一种纳米抗体-多价鼠李糖缀合物及其制备方法和应用

本发明属于生物制药工程，具体涉及一种纳米抗体-多价鼠李糖缀合物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、纳米抗体被视为新一代抗体药物的重要代表。相对于传统的单克隆抗体，纳米抗体具有很多明显的优势，例如分子量小，生产制备成本低，渗透性强，免疫原性低等优点，因此在肿瘤等疾病的诊疗中得到了广泛的应用。但是纳米抗体无传统单克隆抗体的fc端，不能通过fc端介导的免疫效应功能，如抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(adcc)、抗体依赖细胞介导的吞噬作用(adcp)和补体依赖的细胞毒作用(cdc)，来杀伤肿瘤细胞；另一方面，纳米抗体不能与新生儿fcrn受体结合进入fcrn介导的循环系统，且分子量小，导致半衰期极短(大约10分钟左右)。这些不足因素严重限制了纳米抗体作为生物药的广泛应用。

2、目前，使用抗体基因工程技术将纳米抗体与人源或者鼠源的fc片段融合表达，可有效克服纳米抗体的上述缺陷。然而，不足之处是，抗体基因工程技术比较复杂，纳米抗体-fc融合蛋白生产成本高，稳定性差，而且具有潜在的免疫原性，影响其肿瘤免疫治疗效果。

3、近年来，人体的血清中发现一些天然存在的抗体，这类抗体可以特异性识别并结合一些小分子半抗原如2，4-二硝基苯(dnp)、α-gal以及鼠李糖(rha)等。前期研究表明通过将这些半抗原与具有肿瘤细胞靶向功能的分子进行耦合，靶向分子可以将半抗原锚定在细胞上并募集游离的抗半抗原抗体，进而激活人体的免疫系统对靶细胞进行杀伤。如将单价半抗原dnp或rha通过蛋白定点修饰技术偶联到纳米抗体上，可在一定程度上赋予纳米抗体介导免疫效应功能的能力，并改善纳米抗体的半衰期。然而不足之处是：单价半抗原与天然内源性抗体的结合亲和力低，募集天然抗体的能力不足，影响了抗肿瘤活性。基于此，发展新型策略开发出抗肿瘤活性更强的纳米抗体药物，具有重要意义。

技术实现思路

1、发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种纳米抗体-多价鼠李糖缀合物及其制备方法和应用，具体是一种修饰有多价鼠李糖分子的纳米抗体，并通过对多价鼠李糖分子中鼠李糖数目的优化，提供一种优化后的多价鼠李糖分子，使得经该分子修饰的纳米抗体具备明显优于现有临床单抗，以及其他已报道纳米抗体的肿瘤治疗效果。

2、技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、本发明的一个目的是，提供一种纳米抗体-多价鼠李糖缀合物，由纳米抗体分子被多价鼠李糖分子修饰得到，所述缀合物包括修饰有多价鼠李糖分子的纳米抗体，所述的多价鼠李糖分子为鼠李糖分子的多价形式，所述多价鼠李糖分子可选择性募集人体血清中存在的天然抗体。

4、进一步的，本发明所述的抗体为纳米抗体，优选为一些发展成熟的纳米抗体。包括但不限于抗egfr纳米抗体、抗egfrviii纳米抗体、抗her2纳米抗体、抗her3纳米抗体、抗psma纳米抗体、抗vegfr纳米抗体、抗pd-l1纳米抗体、抗cmet纳米抗体、抗tgf-β纳米抗体、抗muc1纳米抗体和抗trop-2纳米抗体其中任意一种。

5、进一步的，本发明所述多价鼠李糖分子为可选择性募集人体血清中鼠李糖特异性抗体的分子，即所述的多价鼠李糖分子为鼠李糖分子的多价形式。

6、进一步的，所述多价鼠李糖分子包括二价鼠李糖分子或四价鼠李糖分子或八价鼠李糖分子或十六价鼠李糖分子，结构式如下：

7、二价鼠李糖分子或

8、四价鼠李糖分了或

9、八价鼠李糖分了或

10、十六价鼠李糖分子

11、进一步的，所述多价鼠李糖分子的合成路径为：

12、二价鼠李糖分子的合成：

13、

14、四价鼠李糖分子的合成：

15、

16、八价鼠李糖分子的合成：

17、

18、十六价鼠李糖分子的合成：

19、

20、本发明所涉及的多价半抗原及其合成方法、纳米抗体分子等如前所述。

21、本发明的第二个目的是，提供一种制备以上所述的纳米抗体-多价鼠李糖缀合物的方法，该方法包括将多价鼠李糖分子修饰到纳米抗体上。

22、进一步的，所述缀合物的制备过程如下所示：

23、

24、进一步的，所述将多价鼠李糖分子修饰到纳米抗体分子上制备纳米抗体-多价鼠李糖缀合物的方法，其中的修饰方法包括酶法修饰法或化学酶法定点修饰法。

25、更进一步的，所述制备纳米抗体-多价鼠李糖缀合物的酶法定点修饰具体包括以下步骤：

26、1)将纳米抗体脱盐置换到酶反应缓冲液中；

27、2)加入10-50倍当量的多价鼠李糖分子，1/10-1/2当量的srta酶(或srta突变体)进行反应，反应完毕后用亲和层析法去除未反应的纳米抗体，srta酶(或srta突变体)等。

28、3)超滤法或排阻色谱法除去多余的多价鼠李糖分子，得到相应的纳米抗体-多价鼠李糖缀合物。

29、本发明的第三个目的是，提供所述的纳米抗体-多价鼠李糖缀合物，或所述的方法，在制备肿瘤免疫治疗药物领域的应用。特别的，在一些对现有临床使用单克隆抗体不敏感，或已经产生耐药性的肿瘤中的应用。

30、进一步的，所述纳米抗体-多价鼠李糖缀合物用于制备肿瘤免疫治疗药物，所述肿瘤免疫治疗药物为药学上可接受的形式。

31、进一步的，所述肿瘤免疫治疗药物的制剂形式包括注射剂、粉针剂、片剂、缓释剂、滴丸、颗粒剂、胶囊剂和缓释微丸其中任意一种。

32、在本发明的一种具体实施方式中，所选抗体分子为抗egfr的纳米抗体7d12(seqid no.1)，egfr在乳腺癌、结直肠癌、肺癌等多种癌细胞中都有高表达，但在正常细胞中表达量很低，研究表明egfr的高表达与病人的不良预后和过短生存期相关，因此egfr被认为是肿瘤治疗的理想靶点之一。优化后的半抗原分子为含有16个鼠李糖的nh2-ggg-peg2-(rha)16。所选制备方法为：将纳米抗体7d12脱盐置换到酶反应缓冲液中；加入25倍当量的多价鼠李糖分子，1/4当量的增强型srta酶进行反应，反应完毕后镍离子螯合磁珠去除未反应的7d12和增强型srta酶；超滤法或排阻色谱法除去多余的多价鼠李糖分子，得到相应的纳米抗体-多价鼠李糖缀合物。

33、有益效果：本发明相对于现有技术的优势：

34、(1)本发明所述的纳米抗体-多价鼠李糖缀合物，与现有报道抗体相比，一方面纳米抗体亲和水平未受到抑制；另一方面，通过多价鼠李糖的多价呈递可以显著提高纳米抗体缀合物的内源性抗体募集水平及相应的抗肿瘤活性。从而在治疗时可以降低纳米抗体药物的使用剂量，最终在一定程度上减少或避免一些毒副作用的产生。

35、(2)本发明所提供的优化后的多价鼠李糖分子，其所对应的纳米抗体-多价鼠李糖缀合物具备比单价鼠李糖分子修饰的纳米抗体-单价鼠李糖缀合物，以及临床使用的单克隆抗体更加突出抗肿瘤活性。

36、(3)本发明所提供的纳米抗体-多价鼠李糖缀合物，可应用于一些对现有临床单克隆抗体不敏感，或产生耐药性肿瘤的治疗。