一种用于抗胞内细菌感染和/或抑制肿瘤细胞的复合物及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学，具体地，涉及一种用于抗胞内细菌感染和/或抑制肿瘤细胞的复合物及其应用。

背景技术：

1、细菌耐药性已成为目前感染治疗的一大难点，细菌能够通过多种途径获得药物抗性，细菌的耐药性来自于菌膜的保护、基因的突变、耐药基因/质粒的转移、药物的代谢/外排以及细菌在宿主细胞内的寄生，由此产生了多种原因的耐药性。此外，过度以及不当的抗生素药物服用正加速这一趋势的不断恶化。细菌耐药性不断增加，新型药物研发的速度却在减慢，由此造成的细菌耐药性已成为人类健康以及生命重要威胁。

2、细菌的基因突变是导致耐药性发生的重要原因之一，针对单一靶点发挥作用的药物很容易因为细菌基因突变导致药物失效。因此能够覆盖更广泛的作用位点，同时又要兼顾避免药物的副作用，对新药开发提出了巨大的挑战。

3、细菌的胞内感染也是耐药性产生的重要因素。细菌侵入宿主细胞，并逐步进化出抑制宿主细胞杀伤的机制，同时还能够利用宿主细胞逃避宿主免疫系统以及减弱药物治疗效果，是一种重要的细菌自我保护以及耐药产生的机制。胞内菌感染治疗极其困难，水溶性药物如β内酰胺类和氨基糖苷类药物，很难穿过疏水结构的脂质双层膜进入细胞对胞内菌进行杀伤。疏水性药物如氟喹诺酮类和大环内酯类，即使能够进入细胞，也会被细胞外排泵快速排出，无法在细胞内累积达到有效治疗浓度。宿主细胞内的微量抗菌药物无法起到有效治疗的作用，反而加剧了胞内菌耐药性的产生，胞内菌感染是引起二次感染、引发慢性炎症的一个重要原因。

4、目前针对胞内菌的治疗研究主要是利用药物载体，将药物递送入细胞内部，使药物能够直接接触到胞内病原菌。当细菌进入体内后，会被所遇到的各种免疫细胞所吞噬，包括中性粒细胞，巨噬细胞，dc细胞和淋巴细胞等，因此目前胞内菌的治疗研究多集中于免疫细胞内的胞内菌感染治疗。当前研究的载体，包括脂质体、有机纳米颗粒、金属纳米颗粒等，都非常容易被免疫细胞吞噬，因此可以有效的将药物送入免疫细胞内部。然而除了吞噬细胞，细菌也会入侵其他非吞噬细胞，如：成纤维细胞，肝细胞，肠细胞和上皮细胞。这类细胞的内吞能力远低于免疫细胞，因此如何有效的将药物送入非吞噬细胞中，能够同时对吞噬细胞及非吞噬细胞中的病原菌进行有效治疗，也是目前所面临的一大困难。

5、鼠伤寒沙门氏菌是一种通过食物传播的病原菌，是引发急性肠胃炎，导致败血症的主要病原菌之一。鼠伤寒沙门氏菌具有侵入宿主细胞，形成胞内寄生的特点，为治疗带来了很大难度。鼠伤寒沙门氏菌既能侵入具有吞噬功能的免疫细胞，如巨噬细胞、单核细胞、dc细胞和中性粒细胞等，也能侵入内吞功能较弱的肠细胞。鼠伤寒沙门氏菌侵入肠细胞的过程则是细菌与肠细胞相互作用的过程，包括spi1 type iii secretion systems，以及o抗原的作用。同样的，针对鼠伤寒沙门氏菌的胞内感染治疗也是主要集中于针对吞噬细胞的研究进行，对于非吞噬细胞内的病菌感染没有好的解决方案。

6、转座酶能够将转座子从相邻序列中脱离出来，插入到新的dna靶位点从而改变基因的功能，转座酶存在于原核及真核生物之中，为生物进化提供了动力。转座酶可以针对整个基因组发挥作用，通过插入含有终止密码子的不连续片段，可以将基因组打断，同时引入终止密码子，以彻底阻止基因的转录翻译。可以有效避免针对单一靶点药物因基因突变导致的耐药产生的问题。同时，选择来自于原核生物不含有入核信号的转座酶可以特异的针对病原菌进行治疗，以减少对真核细胞的损伤。

7、细菌外膜囊泡是由革兰氏阴性细菌释放的由细菌外层膜形成的囊泡，直径范围为50-250nm，外膜囊泡能够能够通过膜融合的方式在细菌之间进行物质与信号的传递。因此外膜囊泡是一个理想的抗菌药物递送载体。转座酶的递送则采用来源于鼠伤寒沙门氏菌的外膜囊泡，因其与母细胞有着极为接近的外膜分子构型，在体内将具有更接近鼠伤寒沙门氏菌的分布，能够针对吞噬细胞以及非吞噬细胞进行药物递送。

8、鼠伤寒沙门氏菌进入细胞后，存在于被膜包裹的独立空间，即salmonella-containing vacoule(scv)，当载体进入细胞内含体后，载体可以通过内含体与scv融合的形式，将药物递送至细菌。其中的酸性环境能够激活穿膜肽phlip。外膜囊泡与细菌外膜融合，释放出携带的转座酶，激活的phlip穿过细菌内膜，将转座酶送入细菌内部发挥作用。胞外细菌在低氧条件下，产生的代谢产物包括乳酸、乙酸等，以及由细菌感染引发的免疫反应会导致感染位置的酸性环境，同样致使穿膜肽phlip的激活，携带转座酶进入细菌胞质。此外，来源于鼠伤寒沙门氏菌的外膜囊泡能够激活机体的免疫功能，从而在免疫和药物的双重作用下发挥更好的治疗效果。

9、肿瘤治疗同样面临药物耐受问题，肿瘤细胞耐药性产生的途径主要有：(1)药物外排作用；(2)药物靶点突变导致药物失效；(3)损伤修复等机制修复药物造成的损伤。由于上述途径导致药物无法较好地实现对肿瘤细胞的杀伤能力，抑制肿瘤细胞生长。

10、顺铂类药物同样是基于对dna造成损伤的肿瘤治疗药物，通过与核苷酸的结合，在特异的核酸之间，如gpg、apg、gpnpg产生链内交联，同时也可在两条链之间产生交联，以及蛋白和dna之间产生交联，从而造成染色体结构的改变，影响dna的转录和翻译。此外，顺铂也会导致dna链断裂，顺铂作为非小细胞癌治疗的常规药物，但在治疗过程中极易产生耐药性，影响治疗效果。

11、因此，如何降低肿瘤耐药性或者抑制肿瘤细胞耐药性的产生已经成为了癌症治疗过程中必须克服的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于抗胞内细菌感染和/或抑制肿瘤细胞的复合物及其应用。

2、本发明的第一目的是提供一种用于抗胞内细菌感染和/或抑制肿瘤细胞的复合物。

3、本发明的第二目的是提供一种用于抗胞内细菌感染和/或抑制肿瘤细胞的复合物的制备方法。

4、本发明的第三目的是提供上述复合物在制备用于抗胞内细菌感染和/或抑制肿瘤细胞的药物中的应用。

5、本发明的第四目的是提供一种用于抗胞内细菌感染和/或抑制肿瘤细胞的药物。

6、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

7、一种用于抗胞内细菌感染和/或抑制肿瘤细胞的复合物，所述复合物由以下组分组成：

8、第一组分为肽段；

9、第二组分为结合序列；

10、第三组分为细菌外膜囊泡；

11、其中，第一组分所述肽段从n端到c端依次为细菌周质定位信号肽和tn5转座酶；所述第一组分肽段的细菌周质定位信号肽和tn5连接酶之间还连接有或未连接有ph(low)insertion peptide；所述第一组分肽段的c端还连接有或未连接有入核信号肽；

12、所述细菌周质定位信号肽的氨基酸序列如seq id no：11或seq id no：12所示；

13、所述tn5转座酶的氨基酸序列如seq id no：22所示；

14、所述ph(low)insertion peptide的氨基酸序列如seq id no：28、seq id no：29或seq id no：30任一所示；

15、所述入核信号肽的氨基酸序列如seq id no：18所示；

16、其中，第二组分结合序列为复性结合序列1和复性结合序列2；所述复性结合序列1为tn5结合序列1和tn5结合序列2复性结合得到，所述复性结合序列2为tn5结合序列1和tn5结合序列3复性结合得到；

17、所述tn5结合序列1的核苷酸序列如seq id no：13所示；所述tn5结合序列2的核苷酸序列如seq id no：14所示；所述tn5结合序列3的核苷酸序列如seq id no：15所示。

18、所述复合物用于制备抑制肿瘤细胞的药物，复合物第一组分肽段的细菌周质定位信号肽和tn5连接酶之间未连接有ph(low)insertion peptide；第一组分肽段的c端连接有入核信号肽；所述入核信号肽的氨基酸序列如seq id no：18所示。

19、所述复合物用于制备抗胞内细菌感染的药物，复合物第一组分肽段的细菌周质定位信号肽和tn5连接酶之间连接有ph(low)insertion peptide；第一组分肽段的c端未连接有入核信号肽；所述ph(low)insertion peptide的氨基酸序列如seq id no：28、seq idno：29或seq id no：30任一所示。

20、具体的，所述核苷酸序列和氨基酸序列的具体信息如下：

21、(seq id no：11)：mkktaiaiavalagfatvaqa；

22、(seq id no：12)：mkkwrlllpllfalifllphsama；

23、tn5结合序列1(seq id no：13)：5’-phos-ctgtctcttatacacatct-3’；

24、tn5结合序列2(seq id no：14)：

25、5’-ttacttagttaagatgtgtataagagacag-3’；

26、tn5结合序列3(seq id no：15)：

27、5’-tcactcagtcaagatgtgtataagagacag-3’；

28、入核信号肽(seq id no：18)：pakkrrvrkld；

29、其中tn5结合序列1中phos为磷酸基团；tn5结合序列2和tn5结合序列3下划线部分为终止密码子(终止密码子为多个终止密码子)，其余部分与tn5结合序列1互补。

30、优选地，所述第一组分装载于所述第三组分中形成装载物，将所述第二组分添加至装载物中得到所述复合物。

31、优选地，所述细菌周质定位信号肽的氨基酸序列如seq id no：11所示。

32、优选地，所述ph(low)insertion peptide的氨基酸序列如seq id no：29所示。

33、优选地，所述细菌外膜囊泡来源的细菌与胞内感染的细菌为同种细菌。

34、优选地，所述肿瘤细胞为耐药性的肿瘤细胞。

35、一种用于胞内细菌感染和/或抑制肿瘤细胞的复合物的制备方法，包括以下步骤：

36、s1.将含有编码权利要求1中所述第一组分肽段的核苷酸序列的重组表达载体转入细菌中，诱导表达，得到表达权利要求1中所述第一组分肽段的细菌，利用表达权利要求1中所述第一组分肽段的细菌分离细菌外膜囊泡，得到含有权利要求1中所述第一组分肽段的细菌外膜囊泡；

37、s2.将权利要求1中所述tn5结合序列1和tn5结合序列2复性结合得到复性结合序列1，将权利要求1中所述tn5结合序列1和tn5结合序列3复性结合得到复性结合序列2；

38、s3.将复性结合序列1和复性结合序列2加入至步骤s1得到的含有肽段的细菌外膜囊泡中，充分孵育，固液分离，纯化沉淀，即得。

39、优选地，步骤s1即为上述第一组分装载于上述第三组分中形成装载物；步骤s2和步骤s3即为将上述第二组分添加至装载物中得到所述复合物。

40、优选地，步骤s1中所述编码权利要求1中所述第一组分肽段的核苷酸序列如seqidno：2、seq id no：3或seq id no：20所示。

41、更优选地，所述编码权利要求1中所述第一组分肽段的核苷酸序列如seq id no：2或seq id no：3所示，复合物用于抗胞内细菌感染；所述编码权利要求1中所述第一组分肽段的核苷酸序列如seq id no：20所示，复合物用于抑制肿瘤细胞。

42、优选地，所述细菌外膜囊泡来源的细菌与胞内细菌感染的细菌为同种细菌。

43、本发明还请求保护上述任一复合物在制备用于抗胞内细菌感染和/或抑制肿瘤细胞的药物中的应用。

44、优选地，所述肿瘤细胞为耐药性的肿瘤细胞。

45、优选地，所述复合物第一组分肽段的细菌周质定位信号肽和tn5连接酶之间未连接有ph(low)insertion peptide，第一组分肽段的c端连接有入核信号肽，复合物用于制备抑制肿瘤细胞的药物；所述入核信号肽的氨基酸序列如seq id no：18所示。

46、优选地，所述复合物第一组分肽段的细菌周质定位信号肽和tn5连接酶之间连接有ph(low)insertion peptide，第一组分肽段的c端未连接有入核信号肽，复合物用于制备抗胞内细菌感染的药物；所述ph(low)insertion peptide的氨基酸序列如seq id no：28、seq id no：29或seq id no：30任一所示。

47、本发明还请求保护一种用于抗胞内细菌感染和/或抑制肿瘤细胞的药物，所述药物包含上述复合物。

48、优选地，所述复合物第一组分肽段的细菌周质定位信号肽和tn5连接酶之间未连接有ph(low)insertion peptide，第一组分肽段的c端连接有入核信号肽，药物用于抑制肿瘤细胞；所述入核信号肽的氨基酸序列如seq id no：18所示。

49、优选地，所述复合物第一组分肽段的细菌周质定位信号肽和tn5连接酶之间连接有ph(low)insertion peptide，第一组分肽段的c端未连接有入核信号肽，药物用于抗胞内细菌感染；所述ph(low)insertion peptide的氨基酸序列如seq id no：28、seq id no：29或seq id no：30任一所示。

50、优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。

51、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

52、本发明公开了一种用于抗胞内细菌感染和/或抑制肿瘤细胞的复合物，所述复合物由以下组分组成：第一组分为肽段；第二组分为结合序列；第三组分为细菌外膜囊泡；其中，第一组分所述肽段从n端到c端依次为细菌周质定位信号肽和tn5转座酶；所述第一组分肽段的细菌周质定位信号肽和tn5连接酶之间还连接有或未连接有ph(low)insertionpeptide；所述第一组分肽段的c端还连接有或未连接有入核信号肽；所述细菌周质定位信号肽的氨基酸序列如seq id no：11或seq id no：12所示；所述入核信号肽的氨基酸序列如seq id no：18所示；所述ph(low)insertion peptide的氨基酸序列如seq id no：28、seqid no：29或seq id no：30任一所示；其中，第二组分结合序列为复性结合序列1和复性结合序列2；所述复性结合序列1为tn5结合序列1和tn5结合序列2复性结合得到，所述复性结合序列2为tn5结合序列1和tn5结合序列3复性结合得到；所述tn5结合序列1的核苷酸序列如seq id no：13所示；所述tn5结合序列2的核苷酸序列如seq id no：14所示；所述tn5结合序列3的核苷酸序列如seq id no：15所示。

53、tn5转座酶针对整个基因组发挥作用，能够解决由基因突变/抗性质粒转移造成的单靶点药物耐药问题，并且在tn5结合序列中引入了终止密码子，能够同时向正义链及反义链中引入终止密码子，以使即便在插入打断被连接修复的情况下，插入位点能够向基因编码区引入终止密码子，能够终止蛋白翻译，同样造成细胞毒性。而且引入的多个终止密码子能够保证蛋白翻译时，不同的移码翻译均能够有效识别终止密码子。

54、同时采用来源于病原菌(鼠伤寒沙门氏菌)制备的外膜囊泡载体，具有与病原菌接近的外膜分子结构，在体内分布更接近病原菌，能够向吞噬细胞及非吞噬细胞进行药物递送，解决目前载体进入非吞噬细胞效率低的问题，能够发挥更好的治疗效果。

55、转座酶针对整个基因组发挥作用，从而能够克服由于基因突变产生的耐药性问题，并且转座酶为大分子的蛋白，无法被药物外排泵排出细胞，同时转座酶tn5具有高效的序列插入活性，在基因组被高频率的插入打断时，细胞无法对双链dna的断裂进行修复，也就无法通过损伤修复产生耐药性。