志物、外泌体、ctdna等。

15、作为优选，所述磁性颗粒、拉曼/荧光信号分子层、高分子层、靶向抗体层的质量比为1～1200：1～2000：1～1000：0.01～500。

16、本发明的功能性多模态sers纳米探针与肿瘤细胞具有优异结合性，结合后可以通过磁场实现功能性多模态sers纳米探针与肿瘤细胞的快速富集，有利于提高肿瘤细胞的检测灵敏性和准确性。

17、本发明的另一个目的通过以下技术方案来实现：

18、一种功能性多模态sers纳米探针的制备方法，包括以下步骤：

19、s1、获得磁性颗粒；

20、s2、将拉曼/荧光信号分子连接在磁性颗粒表面形成拉曼/荧光信号分子层，得到磁性颗粒ii；

21、s3、将高分子包覆在拉曼/荧光信号分子层表面形成高分子层，得到磁性颗粒iii；

22、s4、将抗体偶联在高分子层表面形成靶向抗体层，得到功能性多模态sers纳米探针。

23、作为优选，步骤s1中，将铁盐和过渡金属盐的溶液与碱性无机物、长烷基链有机酸和极性有机溶剂形成的溶液混合，进行反应得到初始磁性颗粒，并进行转相，获得磁性颗粒。由此制备的磁性颗粒具有sers性能。

24、铁盐包括但不限于氯化铁、氯化亚铁、硫酸铁、硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、硝酸铁、硝酸亚铁中的一种或多种。

25、过渡金属盐包括但不限于过渡金属的氯盐、过渡金属的硫酸盐、过渡金属的硝酸盐中的一种或多种。

26、碱性无机物包括但不限于氢氧化钡、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钠和氨水等；长烷基链有机酸包括但不限于油酸、十八酸、十六酸、十四酸、十二酸等；极性有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇等极性大的有机溶剂。

27、铁盐和过渡金属盐的溶液为铁盐和过渡金属盐溶于水中形成的溶液。铁盐和过渡金属盐的溶液中，铁盐的浓度为2～200mmol/l。

28、碱性无机物、长烷基链有机酸和极性有机溶剂形成的溶液为碱性无机物加入到长烷基链有机酸和极性有机溶剂中形成，每克碱性无机物加入到1～100ml长烷基链有机酸和1～100ml极性有机溶剂中。

29、作为优选，铁盐和过渡金属盐的溶液与碱性无机物、长烷基链有机酸和极性有机溶剂形成的溶液的体积比为1：10～10：1。

30、作为优选，将铁盐和过渡金属盐的溶液与碱性无机物、长烷基链有机酸和极性有机溶剂形成的溶液混合，进行反应，反应温度为100～500℃，反应时间为1～50h。

31、作为优选，反应时间为1、2、3、5、8、10h中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

32、可选地，所述反应温度100、200、250、300、350、400、450、500℃中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

33、作为优选，转相包括以下步骤：将初始磁性颗粒和柠檬酸加入有机溶剂中，室温搅拌1～50h。

34、在后续步骤中，需要将磁性颗粒分散于水中进行反应，本发明在制备磁性颗粒时，通过转相反应，将纳米粒子从油相转成水相，提高纳米粒子在水中的分散性，提高磁性颗粒的sers性能。

35、可选地，搅拌时间为5、8、10、15、20h中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

36、有机溶剂可列举为氯仿、n,n-二甲基甲酰胺、三氯甲烷、四氯化碳、甲酰胺、dmso、四氢呋喃、吡啶等。

37、作为优选，步骤s2中，将拉曼/荧光信号分子溶液和磁性颗粒溶液混合，搅拌获得磁性颗粒ii。

38、拉曼/荧光信号分子溶液为拉曼/荧光信号分子溶于有机溶剂中形成，但凡能溶解拉曼/荧光信号分子的有机溶剂均可。磁性颗粒溶液为磁性颗粒分散于水中形成。

39、作为优选，拉曼/荧光信号分子溶液的浓度为0.001～10000000mmol；磁性颗粒溶液的浓度为0.0001～800000mg/ml。

40、作为优选，拉曼/荧光信号分子溶液的浓度为0.01、0.1、1、5、10、30、50、80、100、1000、100000mmol中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。磁性颗粒溶液的浓度为0.001、0.01、0.1、1、5、10、30、50、80、800、8000mg/ml中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

41、作为优选，拉曼/荧光信号分子溶液和磁性颗粒溶液的体积比为1:1000～10:1。进一步优选，体积比为1:500～1:1，进一步优选，体积比为1:500～1:100。

42、作为优选，搅拌获得磁性颗粒ii的搅拌时间为0.1～10h。作为优选，搅拌时间为0.5、1、3、5、8h中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

43、作为优选，步骤s3中，将磁性颗粒ii溶液、乙醇、氨水混合搅拌，然后加入高分子溶液，反应得到磁性颗粒iii；

44、磁性颗粒ii溶液为磁性颗粒ii分散于水中形成，作为优选，磁性颗粒ii溶液的浓度为0.01～10mg/ml，作为优选，磁性颗粒ii溶液的浓度为0.01、0.1、0.3、0.5、1、3、5mg/ml中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

45、高分子溶液为高分子溶于水中形成，作为优选，高分子溶液的浓度为1～100mg/ml。可选地，高分子溶液的浓度为1、20、30、40、50、60、100mg/ml中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

46、作为优选，磁性颗粒ii溶液、乙醇、氨水、高分子溶液的体积比为5～55：2～16：0.3～1.5：0.4～10。

47、作为优选，磁性颗粒ii溶液、乙醇、氨水混合搅拌的时间1～100min。可选地，搅拌的时间为1、10、20、30、50、80、100min中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

48、作为优选，反应得到磁性颗粒iii的反应时间为1～10h。可选地，反应时间为1、3、5、8、10h中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

49、作为优选，步骤s4中，将含有磁性颗粒iii、缓冲液、抗体的溶液混合搅拌，得到所述功能性多模态sers纳米探针。

50、作为优选，所述缓冲液包括但不限于tris-hcl溶液、氨水碱性溶液中的至少一种。

51、作为优选，磁性颗粒iii的质量mg：缓冲液的体积ml：抗体的质量μg为0.0005～1000：0.001～10000：0.0001～5000。进一步优选，磁性颗粒iii的质量mg：缓冲液的体积ml：抗体的质量μg为0.05～100：0.01～1000：0.001～500；进一步优选，磁性颗粒iii的质量mg：缓冲液的体积ml：抗体的质量μg为0.5～10：0.1～100：0.01～50。

52、作为优选，将含有磁性颗粒iii、缓冲液、抗体的溶液混合搅拌时间为0.1～72h，温度为1～80℃。优选地，搅拌时间为1、2、10、12、15、20、30、50、72h中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。优选地，搅拌温度为15、20、25、30、35、40℃中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

53、本发明的另一个目的通过以下技术方案来实现：

54、上述功能性多模态sers纳米探针在sers检测、荧光检测、核磁共振检测的一种或多种中的应用。实现纳米探针的单模态、双模态或多模态的应用。

55、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

56、1、本发明提供的功能性多模态sers纳米探针能够在sers检测、荧光检测、核磁共振检测中的任意一种或多种中应用，实现纳米探针的多模态应用；

57、2、本发明提供的功能性多模态sers纳米探针能够有效结合肿瘤细胞；

58、3、本发明提供的功能性多模态sers纳米探针与肿瘤细胞结合后，可以通过磁场实现功能性多模态sers纳米探针与肿瘤细胞的快速富集，有利于提高肿瘤细胞的检测灵敏性和准确性；

59、4、本发明采用过渡金属掺杂的铁基纳米粒子作为磁性颗粒，构建的sers纳米探针相对于铁基纳米粒子具有更好的sers增强效应；

60、5、本发明可以进一步采用两种或者两种以上的过渡金属掺杂的铁基纳米粒子，由此构建的sers纳米探针相对于单一过渡金属掺杂具有更好的性能；

61、6、本发明在制备磁性颗粒时，通过转相反应，将纳米粒子从油相转成水相，提高纳米粒子在水中的分散性，有利于后续反应进行。