Feimin在调节糖稳态中的用途

feimin在调节糖稳态中的用途
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，特别涉及分泌蛋白feimin在调节糖稳态中的用途，及其与胰岛素联用后调节糖稳态的用途。


背景技术：

2.哺乳动物的血糖在4-7mm范围内，但在进食和禁食后会有上下波动。这种机体自身精妙的控制，归因于各组织之间的动态调控(肠道吸收葡萄糖，脂肪组织和骨骼肌摄取葡萄糖以及肝脏、肾脏和肠道产生葡萄糖)。而糖稳态失调则会导致低血糖或高血糖。众所周知，高血糖是糖尿病的标志，糖尿病是世界上最常见的代谢性疾病之一。而脂肪组织和骨骼肌葡萄糖摄取减弱，以及肝脏中葡萄糖生成增强是糖尿病患者高血糖的主要原因。
3.在机体内，激素通过协调不同组织吸收和产生葡萄糖来维持葡萄糖的稳态。禁食时，胰岛分泌胰高血糖素，与其他激素一起促进糖原分解和糖异生，产生葡萄糖以供应机体能量。进食后，胰岛素通过刺激葡萄糖转运蛋白slc2a4(glut4)从细胞内位置转运到脂肪组织和骨骼肌细胞表面，来促进葡萄糖的摄取。同时，胰岛素信号也关闭了糖原分解和糖异生，以减少葡萄糖的产生。机体的胰岛素抵抗或缺乏使葡萄糖的动态平衡失调，从而使空腹和餐后血糖水平升高。
4.目前，胰岛素及其类似物被广泛用于治疗糖尿病的高血糖。寻找餐后激素虽然具有挑战性，但是对于治疗包括糖尿病在内的与血糖升高相关的疾病具有重要生物学作用。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供治疗包括糖尿病在内的与血糖升高相关的疾病的方法。发明人出人意料地发现，分泌蛋白feimin在调节糖稳态方面发挥着重要作用，其和胰岛素联用后能显著降低血糖水平，从而可有效地预防/或治疗与血糖升高相关的疾病，特别是糖尿病。发明人还发现，与健康人相比，糖尿病人在禁食和进食状态下feimin水平明显升高，表明了feimin蛋白可以用作与血糖升高相关的疾病，特别是糖尿病的诊断标志物。
6.相应地，在一方面，本发明提供了一种降低受试者中的血糖水平的方法，其包括向所述受试者施用有效量的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的步骤。
7.在另一方面，本发明提供了一种促进受试者中的葡萄糖摄取的方法，其包括向所述受试者施用有效量的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的步骤。
8.在又一方面，本发明提供了一种抑制受试者中的葡萄糖生成的方法，其包括向所述受试者施用有效量的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的步骤。
9.在另一方面，本发明提供了一种增加受试者对胰岛素的敏感性的方法，其包括向所述受试者施用有效量的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片
段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的步骤。
10.在又一方面，本发明提供了一种治疗受试者中与血糖升高相关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的步骤。
11.在本发明的方法的实施方案中，所述feimin蛋白或其功能性片段是人feimin蛋白或其功能性片段。
12.在一些实施方案中，所述核酸是dna或rna。
13.在一些实施方案中，所述表达载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、逆转录病毒载体、质粒、dna载体、mrna载体、基于转座子的载体和人工染色体。
14.在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、胰岛素抵抗症、葡萄糖耐量减低、血脂异常、凝血功能异常、肝脂肪、肝硬化、高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死、心血管疾病、冠心病、脑血栓、脑出血、骨质疏松、炎性肠病、消化不良和胃溃疡。
15.在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病为糖尿病。
16.在一些实施方案中，所述糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。
17.在本发明的治疗方法的实施方案中，所述方法还包括施用第二治疗剂的步骤，优选地，所述第二治疗剂选自蛋白质或肽、核酸和小分子药物。
18.在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病为糖尿病，且所述第二治疗剂选自抗糖尿病药物。
19.在一些实施方案中，所述抗糖尿病药物选自双胍类(例如，二甲双胍)；促胰岛素分泌剂(例如，磺脲类(例如格列吡嗪、格列齐特、格列喹酮、格列本脲、格列美脲)、瑞格列奈、那格列奈)；α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，伏格列波糖、阿卡波糖)；胰岛素增敏剂(例如，曲格列酮、罗格列酮、比格列酮)；和胰岛素或胰岛素类似物。
20.在一些实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物为牛、猪或人胰岛素或胰岛素类似物。
21.在一些实施方案中，所述胰岛素为长效、中效、短效胰岛素或其任意组合。
22.在一些实施方案中，所述第二治疗剂在所述feimin蛋白或其功能性片段、所述核酸或所述表达载体之前、之后或同时施用。
23.在一些实施方案中，所述受试者为人。
24.在一些实施方案中，所述受试者是胰岛素抵抗的，例如所述受试者具有抗胰岛素抗体、glut4基因突变、葡萄糖激酶基因突变、胰岛素受体基因突变、胰岛素受体底物基因突变中的一种或多种。
25.在另一方面，本发明提供了一种诊断受试者的与血糖升高相关的疾病的方法，其包括以下步骤：
26.a.从所述受试者获得血液样品，
27.b.确定所述样品中feimin蛋白的水平，
28.其中与健康对照相比，所述样品中feimin蛋白水平的升高指示所述受试者具有患与血糖升高相关的疾病的风险。
29.在本发明的诊断方法的实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病选自糖尿病、肥
胖症、高血糖症、胰岛素抵抗症、葡萄糖耐量减低、血脂异常、凝血功能异常、肝脂肪、肝硬化、高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死、心血管疾病、冠心病、脑血栓、脑出血、骨质疏松、炎性肠病、消化不良和胃溃疡。
30.在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病为糖尿病。
31.在一些实施方案中，所述糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。
32.在一些实施方案中，所述血液样品选自血液、血清和血浆。
33.在一些实施方案中，在步骤b中，通过选自以下的方法来确定所述样品中feimin蛋白的水平：质谱方法、荧光检测方法、化学发光方法、elisa测定、western印迹、放射免疫分析、免疫组化染色、多重免疫试验和斑点印迹试验。
34.在一些实施方案中，通过抗feimin蛋白抗体来确定所述样品中feimin蛋白的水平。
35.在又一方面，本发明提供了组合物，其包含feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体，和药学上可接受的载剂或赋形剂。
36.在一些实施方案中，所述组合物用于以下中的一种或多种：
37.1)降低受试者中的血糖水平；
38.2)促进受试者中的葡萄糖摄取；
39.3)抑制受试者中的葡萄糖生成；
40.4)增加受试者对胰岛素的敏感性；
41.5)治疗受试者中与血糖升高相关的疾病。
42.在一些实施方案中，所述feimin蛋白或其功能性片段是人feimin蛋白或其功能性片段。
43.在一些实施方案中，所述组合物还包含第二治疗剂，优选地，所述第二治疗剂选自蛋白质或肽、核酸和小分子药物。
44.在一些实施方案中，所述第二治疗剂选自抗糖尿病药物。
45.在一些实施方案中，所述抗糖尿病药物选自双胍类(例如，二甲双胍)；促胰岛素分泌剂(例如，磺脲类(例如格列吡嗪、格列齐特、格列喹酮、格列本脲、格列美脲)、瑞格列奈、那格列奈)；α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，伏格列波糖、阿卡波糖)；胰岛素增敏剂(例如，曲格列酮、罗格列酮、比格列酮)；和胰岛素或胰岛素类似物。
46.在一些实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物为牛、猪或人胰岛素或胰岛素类似物。
47.在一些实施方案中，所述胰岛素为长效、中效、短效胰岛素或其任意组合。
48.在一些实施方案中，所述组合物被配制为注射用制剂或口服制剂(例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂)。
附图说明
49.图1a：小鼠禁食和进食1h后的血清蛋白银染结果。
50.图1b：feimin(c5orf24)蛋白多肽的质谱鉴定结果。
51.图2a：小鼠在禁食和进食后不同时间点的血糖、血浆feimin和胰岛素水平的变化。
52.图2b：人类临床样品中禁食和进食1h后的血糖水平变化。
53.图2c：人类临床样品中禁食和进食1h后的血浆胰岛素水平变化。
54.图2d：通过elisa测定的人类临床样品中禁食和进食1h后的血浆feimin水平变化。
55.图2e：通过免疫印迹测定的人类临床样品中禁食和进食1h后的血浆feimin水平变化。
56.图3a：小鼠不同组织的feimin的mrna水平和蛋白水平。
57.图3b：人不同组织的feimin的mrna水平。
58.图4a：通过elisa测定的wt小鼠和mko小鼠在禁食和进食1h后的血浆feimin水平的变化。
59.图4b：通过免疫印迹测定的wt小鼠和mko小鼠在禁食和进食1h后的血浆feimin水平的变化。
60.图5a：wt小鼠腹腔注射葡萄糖后血糖、血浆feimin和胰岛素水平的变化。
61.图5b：wt和mko小鼠腹腔注射葡萄糖后30min血浆中feimin水平的变化。
62.图5c：wt和mko小鼠腹腔注射葡萄糖后30min血糖水平的变化。
63.图6a：小鼠耐力运动示意图。
64.图6b：通过elisa测定的wt和mko小鼠耐力运动后血浆中feimin水平的变化。
65.图6c：通过免疫印迹测定的wt和mko小鼠耐力运动后血浆中feimin水平的变化。
66.图7a：人耐力运动示意图。
67.图7b：通过elisa测定的人耐力运动后血浆中feimin水平的变化。
68.图7c：通过免疫印迹测定的人耐力运动后血浆中feimin水平的变化。
69.图8a：wt和mko小鼠在进食后血糖水平的变化。
70.图8b：wt和mko小鼠肝糖原储存的比较。
71.图8c：wt和mko小鼠肌糖原储存的比较。
72.图9a：通过生物发光法测定的wt和mko小鼠的葡萄糖摄取。
73.图9b：通过2-nbdg法测定的wt和mko小鼠的肌肉和白色脂肪组织(wat)中的葡萄糖摄取。
74.图9c：wt和mko小鼠的肌肉和白色脂肪组织(wat)中slc2a4蛋白的定位。
75.图10a：通过高胰岛素葡萄糖钳夹实验测定的wt和mko小鼠的肝脏葡萄糖生成能力比较。
76.图10b：wt和mko小鼠的葡萄糖输注速率比较。
77.图10c：wt和mko小鼠的葡萄糖处置速率比较。
78.图10d：wt和mko小鼠的胰岛素刺激下的葡萄糖处置速率比较。
79.图10e：通过丙酮酸耐受试验测定的wt和mko小鼠的肝脏葡萄糖生成能力比较。
80.图11a：wt和mko小鼠的葡萄糖耐受能力比较。
81.图11b：wt和mko小鼠的胰岛素敏感性比较。
82.图12a：wt和mko小鼠血浆中的甘油三酯水平比较。
83.图12b：wt和mko小鼠血浆中的胰岛素水平比较。
84.图12c：wt和mko小鼠肝脏中的甘油三脂水平比较。
85.图12d：wt和mko小鼠棕色脂肪组织(bat)中甘油三脂积累情况。
86.图13：feimin与小鼠各组织的结合的免疫荧光染色图。
87.图14a：feimin与wt和mertk-ko小鼠各组织的结合的免疫荧光染色图。
88.图14b：feimin与wt和mertk-ko原代肝细胞的结合饱和曲线。
89.图15：feimin与mertk的结合亲和力曲线。
90.图16a：mertk wt和ko小鼠进食后的血糖水平。
91.图16b：mertk wt和ko小鼠肝糖原水平。
92.图16c：mertk wt和ko小鼠肌糖原水平。
93.图16d：通过2-nbdg法测定的mertk wt和ko小鼠的肌肉和白色脂肪组织(wat)的葡萄糖摄取。
94.图16e：通过生物发光法测定的mertk wt和ko小鼠葡萄糖摄取。
95.图16f：mertk wt和ko小鼠在肌肉和白色脂肪组织(wat)中slc2a4蛋白的定位。
96.图17a：mertk wt和ko小鼠的肝脏葡萄糖生成能力比较。
97.图17b：mertk wt和ko小鼠葡萄糖输注率比较。
98.图17c：mertk wt和ko小鼠葡萄糖处理率比较。
99.图17d：mertk wt和ko小鼠胰岛素刺激下的葡萄糖处置能力比较。
100.图17e：mertk wt和ko小鼠的丙酮酸耐受能力比较。
101.图17f：mertk wt和ko小鼠的葡萄糖耐受能力比较。
102.图17g：mertk wt和ko小鼠的胰岛素耐受能力比较。
103.图17h：mertk wt和ko小鼠血浆中甘油三酯水平的比较。
104.图17i：mertk wt和ko小鼠血浆中的胰岛素水平的比较。
105.图17j：mertk wt和ko小鼠肝脏中甘油三酯水平的比较。
106.图18：mertk
+/+
、mertk-/-以及mertk-/-+wt mertk小鼠原代肝细胞的葡萄糖生成能力的比较。
107.图19a：mertk
+/+
、mertk-/-以及mertk-/-+wt mertk小鼠肌管细胞的葡萄糖摄取能力的比较。
108.图19b：mertk
+/+
、mertk-/-以及mertk-/-+wt mertk小鼠成熟脂肪细胞的葡萄糖摄取能力的比较。
109.图20a：通过elisa测定的不同浓度feimin蛋白腹腔注射后的血清浓度。
110.图20b：通过免疫印迹测定的不同浓度feimin蛋白对肝脏、肌肉和脂肪组织akt的激活作用。
111.图20c：通过elisa测定的feimin的血清半衰期。
112.图21：通过免疫印迹测定的小鼠肝脏、肌肉和脂肪组织中的feimin对akt的激活与胰岛素对akt的激活的比较。
113.图22a：mertk
+/+
、mertk-/-以及mertk-/-+wt mertk小鼠中feimin对血糖的调控；
114.图22b：mertk
+/+
、mertk-/-以及mertk-/-+wt mertk小鼠的肝脏、肌肉和脂肪组织中feimin对akt的激活。
115.图23：单次腹腔注射和多次腹腔注射feimin后小鼠的血糖水平。
116.图24a：lean、dio、db/db、ob/ob小鼠在禁食和进食状态下血糖水平的变化。
117.图24b：lean、dio、db/db、ob/ob小鼠在禁食和进食状态下血浆feimin水平的变化。
118.图24c：lean、dio、db/db、ob/ob小鼠在禁食和进食状态下血浆胰岛素水平的变化。
119.图25a：健康人和糖尿病人在禁食和进食状态下血糖水平的变化。
120.图25b：健康人和糖尿病人在禁食和进食状态下血浆c肽水平的变化。
121.图25c：健康人和糖尿病人在禁食状态下糖化血红蛋白水平的变化。
122.图25d：健康人和糖尿病人在禁食和进食状态下血浆feimin水平的变化。
123.图26：lean、dio、ob/ob、db/db小鼠中，feimin、胰岛素、feimin+胰岛素对akt的激活作用。
124.图27：在lean、dio、ob/ob、db/db小鼠中，feimin、胰岛素、feimin+胰岛素的降血糖效果。
具体实施方式
125.通过结合附图和以下实施方案的详细描述，本发明的上述特征和优点及其附加特征和优点将在下文中得到更清楚的理解。此处参照附图描述的实施方案是解释性的、说明性的，并用于普遍理解本发明。实施方案不应解释为限制本发明的范围。
126.除非另有限定，否则本文所使用的全部技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同。例如，本文所使用的术语如“amultilingual glossary of biotechnological terms:(iupac recommendations)”,leuenberger,h.g.w,nagel,b.和h.编辑(1995),helvetica chimica acta,ch-4010basel,switzerland中所述的定义。
127.应当注意，如本文中及所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。因此，术语“一个”、“一种”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”可以互换使用。类似地，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
128.在本文中及所附权利要求书中使用术语“包含”时，其不排除其它元素。为了本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包括或包含至少一定数量的实施方案，则还应被理解为公开了优选仅由这些实施方案组成的组。
129.如本文使用的术语“和/或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。因此，如在短语例如“a和/或b”中所使用的术语“和/或”旨在包括a和b；a或b；a(单独)；和b(单独)。同样地，如在短语例如“a、b和/或c”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
130.在本文中列举的范围应理解为所述范围内的所有值(包括所列举的端点值)。例如，范围1至100应理解为包括1至100之间的任何数值、数值组合或子范围。
131.如本文所用的术语“feimin蛋白”也称为c5orf24蛋白。feimin蛋白的氨基酸序列在各物种中具有一定的保守性，其在人中存在两种亚型(isoform)。不同物种中feimin蛋白的氨基酸序列如下所示：人(homo sapiens)-isoform 1
132.mmhpvassnpafcgpgkpsclnedamraadqfdiyssqqskysh
133.tvnhkpmvcqrqdplnethlqttsgrsieikdelkkkknlnrsg
134.krgrpsgttksagyrtstgrplgttkaagfktspgrplgttkaag
135.ykvspgrppgsikalsrladlgygcgtaafpypmmhgravhgveetssevkppne(seq id no:1)
136.人(homo sapiens)-isoform 2
137.mmhpvassnpafcgpgkpsclnedamraadqfdiyssqqskysh
138.tvnhkpmvcqrqdplnethlqttsgrsieikdelkkkknlnrsg
139.krgrpsgttksagyrtstgrplgttkaagfktspgrplgttkaagykvspgrppgkkqqafrcssda(seq id no:2)
140.黑猩猩(pan troglodytes)
141.mmhpvassnpafcgpgkpsclnedamraadqfdiyssqqskysh
142.tvnhkpmvcqrqdplnethlqttsgrsieikdelkkkknlnrsg
143.krgrpsgttksagyrtstgrplgttkaagfktspgrplgttkaag
144.ykvspgrppgsikalsrladlgygcgtaafpypmmhgravhgveetssevkppne(seq id no:3)
145.犬(canis familiaris)
146.mmhpvassnpafcgpgkpsclnedamraadqfdiyssqqskysh
147.tvshkpmacqrqdplnethlqttsgrsleikdelkkkknlnrsg
148.krgrpsgttksagyrtstgrplgttkaagfktspgrplgttkaag
149.ykvspgrppgsikalsrladlgygcgtaafpypmmhsravhgveetssevkppne(seq id no:4)
150.小鼠(mus musculus)
151.mmhpvagsnpafcgpgkpsclnedamraadqfdlyssqqnkysh
152.tvshkpmvcqrqdplnethlqptsgrnieikdelkkkknlnrsgk
153.rgrpsgttksagyrtstgrplgttkaagfktspgrplgttkaagy
154.kvspgrppgsikalsrladlgygcgtaafpypmmhsrvvhglqetsgevkppse(seq id no:5)
155.原鸡(gallus gallus)
156.mmhpvassnaafcgtgkssclnednvraadqfdlyatqqskysh
157.avshkpiacqrqdalneshlqttsgrnietkdelkkkknlnrsgk
158.rgrpsgttksagyrtstgrplgttkaagfktspgrplgttkaagy
159.kvspgrppgsikaqsrfanlsytcgsaafpypmvhnrgvhavgetssklkqpne(seq id no:6)
160.热带爪蟾(xenopus tropicalis)
161.mmrpvsssnvafctsgkssclnqdtmrgvdqfglyatqqskysh
162.pvthkniscqtqetinethlqtstsrdldtksdlkkkknlgrsgk
163.rgrpsgttksagyrtstgrplgttkaagfktspgrplgttkaagy
164.kvspgrppgsikalsrlanlgypsnnagfsyptalsrglhsavettlkhpie(seq id no:7)
165.在本文中，feimin蛋白应以其最广泛的意义来理解，包括野生型的、分离或纯化的、或重组的feimin蛋白、其变体或衍生物，只要保留期望的生物活性(例如降血糖活性)即可。feimin蛋白的变体或衍生物涵盖例如保留了以与野生型feimin蛋白类似的程度、以与野生型feimin蛋白相同的程度或以比野生型feimin蛋白更高的程度降低受试者血糖水平的能力的本文所述feimin蛋白的变体或衍生物。feimin蛋白的变体或衍生物保留了野生型feimin蛋白的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、或100％的生物活性，或者具有比野生型feimin蛋白更高的生物活性，特别是降血糖活性。
166.feimin蛋白的变体包括与野生型feimin蛋白具有显著的序列同一性并且保留了feimin蛋白的生物活性(例如降血糖活性)的多肽。变体与野生型feimin蛋白相比，可以具有一个或多个氨基酸突变。突变可以包括例如氨基酸插入、缺失或取代。变体的氨基酸序列与野生型feimin蛋白的氨基酸序列可以例如，具有至少约65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、98.2％、98.4％、98.6％、98.8％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高的同一性。
167.feimin蛋白的衍生物通常是指可以通过化学修饰，特别是通过一个或多个取代基的共价连接，由野生型feimin蛋白或其功能性片段、变体制备的化合物。因此，feimin蛋白的衍生物是指经化学修饰的feimin蛋白或其功能性片段或变体。典型的衍生物例如可以是酰胺化、糖基化、烷基化、酰基化、酯化、聚乙二醇化的feimin蛋白或其功能性片段或变体。
168.如本文所用的术语“功能性片段”是指保留了亲本feimin蛋白的生物活性(特别是降血糖活性)的feimin蛋白的部分或片段。在本文中，feimin蛋白的的功能性片段保留了亲本feimin蛋白的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、或100％的活性，特别是降血糖活性。
169.如本文所用的术语“表达载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介的核酸分子，在该宿主细胞中作为载体的所述核酸分子可以例如复制和/或表达。术语“表达载体”涵盖但不限于质粒、病毒载体(包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、牛痘病毒载体、多瘤病毒载体和腺病毒相关载体(aav))、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括例如bac和yac)。
170.如本文所用的术语“治疗”包括在有需要的受试者中的治疗性或预防性治疗。“治疗性或预防性治疗”包括旨在完全预防临床和/或病理表现的预防性治疗或旨在改善或缓解临床和/或病理表现的治疗性治疗。因此，术语“治疗”还包括改善或预防疾病。
171.如本文所用的术语“有效量”意指当施用到受试者用于治疗或预防疾病时足以实现这样的治疗或预防的治疗剂的量。“有效量”可根据化合物、疾病及其严重度、以及待治疗的受试者的年龄、体重等改变。“治疗有效量”是指用于治疗性治疗的有效量。“预防有效量”是指用于预防性治疗的有效量。
172.如本文所用的术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”在本文可互换使用，指需要治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。一般而言，哺乳动物受试者包括人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、乳牛等。
173.如本文所用的术语“与血糖升高相关的疾病”是指由血糖升高引导的疾病、病况或障碍，其包括但不限于糖代谢障碍相关疾病和脂肪代谢障碍相关疾病。
174.糖代谢障碍相关疾病为糖代谢紊乱导致的相关疾病的总称，包括例如：1)糖尿病以及糖尿病并发症，例如糖尿病血管病变，例如大血管和微血管受损导致的心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等组织、器官的病变，包括糖尿病性眼病，糖尿病性心脏病、糖尿病性肾病、糖
尿病性神经病变和下肢远端肢体坏死等；2)在糖尿病情况下高发、伴随糖尿病发生或由于糖尿病加重的疾病，例如动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脑出血、脑栓塞、骨质疏松等；3)在糖尿病情况下高发、伴随糖尿病发生或由于糖尿病加重的脂肪代谢紊乱及其相关疾病，包括高脂血症，高血压、动脉粥样硬化、肥胖症、脂肪肝、肝硬化。
175.脂肪代谢障碍相关疾病为脂肪代谢紊乱导致的相关疾病的总称，包括例如：高脂血症、高血压、动脉粥样硬化、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、冠心病、心绞痛、心肌梗死、炎性肠病、消化不良和胃肠道溃疡等。
176.如本文所用的术语“糖尿病”是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有而引起。长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。糖尿病包括i型糖尿病和ii型糖尿病。糖尿病的病因包括遗传因素和环境因素。
177.对于遗传因素，i型或ii型糖尿病均存在明显的遗传异质性。糖尿病存在家族发病倾向，1/4-1/2患者有糖尿病家族史。临床上至少有60种以上的遗传综合征可伴有糖尿病。i型糖尿病有多个dna位点参与发病，其中以hla抗原基因中dq位点多态性关系最为密切。在ii型糖尿病中已发现多种明确的基因突变，如胰岛素基因、胰岛素受体基因、葡萄糖激酶基因、线粒体基因等。
178.对于环境因素，进食过多、体力活动减少导致的肥胖是ii型糖尿病最主要的环境因素，使具有ii型糖尿病遗传易感性的个体容易发病。i型糖尿病患者存在免疫系统异常，在某些病毒如柯萨奇病毒、风疹病毒、腮腺病毒等感染后导致自身免疫反应，破坏胰岛素β细胞。
179.如本文所用的术语“胰岛素”是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是治疗高血糖最有效的药物。不同哺乳动物(人、牛、羊、猪等)的胰岛素分子的氨基酸序列和结构稍有差异，其中猪胰岛素与人的最为接近。动物胰岛素是最早应用于糖尿病治疗的胰岛素注射制剂，一般是猪胰岛素，猪胰岛素与人胰岛素存在1至4个氨基酸的不同，因此容易发生免疫反应，注射部位皮下脂肪萎缩或增生，胰岛素过敏反应，并且由于其免疫原性高，容易反复发生高血糖和低血糖，容易出现胰岛素抵抗。对比动物胰岛素，人胰岛素较少发生过敏反应或者胰岛素抵抗，所以皮下脂肪萎缩的现象也随之减少；由于人胰岛素抗体少，所以注射量比动物胰岛素平均减少30％；人胰岛素的稳定性高于动物胰岛素，常温25℃左右常温可保存人胰岛素4周。
180.如本文所用的术语“胰岛素类似物”是指表现出胰岛素活性，即激活胰岛素受体的经修饰的胰岛素。胰岛素类似物相对于野生型胰岛素具有一个或多个氨基酸取代，和/或一个或多个氨基酸缺失，和/或一个或多个氨基酸插入。胰岛素类似物包含相对于野生型胰岛素的少于10个氨基酸修饰(取代、缺失、添加(即延伸)、插入及其任何组合)，或者相对于野生型胰岛素的少于9、8、7、6、5、4、3、2或1个修饰。
181.如本文所用的术语“胰岛素抵抗”是是周围组织对胰岛素的敏感性下降，血糖升高，导致胰岛功能代偿性地分泌更多的胰岛素的现象。胰岛素抵抗普遍存在于多种代谢相关疾病中。目前认为，胰岛素抵抗是代谢综合征、ii型糖尿病、高血压、高尿酸血症、血脂异常、心脑血管疾病、肥胖、多囊卵巢综合症、阿尔茨海默病以及部分肿瘤等疾病发生的共同
病理生理机制。
182.术语“组合物”特别是指适合施用于人的组合物。然而，该术语通常也涵盖适合施用于非人动物的组合物。所述组合物及其组分(即活性剂和任选的载剂或赋形剂)优选为药物上可接受的，即在接受者中能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用。
183.术语“药学上可接受”是指载剂或赋形剂与组合物的其他成分相容并且对其接受者没有大量毒害，和/或此类载剂或赋形剂被批准或可用于包含在组合物中。
184.发明人出人意料地发现，feimin蛋白在调节糖稳态方面发挥着重要作用，其能够降低受试者中的血糖水平、促进受试者中的葡萄糖摄取、抑制受试者中的葡萄糖生成、增加受试者对胰岛素的敏感性，其和胰岛素联用后能显著降低血糖水平。因此feimin蛋白或feimin蛋白与降血糖药物(例如，抗糖尿病药物，特别是胰岛素或胰岛素类似物)联合施用可有效地预防/或治疗与血糖升高相关的疾病，特别是糖尿病。发明人还发现，与健康人相比，糖尿病人在禁食和进食状态下feimin水平明显升高，表明了feimin蛋白可以用作与血糖升高相关的疾病，特别是糖尿病的诊断标志物。
185.相应地，在一方面，本发明提供了一种降低受试者中的血糖水平的方法，其包括向所述受试者施用有效量的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的步骤。
186.在另一方面，本发明提供了一种促进受试者中的葡萄糖摄取的方法，其包括向所述受试者施用有效量的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的步骤。
187.在又一方面，本发明提供了一种抑制受试者中的葡萄糖生成的方法，其包括向所述受试者施用有效量的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的步骤。
188.在另一方面，本发明提供了一种增加受试者对胰岛素的敏感性的方法，其包括向所述受试者施用有效量的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的步骤。
189.在又一方面，本发明提供了一种治疗受试者中与血糖升高相关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的步骤。
190.在本发明的方法的实施方案中，所述feimin蛋白或其功能性片段是分离或纯化的。在一些实施方案中，所述feimin蛋白或其功能性片段是人feimin蛋白或其功能性片段、变体或衍生物。在一些实施方案中，人feimin蛋白包含如seq id no:1所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，人feimin蛋白包含如seq id no:2所示的氨基酸序列。
191.在一些实施方案中，人feimin蛋白包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸所形成的seq id no:1的变体，只要该变体保留feimim蛋白的功能(特别是降血糖功能)即可。在一些实施方案中，人feimin蛋白包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸所形成的seq id no:2的变体，只要该变体保留feimim蛋白的功能(特别是降血糖功能)即可。所述变体包含或组成为与野生型feimin蛋白的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少
99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。所述变体包含或组成为与seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。所述变体包含或组成为与seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
192.在其他实施方案中，所述feimin蛋白或其功能性片段是黑猩猩feimin蛋白或其功能性片段、变体或衍生物。在一些实施方案中，黑猩猩feimin蛋白包含如seq id no:3所示的氨基酸序列。
193.在一些实施方案中，黑猩猩feimin蛋白包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸所形成的seq id no:3的变体，只要该变体保留feimim蛋白的功能(特别是降血糖功能)即可。所述变体包含或组成为与野生型feimin蛋白的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。所述变体包含或组成为与seq id no:3所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
194.在其他实施方案中，所述feimin蛋白或其功能性片段是犬feimin蛋白或其功能性片段、变体或衍生物。在一些实施方案中，犬feimin蛋白包含如seq id no:4所示的氨基酸序列。
195.在一些实施方案中，犬feimin蛋白包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸所形成的seq id no:4的变体，只要该变体保留feimim蛋白的功能(特别是降血糖功能)即可。所述变体包含或组成为与野生型feimin蛋白的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。所述变体包含或组成为与seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
196.在其他实施方案中，所述feimin蛋白或其功能性片段是小鼠feimin蛋白或其功能性片段、变体或衍生物。在一些实施方案中，小鼠feimin蛋白包含如seq id no:5所示的氨基酸序列。
197.在一些实施方案中，小鼠feimin蛋白包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸所形成的seq id no:5的变体，只要该变体保留feimim蛋白的功能(特别是降血糖功能)即可。所述变体包含或组成为与野生型feimin蛋白的氨基酸序列具有至少70％、至少
80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。所述变体包含或组成为与seq id no:5所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
198.在一些实施方案中，所述核酸是dna或rna。在一些实施方案中，所述核酸是dna。在一些实施方案中，所述核酸编码人feimin蛋白或其功能性片段。在一些实施方案中，所述核酸编码人feimin蛋白isoform 1。在一些实施方案中，所述核酸编码人feimin蛋白isoform 2。人feimin蛋白isoform 1和isoform 2的编码序列如下所示：
199.人feimin蛋白isoform1编码序列：
200.atgatgcatcctgttgccagcagtaatccagctttctgtgggcctggcaagccttcctgcctcaatgaagatgccatgagagctgctgatcagtttgacatatattcctcccagcaaagcaaatacagccacacagtcaaccacaaaccaatggtttgtcagaggcaagacccattaaatgaaacacacttgcagactacaagtggcagaagcatagaaataaaagatgaactaaagaaaaagaagaatctcaaccgatctggtaagcgtggccggccttcgggaaccaccaaatcagcaggataccggaccagcacaggcagacccctgggaaccaccaaagcagctggatttaagacaagtccaggcagacctttggggacaactaaagctgcgggatacaaagtcagcccaggcagacctccaggtagcattaaagctctatcccgtcttgccgatcttggttatggctgtggcactgctgcttttccttaccctatgatgcatggcagagcagttcatggggtagaggaaactagcagtgaagtcaaaccacccaatgagtga(seq id no:8)
201.人feimin蛋白isoform2编码序列：
202.atgatgcatcctgttgccagcagtaatccagctttctgtgggcctggcaagccttcctgcctcaatgaagatgccatgagagctgctgatcagtttgacatatattcctcccagcaaagcaaatacagccacacagtcaaccacaaaccaatggtttgtcagaggcaagacccattaaatgaaacacacttgcagactacaagtggcagaagcatagaaataaaagatgaactaaagaaaaagaagaatctcaaccgatctggtaagcgtggccggccttcgggaaccaccaaatcagcaggataccggaccagcacaggcagacccctgggaaccaccaaagcagctggatttaagacaagtccaggcagacctttggggacaactaaagctgcgggatacaaagtcagcccaggcagacctccaggaaaaaagcagcaagccttcaggtgttccagtgatgcctga(seq id no:9)
203.在一些实施方案中，所述核酸包含seq id no:8所示的序列或与seq idno:8具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的序列。在优选的实施方案中，所述核酸包含seq id no:8所示的序列。
204.在一些实施方案中，所述核酸包含seq id no:9所示的序列或与seq idno:9具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的序列。在优选的实施方案中，所述核酸包含seq id no:9所示的序列。
205.在一些实施方案中，所述表达载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、逆转录病毒载体、质粒、dna载体、mrna载体、基于转座子的载体和人工染色体。
206.表达载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的dna序列和作为载体“骨架”的较大序列。工程化载体通常包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，mcs)。载体可另外包含启动子、遗传标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签。如本领域技术人员已知的，大量合适的表达载体是本领域技术人员已知的，并且许多可商购获得。
207.本文公开的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体可用于治疗和或/预防与血糖升高相关的疾病，即由血糖升高引导的疾病、病况或障碍，例如适用于治疗和/或预防：
208.1.脂肪酸代谢障碍和葡萄糖利用障碍
[0209]-其中涉及胰岛素抵抗的障碍；
[0210]
2.糖尿病，尤其是ii型糖尿病，包括与之有关的后遗症
[0211]
其中具体涉及：
[0212]-高血糖，
[0213]-改善胰岛素抵抗，
[0214]-改善葡萄糖耐量，
[0215]-胰腺β细胞的保护，
[0216]-预防大血管和微血管障碍；
[0217]
3.血脂异常及其后遗症，例如动脉粥样硬化、冠心病、脑血管疾病等，尤其涉及下述一个或多个因素所表征的那些疾病(但不限于此)：
[0218]-高血浆甘油三酯浓度、高餐后血浆甘油三酯浓度，
[0219]-低hdl胆固醇浓度，
[0220]-低apoa脂蛋白浓度，
[0221]-高ldl胆固醇浓度，
[0222]-低密度ldl胆固醇颗粒，
[0223]-高apob脂蛋白浓度；
[0224]
4.可能与代谢综合征有关的多种其它病症，如：
[0225]-肥胖症(超重)，包括向心性肥胖，
[0226]-血栓形成、凝固性过高和血栓形成前状态(动脉和静脉)，
[0227]-高血压，
[0228]-心力衰竭，例如(但不限于)心肌梗塞、高血压性心脏病或心肌病后的心力衰竭，
[0229]
5.涉及炎性反应的疾病或病症：
[0230]-动脉粥样硬化，例如(但不限于)冠状动脉硬化，包括心绞痛或心肌梗塞、中风，
[0231]-血管再狭窄或再闭塞，
[0232]-慢性炎性肠病，例如克罗恩病和溃疡性结肠炎，
[0233]-哮喘，
[0234]-红斑狼疮(e)或炎性风湿病如类风湿性关节炎，
[0235]-其它炎性状态，
[0236]
6.细胞周期或细胞分化过程的障碍：
[0237]-脂肪细胞肿瘤，
[0238]-脂肪瘤样癌，例如脂肉瘤，
[0239]-实体瘤和赘生物，例如(但不限于)胃肠道癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、内分泌肿瘤、肺癌、肾癌和泌尿道癌、生殖道癌、前列腺癌等，
[0240]-急性和慢性骨髓增生性疾病和淋巴瘤，
[0241]-血管生成，
[0242]
7.中枢和外周神经细胞的脱髓鞘性疾病和其它神经退行性疾病，包括：
[0243]-阿尔茨海默病，
[0244]-多发性硬化症，
[0245]-帕金森病，
[0246]-肾上腺脑白质营养不良(ald)，
[0247]-肾上腺脊髓神经病，
[0248]-aids-空泡性脊髓病，
[0249]-htlv-相关性脊髓病，
[0250]-莱伯(leber)遗传性视神经萎缩，
[0251]-进行性多灶性白质脑病(pml)，
[0252]-亚急性硬化性全脑炎，
[0253]-格林-巴利(guillian-barre)综合征，
[0254]-热带痉挛性轻截瘫，
[0255]-急性播散性脑脊髓炎(adem)，
[0256]-急性病毒性脑炎，
[0257]-急性横贯性脊髓炎，
[0258]-脊髓受损和脑外伤，
[0259]-夏科-马里-图斯病(charcot-marie-tooth disease)；
[0260]
8.皮肤障碍和/或与创伤愈合过程的障碍：
[0261]-红斑鳞屑性皮肤病，例如银屑病，
[0262]-寻常痤疮，
[0263]-由ppar调节的其它皮肤疾病和皮肤病学病症，
[0264]-湿疹和神经性皮炎，
[0265]-皮炎，例如脂溢性皮炎或光照性皮炎，
[0266]-角膜炎和角化病，例如脂溢性角化病、老年角化病、光化性角化病、光诱发性角化病或毛囊角化病，
[0267]-瘢痕瘤和瘢痕瘤预防，
[0268]-疣，包括湿疣或尖锐湿疣，
[0269]-人乳头瘤病毒(hpv)感染，例如性病疣、病毒性疣，例如传染性软疣、粘膜白斑病，
[0270]-丘疹皮肤病，例如扁平苔癣，
[0271]-皮肤癌，例如基底细胞癌、黑素瘤或皮肤t-细胞淋巴瘤，
[0272]-局限性良性表皮瘤，例如角皮病、表皮痣，
[0273]-冻疮，
[0274]-创伤愈合，
[0275]
9.其它障碍：
[0276]-高血压，
[0277]-胰腺炎，
[0278]-x综合征，
[0279]-多囊性卵巢综合征(pcos)，
[0280]-哮喘，
[0281]-骨关节炎，
[0282]-红斑狼疮(le)或炎性风湿病，例如类风湿性关节炎，
[0283]-脉管炎，
[0284]-消瘦(恶病质)，
[0285]-痛风，
[0286]-缺血/再灌注综合征，
[0287]-急性呼吸窘迫综合征(ards)。
[0288]
在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、胰岛素抵抗症、葡萄糖耐量减低、血脂异常、凝血功能异常、肝脂肪、肝硬化、高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死、心血管疾病、冠心病、脑血栓、脑出血、骨质疏松、炎性肠病、消化不良和胃溃疡。
[0289]
在优选的实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病为糖尿病。在更优选的实施方案中，所述糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。
[0290]
在本发明的治疗方法的实施方案中，所述方法还包括施用第二治疗剂的步骤。在优选的实施方案中，所述第二治疗剂选自蛋白质或肽、核酸和小分子药物。
[0291]
在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病为糖尿病，且所述第二治疗剂选自降血糖药物。在一些实施方案中，第二治疗剂为抗糖尿病药物。在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病为糖尿病，且所述第二治疗剂为抗糖尿病药物。
[0292]
在一些实施方案中，所述抗糖尿病药物选自双胍类(例如，二甲双胍)；促胰岛素分泌剂(例如，磺脲类(例如格列吡嗪、格列齐特、格列喹酮、格列本脲、格列美脲)、瑞格列奈、那格列奈)；α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，伏格列波糖、阿卡波糖)；胰岛素增敏剂(例如，曲格列酮、罗格列酮、比格列酮)；和胰岛素或胰岛素类似物。
[0293]
在一些实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物为牛、猪或人胰岛素或胰岛素类似物。在优选的实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物为人胰岛素或胰岛素类似物。
[0294]
人胰岛素激素的结构和性质是众所周知的。人胰岛素具有两条多肽链，被命名为a链和b链。a链为21个氨基酸的肽，而b链为30个氨基酸的肽，这两条链通过以下的二硫桥连接：在a链位置7上的半胱氨酸与b链位置7上的半胱氨酸之间的第一桥，以及在a链位置20上的半胱氨酸与b链位置19上的半胱氨酸之间的第二桥。第三桥存在于a链的位置6和11上的半胱氨酸之间。
[0295]
人胰岛素a链具有以下序列：giveqcctsicslyqlenycn(seq id no:10)，而b链具有以下序列：fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seq id no:11)。
[0296]
在一些实施方案中，所述胰岛素为长效、中效、短效胰岛素或其任意组合。
[0297]
短效胰岛素又称为“可溶性胰岛素”、“常规胰岛素”、“中性胰岛素”或“速效胰岛
素”，目前主要有动物来源和重组人胰岛素来源两种，其是将结晶型胰岛素制成酸性或中性ph的溶液后供治疗使用的胰岛素。外观为无色透明溶液，该胰岛素未经添加剂处理或结构修饰，不能延长胰岛素的作用时间，可在病情紧急的情况下静脉输注。短效胰岛素包括但不限于门冬胰岛素(insulin aspart)、赖脯胰岛素(insulin lispro)、谷赖胰岛素(insulin glulisine)。从来源上，短效胰岛素包括人胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素等。
[0298]
中效胰岛素的代表性实施包括低精蛋白锌胰岛素(isophane insulin)，其是低精蛋白锌胰岛素是胰岛素混合到锌和鱼精蛋白磷酸缓冲复合物中的混悬剂，胰岛素和鱼精白的分子比例为1:1。中效胰岛素主要有动物来源和重组人胰岛素来源两种。皮下注射低精蛋白锌胰岛素平均1.5小时起效，4-12小时达到峰值，作用维持18-24小时。
[0299]
长效胰岛素的代表性实施包括精蛋白锌胰岛素(protamine zinc insulin injection)，其是在低蛋白锌胰岛素的基础上加大鱼精蛋白的比例，使其更接受人的体液ph，溶解度更低，释放更缓慢，作用时间更长。长效胰岛素一般是每日注射一次，皮下注射后3-4小时内起效，12-20小时达峰值，作用维持24-36小时。
[0300]
还存在超长效胰岛素，其具有长效、平稳的药效学特点。超长效胰岛素的代表性实例包括例如甘精胰岛素(insulin glargine)、特地胰岛素(insulin determir)和德谷胰岛素(insulin degludec)。
[0301]
在一些实施方案中，所述第二治疗剂在所述feimin蛋白或其功能性片段、所述核酸或所述表达载体之前、之后或同时施用。在一些实施方案中，所述第二治疗剂在所述feimin蛋白或其功能性片段、所述核酸或所述表达载体之前施用。在一些实施方案中，所述第二治疗剂在所述feimin蛋白或其功能性片段、所述核酸或所述表达载体之后施用。在一些实施方案中，所述第二治疗剂与所述feimin蛋白或其功能性片段、所述核酸或所述表达载体同时施用。
[0302]
应认识到，治疗可能需要单次施用治疗有效剂量或多次施用治疗有效剂量的本发明的活性剂。例如，根据活性剂的类型、半衰期和清除率，活性剂可以每天施用一至三次、每两天施用一次、每3至4天施用一次、每周施用一次，或每两周施用一次，或在一个月内施用一次。
[0303]
本文公开的活性剂(feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体)可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、静脉内、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。
[0304]
在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在优选的实施方案中，所述受试者为人。在一些实施方案中，所述受试者是胰岛素抵抗的，例如所述受试者具有抗胰岛素抗体、glut4基因突变、葡萄糖激酶基因突变、胰岛素受体基因突变、胰岛素受体底物基因突变中的一种或多种。
[0305]
本文公开的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的有效量可以由本领域技术人员采用已知技术来确定。合适的剂量提供足够量的本发明活性剂，并且优选是治疗有效的，即足以在合理的时间范围内引起受试者或动物的例如治疗性或预防性响应。例如，本发明的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的剂量
应在从施用时起约20分钟、30分钟、1小时、2小时或更久，例如12小时至24小时或更久时间(例如，1个月、2个月、3个月、6个月、12个月、24个月等)的时段内足以产生治疗性或预防性响应。在某些实施方案中，时间段甚至可以更久。如本领域已知，针对治疗目的，给药途径、时间和频率，给药制剂的时间和频率，年龄，体重，一般健康状况，性别，饮食，疾病状态的严重程度，药物组合，反应敏感性和对治疗的耐受性/响应的调整可能是必要的。
[0306]
用于确定施用剂量的许多测定为本领域已知的。通常，主治医师决定施用于每个个体患者的本公开活性剂的剂量，这考虑到多种因素，如年龄、体重、一般健康、饮食、性别、待施用的活性剂、施用途径以及治疗病况的严重程度。
[0307]
在另一方面，本发明提供了一种诊断受试者的与血糖升高相关的疾病的方法，其包括以下步骤：
[0308]
a.从所述受试者获得血液样品，
[0309]
b.确定所述样品中feimin蛋白的水平，
[0310]
其中与健康对照相比，所述样品中feimin蛋白水平的升高指示所述受试者具有患与血糖升高相关的疾病的风险。
[0311]
在本发明的诊断方法的实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、胰岛素抵抗症、葡萄糖耐量减低、血脂异常、凝血功能异常、肝脂肪、肝硬化、高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死、心血管疾病、冠心病、脑血栓、脑出血、骨质疏松、炎性肠病、消化不良和胃溃疡。
[0312]
在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病为糖尿病。在一些实施方案中，所述糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。
[0313]
在一些实施方案中，所述血液样品选自血液、血清和血浆。在某些实施方案中，所述方法在体外进行。在一些实施方案中，所述方法还包括从样品中分离feimin蛋白的步骤。分离feimin蛋白的方法是本领域已知的。
[0314]
确定样品中feimin蛋白的水平的方法是本领域已知的，例如可以在步骤b中，通过选自以下的方法来确定所述样品中feimin蛋白的水平：质谱方法、荧光检测方法、化学发光方法、elisa测定、western印迹、放射免疫分析、免疫组化染色、多重免疫试验和斑点印迹试验。
[0315]
在一些实施方案中，可以通过抗feimin蛋白抗体来确定所述样品中feimin蛋白的水平。抗feimin蛋白抗体是本领域已知，并且可通过商购获得。所述抗体优选是单克隆抗体，但也可以是fab、fab’、(fab’)2、fv、scfv、双scfv、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等。
[0316]
在又一方面，本发明提供了组合物，其包含feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体，和药学上可接受的载剂或赋形剂。
[0317]
在一些实施方案中，所述组合物用于以下中的一种或多种：
[0318]
1)降低受试者中的血糖水平；
[0319]
2)促进受试者中的葡萄糖摄取；
[0320]
3)抑制受试者中的葡萄糖生成；
[0321]
4)增加受试者对胰岛素的敏感性；和
[0322]
5)治疗受试者中与血糖升高相关的疾病。
[0323]
在本发明的组合物的实施方案中，所述feimin蛋白或其功能性片段是分离或纯化的。在一些实施方案中，所述feimin蛋白或其功能性片段是人feimin蛋白或其功能性片段、变体或衍生物。在一些实施方案中，人feimin蛋白包含如seq id no:1所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，人feimin蛋白包含如seq id no:2所示的氨基酸序列。
[0324]
在一些实施方案中，人feimin蛋白包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸所形成的seq id no:1的变体，只要该变体保留feimim蛋白的功能(特别是降血糖功能)即可。在一些实施方案中，人feimin蛋白包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸所形成的seq id no:2的变体，只要该变体保留feimim蛋白的功能(特别是降血糖功能)即可。所述变体包含或组成为与野生型feimin蛋白的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。所述变体包含或组成为与seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。所述变体包含或组成为与seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
[0325]
在一些实施方案中，所述组合物还包含第二治疗剂。在优选的实施方案中，所述第二治疗剂选自蛋白质或肽、核酸和小分子药物。
[0326]
在一些实施方案中，所述第二治疗剂选自降血糖药物。在一些实施方案中，所述第二治疗剂选自抗糖尿病药物。
[0327]
在一些实施方案中，所述抗糖尿病药物选自双胍类(例如，二甲双胍)；促胰岛素分泌剂(例如，磺脲类(例如格列吡嗪、格列齐特、格列喹酮、格列本脲、格列美脲)、瑞格列奈、那格列奈)；α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，伏格列波糖、阿卡波糖)；胰岛素增敏剂(例如，曲格列酮、罗格列酮、比格列酮)；和胰岛素或胰岛素类似物。
[0328]
在一些实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物为牛、猪或人胰岛素或胰岛素类似物。在一些实施方案中，所述胰岛素为长效、中效、短效胰岛素或其任意组合。胰岛素的实例如上文所述。
[0329]
根据所采用的活性剂(如feimin蛋白)，可将本公开的组合物制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，例如可以是软膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、凝胶剂、粉剂、片剂、溶液剂、气雾剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、液体剂、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程在第22版的remington’s pharmaceutical sciences(ed.maackpublishing co，easton，pa.，2012)中显示，并可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体的组合物通常以液体形式提供，并且
优选包含药学上可接受的缓冲剂。液体制剂可以是溶液或悬浮液。
[0330]
在一些实施方案中，本发明的组合物被配制为注射用制剂或口服制剂。口服制剂的实例包括但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂。在一些实施方案中，本发明的组合物可用于多种途径施用，例如肠胃外施用。在一些实施方案中，本发明的组合物可以通过静脉内、肌内、皮下、腹膜内等途径施用。在一些实施方案中，本发明的组合物可以通过口服施用。
[0331]
在本发明的组合物中，载剂和赋形剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、粘度赋予剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、稀释剂、防腐剂、乳化剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋形剂以制备本发明的组合物。用于本发明的组合物中的示例性载剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和组合物的期望剂型。
[0332]
在另一方面，本发明提供了本文所述的组合物在制备用于以下中的一种或多种的药物中的用途：
[0333]
1)降低受试者中的血糖水平；
[0334]
2)促进受试者中的葡萄糖摄取；
[0335]
3)抑制受试者中的葡萄糖生成；
[0336]
4)增加受试者对胰岛素的敏感性；和
[0337]
5)治疗受试者中与血糖升高相关的疾病。
[0338]
在又一方面，本发明提供了用于治疗受试者中与血糖升高相关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的组合的步骤。
[0339]
在另一方面，本发明提供了用于在受试者中诊断与血糖升高相关的疾病的试剂盒，其包含用于确定来自所述受试者的血液样品中feimin蛋白的水平的试剂。
[0340]
在本发明的试剂盒的实施方案中，所述试剂用于在选自以下的方法中确定所述样品中feimin蛋白的水平：质谱方法、荧光检测方法、化学发光方法、elisa测定、western印迹、放射免疫分析、免疫组化染色、多重免疫试验和斑点印迹试验。在一些实施方案中，所述试剂为抗feimin蛋白抗体。所述抗体优选是单克隆抗体，但也可以是fab、fab’、(fab’)2、fv、scfv、双scfv、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等。
[0341]
在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、胰岛素抵抗症、葡萄糖耐量减低、血脂异常、凝血功能异常、肝脂肪、肝硬化、高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死、心血管疾病、冠心病、脑血栓、脑出血、骨质疏松、炎性肠病、消化不良和胃溃疡。在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病为糖尿病。在一些实施方案中，所述糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。
[0342]
在一些实施方案中，所述血液样品选自血液、血清和血浆。
[0343]
在另一方面，本发明提供了用于确定来自受试者的血液样品中feimin蛋白的水平的试剂在制备用于在所述受试者中诊断与血糖升高相关的疾病的试剂盒中的用途。
[0344]
在本发明的诊断用途的实施方案中，所述试剂用于在选自以下的方法中确定所述样品中feimin蛋白的水平：质谱方法、荧光检测方法、化学发光方法、elisa测定、western印迹、放射免疫分析、免疫组化染色、多重免疫试验和斑点印迹试验。在一些实施方案中，所述
试剂为抗feimin蛋白抗体。所述抗体优选是单克隆抗体，但也可以是fab、fab’、(fab’)2、fv、scfv、双scfv、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等。
[0345]
在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、胰岛素抵抗症、葡萄糖耐量减低、血脂异常、凝血功能异常、肝脂肪、肝硬化、高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死、心血管疾病、冠心病、脑血栓、脑出血、骨质疏松、炎性肠病、消化不良和胃溃疡。在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病为糖尿病。在一些实施方案中，所述糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。
[0346]
在一些实施方案中，所述血液样品选自血液、血清和血浆。
[0347]
在另一方面，本公开提供了feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体在制备用于降低受试者中的血糖水平的组合物中的用途。
[0348]
在另一方面，本公开提供了feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体在制备用于促进受试者中的葡萄糖摄取的组合物中的用途。
[0349]
在另一方面，本公开提供了feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体在制备用于抑制受试者中的葡萄糖生成的组合物中的用途。
[0350]
在另一方面，本公开提供了feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体在制备用于增加受试者对胰岛素的敏感性的组合物中的用途。
[0351]
在另一方面，本公开提供了feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体在制备用于治疗受试者中与血糖升高相关的疾病的组合物中的用途。
[0352]
在另一方面，本公开提供了feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体，其用于降低受试者中的血糖水平。
[0353]
在另一方面，本公开提供了feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体，其用于促进受试者中的葡萄糖摄取的。
[0354]
在另一方面，本公开提供了feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体，其用于抑制受试者中的葡萄糖生成。
[0355]
在另一方面，本公开提供了feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体，其用于增加受试者对胰岛素的敏感性。
[0356]
在另一方面，本公开提供了feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体，其用于治疗受试者中与血糖升高相关的疾病。
[0357]
在本发明的用途的实施方案中，所述feimin蛋白或其功能性片段是分离或纯化的。在一些实施方案中，所述feimin蛋白或其功能性片段是人feimin蛋白或其功能性片段、变体或衍生物。在一些实施方案中，人feimin蛋白包含如seq id no:1所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，人feimin蛋白包含如seq id no:2所示的氨基酸序列。
[0358]
在一些实施方案中，人feimin蛋白包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基
酸所形成的seq id no:1的变体，只要该变体保留feimim蛋白的功能(特别是降血糖功能)即可。在一些实施方案中，人feimin蛋白包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸所形成的seq id no:2的变体，只要该变体保留feimim蛋白的功能(特别是降血糖功能)即可。所述变体包含或组成为与野生型feimin蛋白的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。所述变体包含或组成为与seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。所述变体包含或组成为与seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
[0359]
在一些实施方案中，所述核酸是dna或rna。在一些实施方案中，所述核酸是dna。
[0360]
在一些实施方案中，所述表达载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、逆转录病毒载体、质粒、dna载体、mrna载体、基于转座子的载体和人工染色体。
[0361]
在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、胰岛素抵抗症、葡萄糖耐量减低、血脂异常、凝血功能异常、肝脂肪、肝硬化、高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死、心血管疾病、冠心病、脑血栓、脑出血、骨质疏松、炎性肠病、消化不良和胃溃疡。在优选的实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病为糖尿病。在更优选的实施方案中，所述糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。
[0362]
在一些实施方案中，本文所述的feimin蛋白或其功能性片段、编码所述feimin蛋白或其功能性片段的核酸、或包含所述核酸的表达载体与第二治疗剂组合。在优选的实施方案中，所述第二治疗剂选自蛋白质或肽、核酸和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自降血糖药物。在一些实施方案中，第二治疗剂为抗糖尿病药物。在一些实施方案中，所述与血糖升高相关的疾病为糖尿病，且所述第二治疗剂为抗糖尿病药物。
[0363]
在一些实施方案中，所述抗糖尿病药物选自双胍类(例如，二甲双胍)；促胰岛素分泌剂(例如，磺脲类(例如格列吡嗪、格列齐特、格列喹酮、格列本脲、格列美脲)、瑞格列奈、那格列奈)；α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，伏格列波糖、阿卡波糖)；胰岛素增敏剂(例如，曲格列酮、罗格列酮、比格列酮)；和胰岛素或胰岛素类似物。
[0364]
在一些实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物为牛、猪或人胰岛素或胰岛素类似物。在优选的实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物为人胰岛素或胰岛素类似物。
[0365]
在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在优选的实施方案中，所述受试者为人。在一些实施方案中，所述受试者是胰岛素抵抗的，例如所述受试者具有抗胰岛素抗体、glut4基因突变、葡萄糖激酶基因突变、胰岛素受体基因突变、胰岛素受体底物基因突变中的一种或多种。
[0366]
实施例
[0367]
通过下面的具体实施例进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本
发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通过按照本领域的常规条件，或按照制造商所建议的条件。除非另有说明，否则以下实施例中所用的实验材料和试剂均可商购获得。
[0368]
实施例1：feimin是一种进食和运动诱导的肌激素
[0369]
1.1feimin的发现和鉴定
[0370]
本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型雄性小鼠，为了寻找具有降低血糖作用的激素，分析了禁食过夜后喂食1小时的小鼠血清蛋白。将小鼠随机分成2组，每组6只，其中，第一组小鼠饥饿过夜(禁食组)；第二组小鼠饥饿过夜后，进行喂食1h(进食组)。用肝素锂处理后的抗凝管分别收集两组小鼠的血液，在4℃、15000rpm下离心10分钟，上清即为血浆，将其转移到新的离心管中。血浆用spin albumin and igg erasin kit试剂盒处理，除去其中的igg和白蛋白。处理后的血浆与5
×
sds上样缓冲液(250mm tris-hcl，ph6.8，10％sds，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-me)混匀，在100℃下煮样10分钟，进行sds-page蛋白电泳。电泳完成后进行银染，结果显示，与禁食组相比，进食组在餐后1h诱导的蛋白条带在～20kda到～50kda之间明显不同(图1a)。
[0371]
对这些差异蛋白条带切胶进行质谱鉴定，以确定差异条带对应的蛋白。结果共鉴定出205个分泌蛋白，其中小鼠mc5orf24蛋白(在小鼠中由b230219d22rik编码)(图1b)引起了发明人的注意，其对应的人同源蛋白为hc5orf24，该蛋白在以前的文献中未报道到。
[0372]
1.2进食后小鼠以及人的血糖、血浆feimin和胰岛素水平的测定
[0373]
本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型雄性小鼠，将小鼠随机分成9组，每组6只。其中，第1组为饥饿过夜的小鼠(禁食组)；第2组至第9组小鼠(进食组)饥饿过夜后，分别喂食15、30、45、60、90、120、150、180分钟。将这9组小鼠在处死之前分别测试血糖，然后分别收集血浆。统计了这9组小鼠的血糖变化，并检测了血浆中的胰岛素和feimin的水平。
[0374]
用mercodia公司的胰岛素测定试剂盒(货号：10124701)按照说明书中的实验方法对血浆中胰岛素的含量进行测定。采用夹心法酶联免疫吸附剂测定检测feimin的含量，具体操作如下：将捕获抗原的一抗按照适宜浓度稀释于包被液(0.05mol/l na2co3/nahco3，ph8.0)中，在聚苯乙烯微孔板每孔加入100μl包被液，4℃摇床包被过夜后，将包被好的板子取出，弃去包被液，每孔加入250μl tbst溶液洗4次，最后一次将液体尽量甩干，每孔加入100μl封闭液(5％bsa溶解于tbst溶液)，放于室温摇床封闭1小时。弃去封闭液，每孔加入250μl tbst溶液洗4次，最后一次将液体尽量甩干。将蛋白标准品溶解于基因敲除小鼠的5μl血浆和封闭液的混合溶液中，终体积为100μl，配制成适宜浓度梯度的标准溶液。同时，将待检测的5μl血浆溶于封闭液中，终体积为100μl，4℃摇床孵育过夜。弃去抗原，每孔加入250μltbst溶液洗4次，最后一次将液体尽量甩干。将检测一抗配制于封闭液中，每孔加入的100μl，4℃摇床孵育过夜。弃去检测一抗，每孔加入250μl tbst溶液洗4次，最后一次将液体尽量甩干。将二抗配制于封闭液中，每孔加入100μl，室温摇床孵育1小时。弃去二抗，每孔加入250μl tbst溶液洗4次，最后一次将液体尽量甩干。每孔加入100μl tmb底物，室温摇床孵育30分钟到一小时。随后每孔加入50μl终止液(0.05mol/l h2so4)，30分钟内用酶标仪读取od450nm的吸光值，根据标准曲线的吸光值计算得出待测样品中feimin和胰岛素的含量。
[0375]
实验结果表明，随着进食后小鼠血糖水平的升高，血浆中feimin蛋白水平也迅速
升高，60分钟后达到峰值(约400pm)，但其分泌的时间相对于胰岛素更慢(图2a)。
[0376]
为了观察人群中是否也存在和小鼠同样的分泌变化，对临床数据进行了分析。比较了10对健康人饥饿过夜和餐后1小时的血糖水平，血浆胰岛素水平和feimin水平。结果显示，随着餐后血糖水平的升高(图2b)，血浆中的胰岛素明显上升(图2c)，feimin的含量也上升(图2d-2e)。
[0377]
1.3feimin的组织分布
[0378]
本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型雄性小鼠，共5只，分别取小鼠的小肠，肾脏，肌肉，肝脏，棕色脂肪组织和白色脂肪组织。配制组织裂解液(50mm hepes ph7.4，150mm nacl，1％tritonx-100)，根据裂解液的体积加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，以配制组织蛋白提取液。称取40mg肝脏组织加入400μl提取液，40mg肌肉组织加入350μl提取液，30mg棕色脂肪组织加入300μl提取液，200mg白色脂肪组织加入250μl提取液，30mg肾脏组织加入300μl提取液，40mg小肠组织加入400μl提取液置于1.5ml的离心管中。每个离心管中加入2个小钢珠，置于组织研磨仪中，研磨频率为60hz，研磨时间为2分钟。研磨完后用4℃预冷的离心机15000rpm离心15分钟，当组织中脂质含量较多时，将第一次离心上清转移到新的离心管中，同样参数再离心15分钟。取上清加入5
×
sds上样缓冲液充分混匀后置于100℃金属浴加热10分钟，得到组织的蛋白样品，然后进行sds-page蛋白电泳，以在蛋白水平上测定feimin的组织分布。同时还通过定量pcr在mrna水平上测定了feimin的小鼠组织中的分布。还通过定量pcr对人组织样品中的feimin的mrna水平进行了检测。
[0379]
结果如图3a和3b所示。结果显示feimin在小鼠的肌肉组织、脂肪组织和肠道中高表达，并且在人中具有类似的组织分布。
[0380]
1.4feimin敲除小鼠模型的血浆feimin水平测定
[0381]
由于feimin在小鼠的肌肉组织、脂肪组织和肠道中高表达，因此构建了小肠(iko)、肌肉(mko)、肝脏(lko)和脂肪组织(fko)特异性敲除feimin的小鼠模型，以及feimin全身性敲除的小鼠模型。为了探究血清中的femin是由哪个组织分泌的，对不同类型的小鼠模型分别进行以下处理：将小鼠随机分成2组，每组6只。其中，第一组小鼠饥饿过夜，第二组小鼠饥饿过夜后，进行喂食1h。然后分别收集小鼠血浆，对feimin的含量进行测定。
[0382]
elisa结果和免疫印迹结果显示，与野生型(wt)小鼠相比，mko小鼠血浆中的feimin水平在进食后没有明显变化(图4a-4b)。这些结果表明，血浆中的feimin是由肌肉组织分泌的。
[0383]
1.5注射葡萄糖后wt小鼠和mko小鼠血浆feimin水平的测定
[0384]
本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型(wt)雄性小鼠以及mko小鼠，将两种小鼠分别分成6组，每组6只。其中，第1组为饥饿过夜的小鼠；第2组至第6组小鼠饥饿过夜后，分别腹腔注射1g/kg葡萄糖，并于注射后15、30、45、60、90、120分钟取血。对这6组小鼠分别收集血浆，统计这6组小鼠的血糖变化，并检测血浆中的胰岛素和feimin的水平。
[0385]
结果显示，wt小鼠注射葡萄糖后血浆feimin水平升高，并且与血浆胰岛素水平相比，feimin水平升高地更强也更慢(图5a)；相比而言，mko小鼠在注射葡萄糖后血浆feimin水平不变(图5b)，血糖水平升高(图5c)。
[0386]
1.6小鼠耐力运动实验
[0387]
本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄wt雄性小鼠以及mko小鼠，分别分成2组，每组6只，一组为运动组，一组为对照组。运动组的小鼠进行了8周的持续运动，在这8周中小鼠每天以10m/min的速度进行转轮运动1个小时(图6a)。对照组小鼠不进行相应的运动。56天后，分别取这2组小鼠的血浆，用elisa和免疫印迹方法测定小鼠血浆中的feimin水平变化。
[0388]
实验结果显示，wt小鼠在经过持续8周的运动后血浆中的feimin水平相对于对照组明显升高，而mko小鼠在运动后血浆中的feimin水平相对于对照组没有明显变化(图6b-6c)。
[0389]
1.7人耐力运动实验
[0390]
为了观察人长期运动后血浆中的feimin水平是否也发生了同样的变化，招募了志愿者参与了耐力运动实验。将志愿者随机分成2组，一组为运动组，一组为对照组。运动组的志愿者在一周中进行中强度运动(30分钟跑步4公里以上)5天，休息2天，并且连续运动4周(图7a)。对照组志愿者不进行相应的运动。
[0391]
结果显示，人耐力运动实验记过与小鼠的结果类似，人类运动后的血浆中的feimin水平相对于对照组也得到提高(图7b-7c)。
[0392]
实施例1的上述实验结果表明，feimin是一种由进食(或高糖)和运动共同诱导的肌激素。
[0393]
实施例2：feimin调节葡萄糖稳态
[0394]
2.1小鼠血糖水平、肝脏和肌肉糖原水平的测定
[0395]
本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄wt雄性小鼠以及mko小鼠，分别分成2组，每组8只。第一组小鼠饥饿过夜，第二组小鼠饥饿过夜后，进行喂食2h。然后分别取尾静脉血测量进食1个小时和2个小时的血糖值。
[0396]
为了比较wt和mko小鼠的肝脏和肌肉糖原储存，在自由进食饮水状态下，于当天上午9点处死小鼠，分别称取25mg左右的肝脏和肌肉组织于离心管中，加入250μl的超纯水，每个离心管中加入2个小钢珠，置于组织研磨仪中，研磨频率为60hz，研磨时间为2分钟。研磨完毕后100℃金属浴加热5min，使酶失活，13000g室温离心5分钟，上清即为提取出来的糖原。肌肉组织中的糖原可以直接测量，肝脏组织需要稀释后测量(glycogen assay kit，sigma，mak016)。根据标准曲线计算得到样品中的糖原含量，将样品中的糖原含量除以样品质量，即可得到单位质量组织中糖原的含量。
[0397]
实验结果显示，与wt小鼠相比，mko小鼠在喂食后血糖水平升高(图8a)，肝脏和肌肉糖原储存降低(图8b-8c)。
[0398]
2.2小鼠葡萄糖摄取的测定
[0399]
本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄wt雄性小鼠以及mko小鼠，每组8只。通过生物发光法、2-nbdg法和葡萄糖转运蛋白4(slc2a4)的水平来评估小鼠组织的葡萄糖摄取能力。
[0400]
对于生物发光法，构建了表达荧光素酶的aav9病毒，并通过三苯基膦荧光素和叠氮葡萄糖的生物正交反应来量化小鼠组织的葡萄糖摄取能力。实验原理是三苯基膦荧光素可以通过自由扩散的方式进入细胞或组织中，叠氮葡萄糖可以被葡萄糖转运蛋白转运至细胞内，二者在细胞内可以发生生物正交反应，生成的化合物可将荧光素释放出来，游离的荧
光素在荧光素酶的催化下发出荧光，荧光强度与进入细胞或组织中的叠氮葡萄糖含量成正比，因此可直接反应细胞或组织的葡萄糖摄取能力。具体的实验流程如下：1)为了使小鼠表达荧光素酶，每只小鼠注射aav9的病毒量为1
×
10^12，通过尾静脉注射4
×
10^11，每只后腿的腓肠肌和胫骨前肌各定点注射3
×
10^11，感染3-4周；2)实验前24小时通过腹腔注射的方式给小鼠注射浓度为1.5mm的三苯基膦荧光素100μl，并将小鼠过夜饥饿12小时以上；3)实验当天上午让小鼠进食一个小时，而后撤掉食物并将小鼠麻醉，根据小鼠体重12mg/kg，配制合适浓度的叠氮葡萄糖，每只小鼠腹腔注射100μl；4)立即用荧光成像仪拍摄记录荧光值。生物发光成像结果如图9a所示。
[0401]
对于2-nbdg法，其实验原理为：2-nbdg是常用的葡萄糖类似物，第二位的羟基被荧光基团取代，使之可以被细胞或组织正常摄取但却不能被糖酵解途径正常代谢。2-nbdg的最大激发/发射波长为475/550nm，荧光强度与进入细胞或组织中的2-nbdg含量成正比，可直接反应细胞或组织的葡萄糖摄取能力。具体的实验流程如下：1)实验前将小鼠过夜饥饿12小时以上；2)实验当天上午让小鼠进食45分钟，而后撤掉食物，根据小鼠体重12mg/kg，配制合适浓度的2-nbdg，每只小鼠腹腔注射100μl；3)5分钟后处死小鼠，收取肝脏，肌肉，脂肪组织并迅速置于液氮中保存；4)称取适当重量的小鼠组织于1.5ml的离心管中，每个离心管中加入2个小钢珠，加入适量的组织裂解液(50mm hepes ph7.4，150mm nacl，1％tritonx-100)。根据裂解液的体积加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂配制组织蛋白提取液。置于组织研磨仪中，研磨频率为60hz，研磨时间为2分钟。研磨完后用4℃预冷的离心机15000rpm离心15分钟，脂肪组织中脂含量较多，需将第一次离心上清转移到新的离心管中，同样参数再离心15分钟。上清即为提取得到的含有2-nbdg的裂解液；5)将2-nbdg储液稀释到组织裂解液中，配制标准曲线。将提取得到的上清和标准曲线加入黑色的96孔板中，选择合适的激发波长读取荧光值，代入标准曲线计算得到组织中2-nbdg的含量。实验结果如图9b所示。
[0402]
为了进一步量化小鼠组织的葡萄糖摄取能力，还在小鼠的脂肪组织和肌肉组织中检测了slc2a4的表达。肌肉和脂肪组织中的葡萄糖摄取主要依赖于葡萄糖转运蛋白4(slc2a4，也称为glut4)，该蛋白在静息状态下以囊泡(vesicle)的形式定位于细胞质中，当接收到血液中的胰岛素等信号的刺激时会从细胞质转移到细胞膜上，并将血液中的葡萄糖运入细胞中，实现细胞对葡萄糖的摄取。具体实验步骤如下：1)收取小鼠组织：根据实验设计收取小鼠的脂肪组织、骨骼肌并立即置于pbs配制的4％的多聚甲醛溶液中4℃固定过夜；2)组织脱水：根据oct和石蜡包埋剂的不同分别进行不同的脱水处理；3)组织包埋：肌肉组织取出后可直接用oct包埋剂直接包埋，脂肪组织需要用oct:30％蔗糖＝2:1的包埋剂包埋；对于肝脏组织和肌肉组织在包埋盒中加入一半体积的包埋剂并放入组织块，再加入另一半包埋剂置于-80℃冷冻过夜；对于脂肪组织容易漂浮在包埋剂上方，因此首先在包埋盒中加入一半体积的包埋剂并放入组织块，置于-20℃待包埋剂凝固后再用包埋剂填充整个包埋盒，同样置于-80℃冷冻过夜；脂肪组织石蜡包埋后将蜡块放于-20℃储存；4)组织切片：用冷冻切片机切取冷冻切片；肌肉组织切片厚度为10μm，对于脂肪组织切片厚度为30μm，将组织切片粘在阳离子防脱玻片上，置于-80℃保存；脂肪组织的石蜡切片厚度为5μm；5)将石蜡切片进行抗原修复后和冷冻切片一起置于免疫荧光湿盒中，用免疫组化笔在组织外围画一个闭合的圈，先用pbs洗两遍，再用pbs配制的0.2％的triton-x 100穿透5分钟，用tbst配制的5％bsa封闭液室温封闭1小时；6)弃去封闭液，用封闭液稀释的一抗4℃孵育过
夜；7)回收一抗，tbst洗3次，用封闭液稀释的二抗室温孵育一个半小时；8)弃去二抗，tbst洗3次，加入稀释于pbs缓冲液中终浓度为0.5mg/ml的dapi室温避光孵育5min；9)弃去dapi，用tbst溶液室温洗三次，每次10min；10)尽量吸干组织表面的溶液，根据组织大小在玻片表面滴加适量的封片剂，小心的盖上盖玻片，避免产生气泡，室温避光放置直至封片剂凝固，室温避光放置随后即可进行成像观察。实验结果如图9c所示。
[0403]
图9a的结果显示，mko小鼠的葡萄糖摄取比wt小鼠明显减弱。图9b的结果显示，在肌肉和脂肪两个个主要代谢组织中，mko小鼠的葡萄糖摄取比wt小鼠明显减弱。图9c的结果显示，与wt小鼠相比，mko小鼠的脂肪组织和肌肉组织细胞膜上的slc2a4信号强度减弱。这些结果表明，与wt小鼠相比，mko小鼠的葡萄糖摄取能力明显降低。
[0404]
2.3高胰岛素葡萄糖钳夹实验和丙酮酸耐受试验
[0405]
选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄wt雄性小鼠以及mko小鼠进行高胰岛素葡萄糖钳夹实验(每组5只)。高胰岛素葡萄糖钳夹实验可在生理层面上对小鼠整体的胰岛素敏感性和肝脏的葡萄糖生成能力进行评估，该实验步骤如下：1)准备实验试剂和材料：人重组胰岛素，生理盐水，麻醉剂，肝素，硅胶动脉插管，50％葡萄糖(溶于生理盐水)；2)手术过程如下：将小鼠麻醉后，四肢用胶布固定，牙用线绷紧充分暴露颈部。分离出颈静脉，将用肝素溶液预先处理的硅胶管植入静脉中。将导管从小鼠后颈处穿出并封口，随后缝合好伤口。手术后恢复4-5天。3)实验前一天将小鼠饥饿过夜，饥饿过夜后根据小鼠的体重，先按照600μg/kg的剂量持续输注[u-13c6]葡萄糖90min。在第80min和90min收集50μl血液。随后分别按照600μg/kg和6mu/kg的剂量配制[u-13c6]葡萄糖和胰岛素的混合溶液对小鼠进行灌注，并同时灌注50％的葡萄糖，在这一过程中保持[u-13c6]葡萄糖和胰岛素的灌注速率不变，根据小鼠的血糖及时调整葡萄糖输注速率(glucose infusion rate，gir)，使血糖水平维持在100
±
5mg/dl。当血糖稳定30min后，收取30min和40min时的血液，并记录此时的葡萄糖注射速率。4)将上述四个时间点的血液样本离心，吸取15μl的血浆并加入60μl预冷的甲醇充分混匀，并于-80℃冰箱静置2个小时以上。随后，吸取上清并送清华大学代谢组学平台对其中的葡萄糖和[u-13c6]葡萄糖进行量化鉴定。5)根据葡萄糖注射速率结合鉴定结果计算得到葡萄糖处置速率(glucose disposal rate，gdr)，肝脏葡萄糖生成(hepatic glucose production，hgp)，胰岛素刺激下的葡萄糖处置能力(insulin-stimulated gdr，is-gdr)。实验结果如图10a所示。
[0406]
选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄wt雄性小鼠以及mko小鼠进行丙酮酸耐受试验(每组8只)。丙酮酸耐受试验可以很好的反映机体的糖异生能力。作为糖异生的底物之一，丙酮酸被腹腔注射到小鼠体内后可以被转化为葡萄糖。因此，可以通过测量腹腔注射后小鼠血液中的葡萄糖水平用来反映机体的糖异生能力。该实验方法如下：将野生型小鼠和基因敲除小鼠进行16小时的过夜饥饿处理，饥饿过程中撤去饲养垫料并更换为纸卷垫料。丙酮酸钠的注射量为1g/kg，根据实验中小鼠的体重和数量，用pbs溶液配制合适数量的质量分数为20％的丙酮酸钠溶液，并用0.22μm滤器过滤除菌。通过尾尖采血的方式，用血糖仪测定小鼠饥饿16小时后的血糖值，记为0点的血糖值。而后，给小鼠腹腔注射丙酮酸钠溶液，采用同样的采血方式，分别测定注射后15、30、60、90、120分钟时的血糖值。实验结果如图10b所示。
[0407]
高胰岛素葡萄糖钳夹实验的结果表明，与wt小鼠相比，mko小鼠的肝脏葡萄糖生成
速率(hgp)增强(图10a)，葡萄糖输注速率(gir)、葡萄糖处置速率(gdr)和胰岛素刺激下的gdr(is-gdr)均显著降低(图10b-10d)。由丙酮酸耐受试验的结果可知，与wt小鼠相比，mko小鼠的肝脏葡萄糖生成增强(图10e)。
[0408]
2.4糖耐量试验和胰岛素耐量试验
[0409]
本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄wt雄性小鼠以及mko小鼠进行糖耐量试验和胰岛素耐量试验。
[0410]
糖耐量实验的实验步骤如下：将小鼠进行16小时的过夜饥饿处理，饥饿过程中撤去饲养垫料并更换为纸卷垫料。葡萄糖的注射量为1g/kg，根据实验中小鼠的体重和数量，用pbs溶液配制合适数量的质量分数为20％的葡萄糖溶液，并用0.22μm滤器过滤除菌。通过尾尖采血的方式，用血糖仪测定小鼠饥饿16小时后的血糖值，记为0点的血糖值。而后，给小鼠腹腔注射葡萄糖溶液，采用同样的采血方式，分别测定注射后15、30、60、90、120分钟时的血糖值。结果如图11a所示。
[0411]
胰岛素耐量实验的实验步骤如下：实验当天将小鼠进行6小时的饥饿处理，饥饿过程中撤去饲养垫料并更换为纸卷垫料。胰岛素的注射量为0.75u/kg，根据实验中小鼠的体重和数量，用pbs溶液配制合适数量的胰岛素溶液。通过尾尖采血的方式，用血糖仪测定小鼠饥饿6小时后的血糖值，记为0点的血糖值。而后，给小鼠腹腔注射胰岛素溶液，采用同样的采血方式，分别测定注射后15、30、60、90、120分钟时的血糖值。结果如图11b所示。
[0412]
图11a和11b的结果显示，与wt小鼠相比，mko小鼠的葡萄糖耐受能力和胰岛素敏感性均减弱。
[0413]
2.5小鼠组织中甘油三酯水平和血浆胰岛素水平的测定
[0414]
本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型和同窝出生的mko小鼠的雄鼠进行实验。
[0415]
为了测量小鼠血浆中的甘油三酯(tg)和胰岛素水平，收取自由进食饮水状态下小鼠的血液。取血方式为眼球取血，用肝素锂处理后的抗凝管收集血液，4℃15000rpm离心10分钟得到血浆。分别用sigma公司的甘油三酯测定试剂盒(货号：66500)和mercodia公司的胰岛素测定试剂盒(货号：10124701)按照说明书中的实验方法对血浆中甘油三酯和胰岛素的含量进行测定。实验结果如图12a-12b所示。
[0416]
为了测量小鼠肝脏中的甘油三酯(tg)水平，收取自由进食饮水状态下小鼠的肝脏组织。称取25mg左右的肝脏组织于离心管中，加入250μl的5％np40溶液，每个离心管中加入2个小钢珠，置于组织研磨仪中，研磨频率为60hz，研磨时间为2分钟。研磨完毕后先100℃金属浴加热5min，再取出冷却至室温，重复一次。15000rpm室温离心5分钟，上清即为提取出来的甘油三酯。稀释5倍后用sigma公司的甘油三酯测定试剂盒(货号：66500)按照说明书中的实验方法对其中甘油三酯的含量进行测定。将样品中的甘油三酯含量除以样品质量，即可得到单位质量肝脏组织中甘油三酯的含量。实验结果如图12c所示。
[0417]
为了测量小鼠脂肪组织中的甘油三酯(tg)水平，收取自由进食饮水状态下小鼠的棕色脂肪组织，并迅速置于4％的pfa中固定过夜。第二天将固定好的组织进行脱水处理，随后进行石蜡包埋。蜡块可放于-20℃储存。将石蜡组织进行切片，切片厚度为5um。随后进行脱蜡和苏木精伊红染色，并显微镜下观察。实验结果如图12d所示。
[0418]
图12a显示，与wt小鼠相比，mko小鼠血浆中甘油三酯水平升高。图12b显示，与wt小
鼠相比，mko小鼠血浆中胰岛素水平升高。图12c显示，与wt小鼠相比，mko小鼠肝脏中甘油三酯水平升高。图12d显示，与wt小鼠相比，mko小鼠棕色脂肪组织中甘油三酯堆积。这些结果表明，与wt小鼠相比，mko小鼠的胰岛素敏感性降低。
[0419]
实施例2的上述实验结果表明，femin通过促进葡萄糖摄取和抑制葡萄糖生成来调节葡萄糖稳态，并且能增加胰岛素的敏感性。
[0420]
实施例3：mertk是feimin的受体
[0421]
3.1feimin作用的靶组织
[0422]
为了鉴定feimin作用的靶组织，将纯化的gst-feimin与不同的小鼠组织孵育在冷冻组织切片上进行体外结合实验。具体过程如下：1)收取小鼠组织：根据实验设计收取小鼠的脂肪组织(白色脂肪和棕色脂肪)、肌肉、肝脏和肾脏组织，并立即置于pbs配制的4％的多聚甲醛溶液中4℃固定过夜；2)组织脱水：根据oct和石蜡包埋剂的不同分别进行不同的脱水处理；3)组织包埋：肌肉组织、肝脏和肾脏组织取出后可直接用oct包埋剂直接包埋，脂肪组织需要用oct:30％蔗糖＝2:1的包埋剂包埋；对于肝脏组织和肌肉组织在包埋盒中加入一半体积的包埋剂并放入组织块，再加入另一半包埋剂置于-80℃冷冻过夜；对于脂肪组织容易漂浮在包埋剂上方，因此首先在包埋盒中加入一半体积的包埋剂并放入组织块，置于-20℃待包埋剂凝固后再用包埋剂填充整个包埋盒，同样置于-80℃冷冻过夜；4)组织切片：用冷冻切片机切取冷冻切片；肌肉组织、肝脏和肾脏组织切片厚度为10μm，对于脂肪组织切片厚度为30μm，将组织切片粘在阳离子防脱玻片上，置于-80℃保存；5)冷冻切片一起置于免疫荧光湿盒中，置于室温1h化冻，用免疫组化笔在组织外围画一个闭合的圈，并用pbs洗两遍；6)蛋白结合：配制结合蛋白(其中gst-feimin 200nm；gst 200nm)，其中竞争组为20倍的feimin-his，约4um，室温孵育1h；7)蛋白孵育结束后，用pbs洗2遍，用tbst配制的5％bsa封闭液室温封闭1小时；8)弃去封闭液，用封闭液稀释的一抗常温孵育2h；9)弃去一抗，tbst洗3次，用封闭液稀释的二抗室温孵育1h；10)弃去二抗，tbst洗3次，加入稀释于pbs缓冲液中终浓度为0.5mg/ml的dapi室温避光孵育5min；11)弃去dapi，用tbst溶液室温洗三次，每次10min；12)尽量吸干组织表面的溶液，根据组织大小在玻片表面滴加适量的封片剂，小心的盖上盖玻片，避免产生气泡，室温避光放置直至封片剂凝固，室温避光放置后进行成像观察。
[0423]
由免疫荧光的结果可知，gst-feimin在肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织中均存在结合信号，并且在肝脏、白色脂肪组织和肌肉中的结合信号相对更强。这种结合是特异性的，因为与高浓度feimin-his竞争孵育的切片完全消除了组织中的信号(图13)。这表明肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织是feimin作用的靶组织。
[0424]
3.2feimin受体的鉴定
[0425]
为了鉴定feimin的受体，进行了高通量筛选，评估了feimin与sirna文库的结合，sirna文库由靶向hek293t细胞表面上编码人类单pass跨膜蛋白(stmps)的950个基因构成。根据筛选结果，将酪氨酸激酶受体mer(mertk)确定为feimin的候选受体。
[0426]
mertk是tam(tyro3、axl和mertk)受体酪氨酸激酶家族的成员之一。tam及其同源配体结构域，生长阻滞特异性蛋白6(gas6)和蛋白s(pros1)通过激活下游信号(如akt和mapk)在成人组织中发挥稳态调节作用。
[0427]
mertk是单次跨膜蛋白，其胞外区域由两个免疫球蛋白样结构域和两个纤维连接
蛋白iii结构域组成，在疏水的跨膜结构后是一个酪氨酸激酶结构域，具有kwiaies序列。mertk和配体结合后诱导自磷酸化激活，并影响下游的信号通路和细胞功能，如akt信号通路。目前的研究表明，已知的配体gas6和pros1均能分别激活mertk，在细胞凋亡，细胞免疫等重要的生命活动中发挥了作用。
[0428]
为了研究mertk是否为feimin的受体，选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型wt雄性小鼠以及mertk-ko小鼠，进行如下实验操作：1)收取小鼠组织：根据实验设计收取小鼠的脂肪组织(白色脂肪和棕色脂肪)、肌肉、肝脏和肾脏组织，并立即置于pbs配制的4％的多聚甲醛溶液中4℃固定过夜；2)组织脱水：根据oct和石蜡包埋剂的不同分别进行不同的脱水处理；3)组织包埋：肌肉组织、肝脏和肾脏组织取出后可直接用oct包埋剂直接包埋，脂肪组织需要用oct:30％蔗糖＝2:1的包埋剂包埋；对于肝脏组织和肌肉组织在包埋盒中加入一半体积的包埋剂并放入组织块，再加入另一半包埋剂置于-80℃冷冻过夜；对于脂肪组织容易漂浮在包埋剂上方，因此首先在包埋盒中加入一半体积的包埋剂并放入组织块，置于-20℃待包埋剂凝固后再用包埋剂填充整个包埋盒，同样置于-80℃冷冻过夜；4)组织切片：用冷冻切片机切取冷冻切片。肌肉组织、肝脏和肾脏组织切片厚度为10μm，对于脂肪组织切片厚度为30μm，将组织切片粘在阳离子防脱玻片上，置于-80℃保存；5)冷冻切片一起置于免疫荧光湿盒中，置于室温1h化冻，用免疫组化笔在组织外围画一个闭合的圈，并用pbs洗两遍；6)蛋白结合：配制结合蛋白(其中gst-feimin 200nm；gst 200nm)，室温孵育1h；7)蛋白孵育结束后，用pbs洗2遍，用tbst配制的5％bsa封闭液室温封闭1小时；8)弃去封闭液，用封闭液稀释的一抗常温孵育2h；9)弃去一抗，tbst洗3次，用封闭液稀释的二抗室温孵育1h；10)弃去二抗，tbst洗3次，加入稀释于pbs缓冲液中终浓度为0.5mg/ml的dapi室温避光孵育5min；11)弃去dapi，用tbst溶液室温洗三次，每次10min；12)尽量吸干组织表面的溶液，根据组织大小在玻片表面滴加适量的封片剂，小心的盖上盖玻片，避免产生气泡，室温避光放置直至封片剂凝固，室温避光放置后进行成像观察。实验结果如图14a所示。
[0429]
同时，还在遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型wt雄性小鼠以及mertk-ko小鼠的原代肝细胞上进行了饱和结合实验。具体过程如下：1)分别分离wt和mertk-ko小鼠的原代肝细胞；2)将纯化后的feimin用生物素标记试剂盒进行标记，并测定生物素标记的feimin浓度；3)分离得到状态良好的原代肝细胞后，将其铺到12孔板中培养，37度恒温细胞培养箱中培养24h；3)弃培养基，加入5％bsa(用m199培养基配制)，孵育30min；4)弃封闭液，加入不同梯度的feimin-biotin蛋白(0，1，5，10，20，40，69，80um)，分别加到两组原代肝细胞中，每个实验组设置3个重复，37℃孵育30min；4)孵育后，弃去培养基，用tbst洗3次，加入用1％bsa的pbs缓冲液配制的高敏性-hrp-链霉亲和素抗体(1：8000)，孵育1h；6)弃去培养基，加入pbs缓冲液洗三次，加入200ul细胞裂解液(50mm hepes ph7.4，150mm nacl，1％tritonx-100)裂解细胞，取1ul用于蛋白定量，取30ul转移到96空板中加入100ul可溶性单组份tmb底物溶液置于室温避光孵育显色，显色至合适成都后加入100ul 0.1mol/l硫酸溶液终止反应，置于酶标仪中检测od450nm吸光值，吸光值与蛋白量的比值代表特定浓度feimin与细胞的结合，通过graphpad软件分析不同浓度feimin与原代肝细胞结合量的关系，从而得到饱和结合曲线。实验结果如图14b所示。
[0430]
由图14a的免疫荧光结果可知，feimin结合mertk-ko小鼠的肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织的能力明显减弱。从图14b的饱和曲线可知，mertk-ko小鼠细胞的饱和结合程度明显
下降。这些结果表明，mertk是feimin的受体，并且分布在肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织中。
[0431]
3.3feimin与mertk的结合亲和力
[0432]
微量热泳动技术是一项基于分子热泳动特性对生物大分子间相互作用进行量化的技术，本实施例中使用该技术来测量feimin与mertk的结合亲和力，具体实验步骤如下：1)受体荧光标记：我们从hi5细胞中纯化出mertk蛋白，将其浓缩至约100ul，浓度约为0.4ug/ul，取90ul蛋白样品使用red-nhs蛋白氨基标记试剂盒对其进行荧光标记，标记后其浓度为标记前1/5,体积扩大至450ul，对标记后的样品进行荧光信号检测，根据荧光信号强度确定mst实验使用的受体终浓度为20nm；2)将feimin蛋白用superdex200incresae 5/15gl分子筛层析柱置换到pbs缓冲液，用pbs缓冲液将feimin稀释至32um，并用pbs 1：1进行梯度稀释形成16个浓度梯度，取10ul feimin加入10ul 40nm标记好的mertk，充分混匀后室温静置30min；3)用monolith nt.115优化型毛细管吸取样品，按照feimin的浓度从高至低一次置于载样台上，放入微量热泳动仪器中进行测量，设定测量参数为10％led power以及40％mstpower，使用nanotemper分析软件对实验结果进行分析计算得到feimin与mertk蛋白间的平衡解离常数kd值。
[0433]
结果如图15所示，结果显示，feimin与mertk具有高结合亲和力，其中kd值为50.39
±
2.75nm。
[0434]
实施例4：mertk敲除破坏葡萄糖稳态
[0435]
4.1mertk敲除小鼠的血糖、糖原贮存和葡萄糖摄取的测定
[0436]
血糖水平检测：选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型和同窝出生的mertk全身性敲除小鼠的雄鼠进行实验。实验前一天过夜饥饿，过夜饥饿后自由进食饮水2个小时。用血糖仪测量进食1个小时和2个小时的野生型和肌肉组织特异性小鼠血液中葡萄糖的水平。每组有10只小鼠，实验独立重复3次。实验结果如图16a所示。
[0437]
糖原水平检测：选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型和同窝出生的mertk全身性敲除小鼠的雄鼠进行实验。实验时小鼠处于自由进食饮水的状态。处死小鼠后收集小鼠的肝脏和肌肉组织，并迅速置于液氮中保存。实验时称取30mg左右的肝脏和肌肉组织，按照sigma公司的糖原检测试剂盒(货号：mak016)中的实验方法提取并测定其中的糖原含量。实验结果如图16b-16c所示。
[0438]
2-nbdg法测定葡萄糖摄取：选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型和同窝出生的mertk全身性敲除小鼠的雄鼠进行实验。实验前一天过夜饥饿，过夜饥饿后自由进食饮水1个小时。一个小时后撤去食物，根据小鼠体重按照12mg/kg的剂量腹腔注射2-nbdg，5min后处死小鼠，收取小鼠的脂肪和肌肉组织，并迅速置于液氮中保存。实验时称取100mg左右的肝脏和肌肉组织，加入组织裂解液(50mm hepes ph7.4，150mm nacl，1％tritonx-100)，根据裂解液的体积加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂配制组织蛋白提取液，提取其中的2-nbdg。5)将2-nbdg储液稀释到组织裂解液中，配制标准曲线。将提取得到的上清和标准曲线加入黑色的96孔板中，选择合适的激发波长读取荧光值，代入标准曲线计算得到组织中2-nbdg的含量。实验结果如图16d所示。
[0439]
生物发光法测定葡萄糖摄取：选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型和同窝出生的mertk全身性敲除小鼠的雄鼠进行实验。具体的实验流程如下：1)为了使小鼠表达荧光素酶，每只小鼠注射aav9的病毒量为1x10^12，通过尾静脉注射4x10^11，每只后腿的腓肠
肌和胫骨前肌各定点注射3x10^11，感染3-4周；2)实验前24小时通过腹腔注射的方式给小鼠注射浓度为1.5mm的三苯基膦荧光素100μl，并将小鼠过夜饥饿12小时以上；3)实验当天上午让小鼠进食一个小时，而后撤掉食物并将小鼠麻醉，根据小鼠体重12mg/kg，配制合适浓度的叠氮葡萄糖，每只小鼠腹腔注射100μl；4)立即用荧光成像仪拍摄记录荧光值40min。生物发光成像结果如图16e所示。
[0440]
通过slc2a4的表达测定葡萄糖摄取：选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型和同窝出生的mertk全身性敲除小鼠的雄鼠进行实验。具体实验步骤如下：1)收取小鼠组织：实验前一天过夜饥饿，过夜饥饿后自由进食饮水1个小时。一个小时后处死小鼠，收取小鼠的脂肪和肌肉组织，并迅速置于4％的pfa中固定过夜。2)组织脱水：根据oct和石蜡包埋剂的不同分别进行不同的脱水处理；3)组织包埋：肌肉组织取出后可直接用oct包埋剂直接包埋，脂肪组织需要用oct:30％蔗糖＝2:1的包埋剂包埋。对于肝脏组织和肌肉组织在包埋盒中加入一半体积的包埋剂并放入组织块，再加入另一半包埋剂置于-80℃冷冻过夜。对于脂肪组织容易漂浮在包埋剂上方，因此首先在包埋盒中加入一半体积的包埋剂并放入组织块，置于-20℃待包埋剂凝固后再用包埋剂填充整个包埋盒，同样置于-80℃冷冻过夜。脂肪组织石蜡包埋后将蜡块放于-20℃储存；4)组织切片：用冷冻切片机切取冷冻切片。肌肉组织切片厚度为10μm，对于脂肪组织切片厚度为30μm，将组织切片粘在阳离子防脱玻片上，置于-80℃保存；脂肪组织的石蜡切片厚度为5μm；5)将石蜡切片进行抗原修复后和冷冻切片一起置于免疫荧光湿盒中，用免疫组化笔在组织外围画一个闭合的圈，先用pbs洗两遍，再用pbs配制的0.2％的triton-x 100穿透5分钟，用tbst配制的5％bsa封闭液室温封闭1小时；6)弃去封闭液，用封闭液稀释的一抗4℃孵育过夜；7)回收一抗，tbst洗3次，用封闭液稀释的二抗室温孵育一个半小时；8)弃去二抗，tbst洗3次，加入稀释于pbs缓冲液中终浓度为0.5mg/ml的dapi室温避光孵育5min；9)弃去dapi，用tbst溶液室温洗三次，每次10min；10)尽量吸干组织表面的溶液，根据组织大小在玻片表面滴加适量的封片剂，小心的盖上盖玻片，避免产生气泡，室温避光放置直至封片剂凝固，室温避光放置随后即可进行成像观察。实验结果如图16f所示。
[0441]
图16a的结果表明，进食后mertk全身性敲除小鼠的血糖水平高于野生型小鼠。图16b-16c的结果表明，mertk全身性敲除小鼠的糖原储存量少于野生型小鼠。图16d的结果表明，与野生型小鼠相比，mertk全身性敲除小鼠的肌肉和脂肪组织的葡萄糖摄取能力降低。图16e的结果表明，与野生型小鼠相比，mertk全身性敲除小鼠的葡萄糖摄取能力降低。图16f的结果表明，与野生型小鼠相比，mertk全身性敲除小鼠的脂肪、肌肉组织中定位于细胞膜上的slc2a4减少。这些结果表明，mertk敲除导致小鼠的血糖升高、糖原贮存降低，进食后葡萄糖摄取降低。
[0442]
4.2mertk敲除小鼠的葡萄糖产生、葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性、甘油三酯水平和血浆胰岛素水平的测定
[0443]
高胰岛素葡萄糖钳夹实验：选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型和同窝出生的mertk全身性敲除小鼠的雄鼠进行实验。实验前一天过夜饥饿，饥饿过夜后进行高胰岛素葡萄糖钳夹实验。实验步骤如下：1)准备实验试剂和材料：人重组胰岛素，生理盐水，麻醉剂，肝素，硅胶动脉插管，50％葡萄糖(溶于生理盐水)；2)手术过程如下：将小鼠麻醉后，四肢用胶布固定，牙用线绷紧充分暴露颈部。分离出颈静脉，将用肝素溶液预先处理的硅胶管
植入静脉中。将导管从小鼠后颈处穿出并封口，随后缝合好伤口。手术后恢复4-5天。3)实验前一天将小鼠饥饿过夜，饥饿过夜后根据小鼠的体重，先按照600μg/kg的剂量持续输注[u-13c6]葡萄糖90min。在第80min和90min收集50μl血液。随后分别按照600μg/kg和6mu/kg的剂量配制[u-13c6]葡萄糖和胰岛素的混合溶液对小鼠进行灌注，并同时灌注50％的葡萄糖，在这一过程中保持[u-13c6]葡萄糖和胰岛素的灌注速率不变，根据小鼠的血糖及时调整葡萄糖注射速率(gir)，使血糖水平维持在100
±
5mg/dl。当血糖稳定30min后，收取30min和40min时的血液，并记录此时的葡萄糖注射速率。4)将上述四个时间点的血液样本离心，吸取15μl的血浆并加入60μl预冷的甲醇充分混匀，并于-80℃冰箱静置2个小时以上。随后，吸取上清并送清华大学代谢组学平台对其中的葡萄糖和[u-13c6]葡萄糖进行量化鉴定。5)根据葡萄糖注射速率gir结合鉴定结果计算得到肝脏葡萄糖生成(hgp)、葡萄糖处置速率(gdr)、胰岛素刺激下的葡萄糖处置能力(is-gdr)。实验结果如图17a-17d所示。
[0444]
丙酮酸耐受试验：选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型和同窝出生的mertk全身性敲除小鼠的雄鼠进行实验。将野生型小鼠和基因敲除小鼠进行16小时的过夜饥饿处理，饥饿过程中撤去饲养垫料并更换为纸卷垫料。丙酮酸钠的腹腔注射量为1g/kg，根据实验中小鼠的体重和数量，用pbs溶液配制合适数量的质量分数为20％的丙酮酸钠溶液，并用0.22μm滤器过滤除菌。通过尾尖采血的方式，用血糖仪测定小鼠饥饿16小时后的血糖值，记为0点的血糖值。而后，给小鼠腹腔注射丙酮酸钠溶液，采用同样的采血方式，分别测定注射后15、30、60、90、120分钟时的血糖值。实验结果如图17e所示。
[0445]
糖耐量实验：选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型和同窝出生的mertk全身性敲除小鼠的雄鼠进行实验。将野生型小鼠和基因敲除小鼠进行16小时的过夜饥饿处理，饥饿过程中撤去饲养垫料并更换为纸卷垫料。葡萄糖的腹腔注射量为1g/kg，根据实验中小鼠的体重和数量，用pbs溶液配制合适数量的质量分数为20％的葡萄糖溶液，并用0.22μm滤器过滤除菌。通过尾尖采血的方式，用血糖仪测定小鼠饥饿16小时后的血糖值，记为0点的血糖值。而后，给小鼠腹腔注射葡萄糖溶液，采用同样的采血方式，分别测定注射后15、30、60、90、120分钟时的血糖值。实验结果如图17f所示。
[0446]
胰岛素耐量实验：选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型和同窝出生的mertk全身性敲除小鼠的雄鼠进行实验。实验当天将野生型小鼠和基因敲除小鼠进行6小时的饥饿处理，饥饿过程中撤去饲养垫料并更换为纸卷垫料。胰岛素的腹腔注射量为0.75u/kg，根据实验中小鼠的体重和数量，用pbs溶液配制合适数量的胰岛素溶液。通过尾尖采血的方式，用血糖仪测定小鼠饥饿6小时后的血糖值，记为0点的血糖值。而后，给小鼠腹腔注射胰岛素溶液，采用同样的采血方式，分别测定注射后15、30、60、90、120分钟时的血糖值。实验结果如图17g所示。
[0447]
血浆甘油三酯(tg)和胰岛素水平测定：选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型和同窝出生的mertk全身性敲除小鼠的雄鼠进行实验。收取自由进食饮水状态下小鼠的血液。取血方式为眼球取血，用肝素锂处理后的抗凝管收集血液，4℃15000rpm离心10分钟得到血浆。分别用sigma公司的甘油三酯测定试剂盒(货号：66500)和mercodia公司的胰岛素测定试剂盒(货号：10124701)按照说明书中的实验方法对血浆中甘油三酯和胰岛素的含量进行测定。实验结果如图17h-17i所示。
[0448]
肝脏甘油三酯(tg)水平测定：选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型和同窝
出生的mertk全身性敲除小鼠的雄鼠进行实验。收取自由进食饮水状态下小鼠的肝脏组织。称取25mg左右的肝脏组织于离心管中，加入250μl的5％np40溶液，每个离心管中加入2个小钢珠，置于组织研磨仪中，研磨频率为60hz，研磨时间为2分钟。研磨完毕后先100℃金属浴加热5min，再取出冷却至室温，重复一次。15000rpm室温离心5分钟，上清即为提取出来的甘油三酯。稀释5倍后用sigma公司的甘油三酯测定试剂盒(货号：66500)按照说明书中的实验方法对其中甘油三酯的含量进行测定。将样品中的甘油三酯含量除以样品质量，即可得到单位质量肝脏组织中甘油三酯的含量。实验结果如图17j所示。
[0449]
图17a-17d的结果表明，与野生型小鼠相比，mertk全身性敲除小鼠的肝脏葡萄糖生成(hgp)增加，葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性降低。图17e的结果表明，与野生型小鼠相比，mertk全身性敲除小鼠的糖异生能力增强。图17f的结果表明，与野生型小鼠相比，mertk全身性敲除小鼠的葡萄糖耐受能力下降。图17g的结果表明，与野生型小鼠相比，mertk全身性敲除小鼠的胰岛素敏感性降低。图17h-17i的结果显示，与野生型小鼠相比，mertk全身性敲除小鼠血浆中甘油三酯和胰岛素水平升高，表明mertk全身性敲除小鼠的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性降低。图17j的结果显示，与野生型小鼠相比，mertk全身性敲除小鼠肝脏中甘油三酯水平增高。这些结果表明，mertk敲除导致葡萄糖产生增加，葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性降低、甘油三酯的积累和血浆胰岛素水平的上调。
[0450]
实施例4的上述结果表明，mertk基因敲除小鼠与feimin mko小鼠具有类似的表型，mertk对于调节葡萄糖稳态至关重要。
[0451]
实施例5：feimin对葡萄糖稳态的调节依赖于受体mertk
[0452]
5.1葡萄糖输出测定
[0453]
从遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型wt雄性小鼠以及mertk-ko小鼠，分离得到状态良好的原代肝细胞后，将其铺到6孔板中培养，37度恒温细胞培养箱中培养。培养12h后，在mertk-ko的原代肝细胞中加入编码野生型mertk的腺病毒(mertk-/-‑
wt组)，以6孔板一个孔为例，病毒载量为5*10^10，而在wt原代肝细胞中加入等量的不含目的基因的对照腺病毒(mertk-/-‑
vec组)，继续培养48h后，进行如下操作：1)弃去培养基，并用预热过的pbs将细胞洗2遍，除去培养基中残留的葡萄糖；2)换用预热过的无糖的rpmi 1640处理细胞，每个孔加入1ml，此时加入糖异生的底物10mm的乳酸钠和1mm的丙酮酸，并加入终浓度为100nmd的feimin，处理6个小时；3)收集上述培养基，离心机4℃预冷15000rpm离心5分钟除去细胞碎片；4)用ample red glucose/glucose oxidase assay kit试剂盒，测定各组培养基上清中的葡萄糖浓度；5)6孔板中剩余的细胞，每个孔用500μl的盐酸将细胞收集，超声功率40％，破碎12秒，15000rpm离心10分钟，用bca蛋白定量试剂盒测定各个孔中的蛋白浓度，换算得到单位质量蛋白质中的葡萄糖含量。以mertk未敲除的野生型小鼠原代肝细胞作为对照。每组设置重复组5组。实验结果如图18所示。
[0454]
由图18可知，feimin可降低wt小鼠原代肝细胞的机体葡萄糖生成，而在mertk敲除的细胞中，feimin的这种作用被消除，添加野生型mertk后feimin的作用恢复。
[0455]
5.2葡萄糖摄取测定
[0456]
从遗传背景为c57bl/6j的3-4周龄野生型wt雄性小鼠以及mertk-ko小鼠分离得到成肌细胞和脂肪前体细胞，并分别诱导分化为肌管细胞和成熟脂肪细胞。在诱导分化前，在mertk-ko组加入编码野生型mertk的腺病毒(mertk-/-‑
wt组)，以6孔板一个孔为例，对于肌
管细胞，病毒载量为4*10^12，对于成熟脂肪细胞，病毒载量为1*10^13；而在wt组中加入等量的不含目的基因的对照腺病毒(mertk-/-‑
vec组)。分别得到诱导成熟的原代肌管细胞和诱导成熟的原代脂肪细胞后，进行如下操作来检测葡萄糖的摄取量：1)实验当天上午弃去诱导培养基，将细胞用pbs缓冲液洗一遍，换用无糖无血清的dmem培养基，饥饿处理3个小时；2)实验组加入从大肠杆菌中纯化的c端带有6
×
his标签的feimin处理40分钟，对照组加入等体积的pbs缓冲液，feimin终浓度为100nm；3)加入终浓度为500μm的2-nbdg处理10min，弃去培养基，将细胞用pbs缓冲液洗二遍，加入细胞裂解液(50mm hepes ph7.4，150mm nacl，1％tritonx-100)，使细胞充分裂解；4)裂解液用4℃预冷的离心机15000rpm离心15分钟，上清即为提取得到的含有2-nbdg的裂解液；5)将2-nbdg储液稀释到组织裂解液中，配制标准曲线。将提取得到的上清和标准曲线加入黑色的96孔板中，选择合适的激发波长读取荧光值，代入标准曲线计算得到细胞中2-nbdg的含量。以mertk未敲除的野生型小鼠肌管细胞和成熟脂肪细胞作为对照。每组设置重复组5组。实验结果如图19a-19b所示。
[0457]
由图19a可知，feimin可增强wt小鼠肌管细胞中的葡萄糖摄取，而在mertk缺乏的细胞中，feimin的这种作用被消除，添加野生型mertk后feimin的作用恢复。由图19b可知，feimin可增强wt小鼠成熟脂肪细胞中的葡萄糖摄取，而在mertk缺乏的细胞中，feimin的这种作用被消除，添加野生型mertk后feimin的作用恢复。
[0458]
5.3feimin通过mertk激活下游akt信号通路
[0459]
feimin对akt的剂量依赖性激活
[0460]
选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型wt雄性小鼠，随机分成4组，每组6只。将小鼠饥饿过夜后，腹腔注射feimin-his蛋白0.2、1、5mg/kg(注射量根据小鼠体重进行调整，单位为mg/kg)，对照组为注射相同体积的pbs。腹腔注射45min后，分别对小鼠眼眶取血，收集血清，进行elisa实验。处死后分别收取小鼠的肝脏、肌肉和白色脂肪组织，进行免疫印迹实验。结果分别如图20a和图20b所示。
[0461]
图20a的结果显示，对小鼠进行外源腹腔注射feimin后，其血清中的feimin含量具有剂量依赖性。对不同组织进行免疫印迹的实现结果表明，在1mg/kg的剂量下，feimin对akt的激活作用最大(图20b)。
[0462]
feimin的血清半衰期
[0463]
为了检测feimin的血清半衰期，选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型wt雄性小鼠，随机分成5组，每组6只。将小鼠饥饿过夜后，腹腔注射1mg/kg feimin-his蛋白(注射量根据小鼠体重进行调整，单位为mg/kg)，腹腔注射后，分别在30、60、90、120min后对小鼠眼眶取血，收集血清，进行elisa实验。结果如图20c所示。从图20c可以得出，feimin的血清半衰期为约37min。
[0464]
feimin对akt的激活与胰岛素对akt的激活的比较
[0465]
选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型wt雄性小鼠，随机分成14组，每组6只。将小鼠饥饿过夜后，对2-7组小鼠腹腔注射1mg/kg feimin-his蛋白，对9-14组小鼠注射0.3u/kg胰岛素，其中第1组为注射feimin组的对照组，第8组为注射胰岛素组的对照组。腹腔注射后，分别将这些组的小鼠于15、30、45、60、90、120min后处死，并取样(肝脏、肌肉和白色脂肪组织)，进行免疫印迹实验。结果如图21所示。
[0466]
图21的结果显示，feimin能够激活akt，且比胰岛素激活akt的时间更缓慢，但持续
时间更长。
[0467]
feimin对akt的激活依赖于mertk
[0468]
选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄野生型wt雄性小鼠和mertk-ko小鼠，将mertk-ko小鼠在6周的时候分成2组，每组16只，一组尾静脉注射空aav9载体病毒(mertk-/-‑
vec组)，另一组尾静脉注射表达野生型mertk的aav9病毒(mertk-/-‑
wt组)。每只小鼠注射aav9的病毒量总计为1
×
10^12，通过尾静脉注射4
×
10^11，每只后腿的腓肠肌和胫骨前肌各定点注射3
×
10^11。待小鼠10周后，分别将wt小鼠(16只)和mertk-ko小鼠(mertk-/-‑
vec组小鼠共16只，mertk-/-‑
wt组小鼠共16只)分成两个实验组，每组8只，一组腹腔注射1mg/kg feimin蛋白，另外一组腹腔注射等体积的pbs缓冲液。注射后1h，分别测量小鼠的尾静脉血糖水平。结果如图22a所示。
[0469]
为了检测feimin激活小鼠组织akt的水平，待病毒在小鼠中表达4周后，将小鼠饥饿过夜，分别将wt小鼠(16只)和mertk-ko小鼠(mertk-/-‑
vec组小鼠共16只，mertk-/-‑
wt组小鼠共16只)分成两个实验组，每组8只，一组腹腔注射1mg/kg feimin蛋白，另外一组腹腔注射等体积的pbs缓冲液。注射后45min后，处死小鼠，分别取小鼠的脂肪、肌肉和肝脏组织，进行免疫印迹，观察akt的激活水平。结果如图22b所示。
[0470]
由图22a-22b的结果可知，feimin激活wt小鼠中的akt并降低血糖水平，但在mertk敲除小鼠中，feimin的这种作用被消除,添加野生型mertk后feimin的作用恢复。
[0471]
这些结果表明，feimin通过mertk激活akt，从而调节葡萄糖稳态。
[0472]
实施例6：腹腔注射feimin降低血糖水平
[0473]
本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄正常小鼠，将小鼠随机分成4组，每组6只小鼠。一组小鼠单次腹腔注射feimin蛋白(1mg/kg),一组小鼠连续腹腔注射5天feimin蛋白(1mg/kg/d，连续5次)。作为对照组，一组小鼠单次腹腔注射等体积的pbs缓冲液，一组小鼠连续腹腔注射5天等体积的pbs缓冲液。每次腹腔注射完相应的蛋白或缓冲液后1h，检测小鼠尾静脉血糖水平，进行统计分析。结果如图23所示。
[0474]
从图23的结果可知，单次腹腔注射(1mg/kg)和多次腹腔注射(1mg/kg/d，连续5次)feimin均能降低血糖水平。
[0475]
实施例7：feimin能够改善糖尿病小鼠的血糖稳态
[0476]
7.1小鼠模型和人中血糖、feimin和胰岛素水平的测定
[0477]
本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄正常小鼠、遗传肥胖(ob/ob)小鼠、高脂食物饲养的20周龄的饮食诱导肥胖(dio)小鼠和遗传背景为bks的8-10周龄糖尿病小鼠(db/db)小鼠。分别随机将不同品系的小鼠分成两组，每组6只小鼠，一组禁食过夜，一组禁食过夜候喂食1h，分别将两组小鼠取尾静脉测量血糖水平，并在取眼眶血后处死。针对收集的血浆分别检测feimin的水平和胰岛素的水平，结果如图24a-24c所示。
[0478]
同时，还检测了健康人(14人)和糖尿病人(17人)餐前和餐后1h的血糖水平，并取静脉血检测了其c肽(c肽可反应临床样品自身产生胰岛素的能力，内源产生的胰岛素和c肽以1：1比例存在，因此可以反映临床样品自身产生胰岛素的能力)水平、空腹糖化血红蛋白(hba1c)水平和feimin水平。结果如图25a-25d所示。
[0479]
结果显示，与正常小鼠相比，在饮食诱导肥胖(dio)、遗传肥胖(ob/ob)和糖尿病小鼠(db/db)中，在禁食和进食状态下的血糖水平明显增加(图24a)，血浆feimin水平仅略有
增加(图24b)；相比之下，血浆胰岛素水平增加更加明显(图24c)。与健康人相比，糖尿病人在禁食和进食状态下的血糖水平明显升高(图25a)、feimin水平也明显升高(图25d)，而在进食状态下c肽的水平明显降低(图25b)。对健康人和糖尿病人的空腹糖化血红蛋白水平进行检测的结果显示，糖尿病人在禁食状态下的糖化血红蛋白水平明显高于健康人(图25c)。
[0480]
7.2feimin及feimin与胰岛素的联合对akt的激活作用
[0481]
本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄正常小鼠、遗传肥胖(ob/ob)小鼠、高脂食物饲养的20周龄的饮食诱导肥胖(dio)小鼠和遗传背景为bks的8-10周龄糖尿病小鼠(db/db)小鼠。将这些小鼠进行16小时的过夜饥饿处理，饥饿过程中撤去饲养垫料并更换为纸卷垫料。饥饿过夜后实验组腹腔注射feimin、胰岛素、或feimin+胰岛素，feimin的注射剂量为1mg/kg，胰岛素的注射剂量为0.3u/kg。对照组注射等量的pbs缓冲液。作用时间设置0、15、30、45、60、90、120分钟，共计7个时间点。分别收取这些小鼠的肝脏组织、肌肉组织和白色脂肪组织，迅速置于液氮保存。称取40mg肝脏组织加入400μl裂解液(50mm hepes ph7.4，150mm nacl，1％tritonx-100)，40mg肌肉组织加入350μl裂解液，200mg白色脂肪组织加入250μl裂解液，提取其中的蛋白质，并检测akt的激活情况。使用cst公司akt第308位的苏氨酸磷酸化抗体(货号：2965s)进行免疫印迹实验。实验结果如图26所示。
[0482]
图26的结果显示，与肥胖/糖尿病小鼠相比，在正常小鼠中，胰岛素诱导akt的激活更加明显，这是因为肥胖/糖尿病小鼠胰岛素抵抗增强；相比之下，feimin在正常小鼠和肥胖/糖尿病小鼠中，诱导akt激活的水平相似；这些结果进一步表明，feimin的作用在肥胖/糖尿病小鼠中没有明显的耐药性。另外，胰岛素和feimin的联合施用对akt的激活更加显著。这些结果表明，feimin和胰岛素能够协同激活akt，从而调节葡萄糖稳态。
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7.3feimin及feimin与胰岛素的联合对血糖的降低作用
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本实施例选用遗传背景为c57bl/6j的8-10周龄正常小鼠、遗传肥胖(ob/ob)小鼠、高脂食物饲养的20周龄的饮食诱导肥胖(dio)小鼠和遗传背景为bks的8-10周龄糖尿病小鼠(db/db)小鼠。将这些小鼠进行16小时的过夜饥饿处理，饥饿过程中撤去饲养垫料并更换为纸卷垫料。饥饿过夜后实验组腹腔注射feimin、胰岛素、或feimin+胰岛素，feimin的注射剂量为1mg/kg，胰岛素的注射剂量为0.3u/kg。对照组注射等量的pbs缓冲液。作用时间设置0、15、30、60、90、120分钟，共计6个时间点。通过尾尖采血的方式，用血糖仪测定对应时间点小鼠的血糖水平。结果如图27所示。
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图27的结果显示，与肥胖/糖尿病小鼠相比，在正常小鼠中，胰岛素诱导的血糖水平的降低更加明显，这是因为肥胖/糖尿病小鼠胰岛素抵抗增强；相比之下，feimin在正常小鼠和肥胖/糖尿病小鼠中，诱导血糖水平的降低的水平相似；这些结果进一步表明，feimin的作用在肥胖/糖尿病小鼠中没有明显的耐药性，能够作为有效的将血糖药物，特别是对具有胰岛素抵抗的患者而言。另外，胰岛素和feimin的联合施用对血糖水平的降低更加显著。这些结果表明，feimin和胰岛素能够协同降低血糖水平，改善葡萄糖稳态，提示了feimin与胰岛素联合应用是控制血糖的有效方法。
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本技术参考了各种发行的专利、公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，将所有这些引入本技术作为参考。若任何引入的参考文献和本说明书有冲突，则以本说明书为准。此外，落入现有技术范围的本发明的任何具体实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。因为所述实施方案被认为是本领域技术人员已知的，它们可以被排除，即使所
述排除没有在本技术中明确列出。本发明的任何具体实施方案可从任何权利要求中以任何理由排除，不管是否与现有技术的存在有关。
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虽然已经参考其特定实施方案描述本发明，本领域的技术人员应当理解可以进行各种改变且可以替换等同物而不脱离本发明的真正的精神和范围。另外，可作出许多修改以使特定的情况，材料，组合物，方法，方法步骤适于本发明的目的，精神和范围。所有这些修改都旨在权利要求的范围内。