一种含负电荷脂质的核酸递运系统

本发明涉及核酸药物递送系统领域，具体地，涉及脂质体载体递送mrna，更具体的，涉及一种在细胞水平上递送mrna的由阳离子脂质体和负电荷磷脂组成的脂质体纳米递送系统，其正负电荷摩尔比、脂质体浓度、辅助材料、摄取时间、转染时间、制备方式、净电荷对转染效果的影响，以及负电荷磷脂对递送系统安全性的提高。

背景技术：

1、核酸类药物是目前发展最为迅速和前沿的领域之一，在治疗肿瘤、遗传性疾病、代谢疾病、预防性传染病等方面不断取得突破性进展。mrna药物作为核酸药物的一种，具有亲水性强、生物活性高、不进入细胞核即可表达出相应的目的蛋白发挥作用、过程简单、高效安全的特点，理论上能够表达所有的蛋白，可治疗多种疾病。

2、但mrna药物起效目前面临多种挑战和难题。首先，mrna是一种带有负电荷的单链大分子，这样的结构使它极其脆弱，容易被体内外的rna酶降解。其次，mrna和细胞膜都带有负电荷，静电排斥作用使mrna难以穿透细胞膜进入细胞内起效，而mrna编码信息中包含了核糖体生成的序列，必须递送至细胞内才能编码蛋白。因此mrna药物也面临着巨大挑战。

3、有效的递运系统可以解决mrna起效面临的各种难题。目前已有多种mrna递送系统，如鱼精蛋白、阳离子纳米乳液、多糖颗粒、阳离子聚合物、脂质体纳米递送系统等。其中应用最为成熟广泛的为脂质体纳米递送系统，具有保护mrna免于降解失活，易于携带mrna进入细胞，转染效率高，作为递送载体不受宿主限制等优势。然而脂质纳米递送系统受到脂质体材料、电荷、比例、制备工艺等多种条件的影响，制备工艺相关的核心关键参数也是mrna递送的关键。

4、现阶段的脂质体mrna递运系统存在以下两点问题，一是脂质体纳米递送材料比例复杂，制备工艺精确，和小分子递送系统不同的是，在mrna递运系统中，一个细微参数的变动直接会影响核酸最终表达效果的有无。

5、其次，由于mrna是带负电荷的生物大分子，不能自行通过细胞质进入靶细胞，一般需要带正电荷的脂质体通过电荷吸引将其装载来实现细胞递送，因此阳离子脂质体是mrna转染起效必不可少的关键成分，但是阳离子脂质体由于具有极性头部结构，是转染过程中造成细胞毒性的主要因素，因而对临床应用研究有一定限制。

6、磷脂酰丝氨酸(简称ps)是一种细胞膜中普遍存在的磷脂，与一系列的细胞膜功能有关，也是大脑细胞膜的重要成分之一，影响着细胞膜的流动性和通透性，并能激活多种酶类的代谢与合成。除此之外，磷脂酰丝氨酸在细胞膜上具有净负电荷，有助于膜的不对称性，因此能够中和阳离子脂质体所带的正电荷，为降低阳离子脂质体所造成的细胞毒性提供了可能。

7、因此为探究影响mrna递送的各种参数因素，以及解决上述提到的阳离子脂质体递送的安全性问题，我们要构建一个由阳离子脂质体为主要成分的mrna脂质体纳米递送系统，并引入了负电荷磷脂(ps)，在保证转染效率的基础上，通过负电荷的引入中和一部分阳离子脂质所带的正电荷，进而降低整体体系的正电荷，使整个递送体系安全性增加，降低了阳离子脂质体的细胞毒性。并且考察了脂质体材料、电荷、比例、制备工艺等各种因素对转染效果的影响。拟解决mrna药物起效面临的诸多难题，同时考察其安全性，使其既有效又安全，为多种疾病提供治疗方案。

技术实现思路

1、本发明目的之一在于提供一种核酸递运系统，其采用阳离子脂质体和负电荷磷脂为递送载体主要材料，装载增强型绿色荧光蛋白mrna(egfp mrna)后，将mrna递送到细胞并成功表达出绿色荧光蛋白。阳离子脂质体本身所带的正电荷可以和带负电荷的mrna以静电作用结合在一起，这是携带mrna进入细胞所必须的，但阳离子脂质体本身带来的细胞毒性所存在的安全性问题也需要解决。本发明的又一目的在于引入负电荷磷脂，中和阳离子脂质体所带的部分正电荷，在保证了整体系统转染效率的基础上提高递送系统的安全性。除此之外，本专利还提供了脂质体主要材料、正负电荷摩尔比、脂质体浓度、辅助材料、摄取时间、转染时间、制备方式、净电荷等各合成制备条件对转染效果的影响。

2、为实现上述目的，本发明第一方面涉及一种核酸递运系统的组成，其以球状的阳离子脂质体和负电荷磷脂为载体主要材料，所述载体内含有被递送的核糖核酸。

3、本发明第一方面的一些实施方式中，“球状”指圆球形或类似球形。本发明第一方面的一些实施方式中，其中阳离子脂质材料优选(2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷氯盐(dotma)，进一步优选为dotap；其中负电荷磷脂材料选自磷脂酰丝氨酸(ps)，进一步优选为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(pops)；其中载体中还可以包括辅助脂质材料，该辅助脂质材料选自胆固醇、dspe-peg2000中的一种或几种。

4、本发明第一方面的一些实施方式中，其中被递送的核糖核酸选自信使rna(mrna)，进一步优选为增强型绿色荧光蛋白mrna(egfp mrna)。

5、本发明第一方面的一些实施方式中，球状的载体由双分子层环绕形成，其中，内分子层为亲水性，外分子层为疏水性。

6、本发明第一方面的一些实施方式中，核酸递运系统中阳离子脂质体材料和负电荷磷脂材料的摩尔比为10:0-0:10，如10：0、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9、0：10，优选9:1-6:4，更优选为7：3。

7、本发明第一方面的一些实施方式中，核酸递运系统中脂质体材料为阳离子脂质体材料、负电荷磷脂材料和辅助脂质材料，其中阳离子脂质体材料、负电荷磷脂材料、辅助脂质材料的摩尔比为7:3:(0-21)，优选7:3:0、7:3:1、7:3:3、7:3:7、7:3:14、7:3:21，进一步优选为7：3：14。

8、本发明第一方面的一些实施方式中，核酸递运系统中总脂质与核酸质量比(g/g)为0.37-37g/g，优选0.444-35.556g/g，进一步优选0.889-26.667g/g，其中在不加入辅助脂质条件下具有最佳转染效果的总脂质与核酸质量比(g/g)为7.111g/g，其中在加入辅助脂质条件下具有最佳转染效果的总脂质与核酸质量比(g/g)为14.222g/g。

9、本发明第二方面涉及一种核酸递运系统合成的方法，包括如下步骤：

10、(1)将阳离子脂质体和负电荷磷脂材料(或加辅助脂质)按不同摩尔比混合后用一定量有机溶剂溶解，随后旋转蒸发掉有机溶剂，得到均匀的脂质体薄膜。

11、(2)将增强型绿色荧光蛋白mrna的无rna酶水溶液与薄膜以500:(12～360)ml/mg(例如500：12ml/mg、500：24ml/mg、500：48ml/mg、500：96ml/mg、500：144ml/mg、500：192ml/mg、500：240ml/mg、500：288ml/mg、500：336ml/mg、500：360ml/mg)的比例混合，得到混合物；

12、(3)将上述混合物超声得到核酸递运系统；

13、本发明第二方面的一些实施方式中，所述方法具有如下a至g中的一项或多项特征：

14、a.步骤(1)中，所述阳离子脂质材料选自dotap、dotma，进一步优选为(2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)；所述负电荷磷脂材料选自磷脂酰丝氨酸(ps)，进一步优选为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(pops)。辅助脂质选自胆固醇、dspe-peg2000。

15、b.步骤(1)中，所述有机溶剂选自氯仿、丙酮和乙醇中至少一种，优选为氯仿；

16、c.步骤(1)中，所述溶液中总脂质体材料和有机溶剂的比例为0.01～1mg/ml，例如0.1mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml；优选0.012-0.96mg/ml，进一步优选0.024-0.72mg/ml。

17、d.步骤(1)中，旋转蒸发的温度为室温；

18、e.步骤(2)中，所述混合物中总脂质体在水相中的浓度为0.024～0.72mg/ml，例如0.048mg/ml、0.096mg/ml、0.192mg/ml、0.384mg/ml、0.48mg/ml、0.672mg/ml；优选0.096-0.672mg/ml。

19、f.步骤(3)中，超声的时间为3～10分钟，例如3、4、5、6、7、8、9、10分钟；

20、g.核酸递运系统为本发明第一方面所述的核酸递运系统。

21、本发明第二方面的一些实施方式中，室温一般理解为10℃～30℃。

22、本发明第三方面涉及本发明第一方面所述核酸递运系统中阳离子脂质和负电荷磷脂在总浓度相同条件下，不同摩尔比所形成的核酸递运系统在neuro-2a细胞上转染效果的影响。以及最佳转染效果时的摩尔比。

23、本发明第三方面的实施方式中，阳离子脂质体和负电荷磷脂摩尔比范围为10:0-0:10，如10：0、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9、0：10，优选9:1-2:8，优选9:1-6:4，更优选为7：3。

24、本发明第三方面的实施方式中，脂质体总浓度均为0.48mg/ml。

25、本发明第三方面的实施方式中，转染时间为24小时。

26、本发明第四方面涉及本发明第三方面所述核酸递运系统中阳离子脂质和负电荷磷脂在最佳摩尔比时，不同脂质体总浓度下的细胞活性，以及核酸递运系统为纯阳离子脂质体或纯负电荷磷脂时，不同脂质体总浓度下的细胞活性。

27、本发明第四方面的实施方式中，阳离子脂质体为dotap，负电荷磷脂为pops，阳离子脂质体和负电荷磷脂最佳摩尔比为7：3。

28、本发明第四方面的实施方式中，阳离子脂质体和负电荷磷脂最佳摩尔比、纯阳离子脂质体、纯负电荷磷脂三种不同的递运系统在cck-8细胞活性实验中的浓度梯度范围为0.024～0.72mg/ml，优选0.096～0.672mg/ml，更优选为0.096～0.48mg/ml，如0.096mg/ml、0.144mg/ml、0.192mg/ml、0.24mg/ml、0.288mg/ml、0.336mg/ml、0.384mg/ml、0.432mg/ml、0.48mg/ml。

29、本发明第四方面的实施方式中，用不同递运系统处理neuro-2a细胞的时间为24小时。

30、本发明第五方面涉及本发明第一方面所述核酸递运系统中阳离子脂质和负电荷磷脂在最佳摩尔比时，不同脂质体总浓度所形成的核酸递运系统在neuro-2a细胞上转染效果的影响。以及最佳转染效果时的脂质体总浓度。

31、本发明第五方面的实施方式中，阳离子脂质体和负电荷磷脂在最佳摩尔比下总浓度范围为0.096～0.672mg/ml，如0.672mg/ml、0.576mg/ml、0.48mg/ml、0.384mg/ml、0.288mg/ml、0.192mg/ml、0.096mg/ml。

32、本发明第五方面的实施方式中，阳离子脂质体和负电荷磷脂最佳摩尔比为7：3。

33、本发明第五方面的实施方式中，转染时间为24小时。

34、本发明第六方面涉及本发明第一方面所述核酸递运系统中阳离子脂质和负电荷磷脂在最佳摩尔比时，加入不同摩尔比例的辅助脂质，且保证每组总脂质体浓度相同时，所形成的核酸递运系统在neuro-2a细胞上转染效果的影响。以及加入辅助脂质后最佳转染效果时的摩尔比。

35、本发明第六方面的实施方式中加入的辅助脂质为胆固醇。

36、本发明第六方面的实施方式中，阳离子脂质体、负电荷磷脂以及辅助脂质的摩尔比为7：3：(0-21)，优选为7：3：0、7：3：1、7：3：3、7：3：7、7：3：14、7：3：21。

37、本发明第六方面的实施方式中，脂质体总浓度均为0.48mg/ml。

38、本发明第六方面的实施方式中，转染时间为24小时。

39、本发明第七方面涉及本发明第一方面所述核酸递运系统中阳离子脂质、负电荷磷脂、辅助脂质在最佳摩尔比时，不同脂质体总浓度所形成的核酸递运系统在neuro-2a细胞上转染效果的影响。以及最佳转染效果时的脂质体总浓度。

40、本发明第七方面的实施方式中，阳离子脂质体、负电荷磷脂以及辅助脂质在最佳摩尔比下总浓度范围为0.024～0.72mg/ml，如0.72mg/ml、0.48mg/ml、0.384mg/ml、0.192mg/ml、0.096mg/ml、0.048mg/ml、0.024mg/ml。

41、本发明第七方面的实施方式中，阳离子脂质体、负电荷磷脂以及辅助脂质最佳摩尔比为7：3：14。

42、本发明第七方面的实施方式中，转染时间为24小时。

43、本发明第八方面涉及本发明第一方面所述核酸递运系统在neuro-2a细胞上的最佳摄取时间、最佳转染时间。

44、本发明第八方面的一些实施方式中，所述摄取时间为将本发明第一方面所述核酸递运系统加入到提前种有neuro-2a细胞的96孔细胞板并在0～4小时内吸走继续加新的全培养基转染至24小时，其中0～4小时为摄取时间，如0.5小时、1小时、2小时、4小时。

45、本发明第八方面的一些实施方式中，所述转染时间为将本发明第一方面所述核酸递运系统加入到提前种有neuro-2a细胞的96孔细胞板中直至染色拍照的时间，如0h、3h、6h、12h、24h、48h。

46、本发明第八方面的一些实施方式中，涉及本发明第一方面所述的核酸递运系统由阳离子脂质和负电荷磷脂在涉及本发明的第三方面最佳摩尔比为7：3的条件下制备，脂质体总浓度为涉及本发明的第五方面为0.192mg/ml。

47、本发明第九方面涉及本发明第一方面所述核酸递运系统的包含本发明第二方面在内的多种制备方法对转染效果的影响。

48、本发明第九方面的一些实施方式中，薄膜分散法即为本发明第二方面所述方法。

49、本发明第九方面涉及的挤推法制备方式为：在薄膜分散法制备好的脂质体/mrna复合物的基础上，在不低于磷脂酰丝氨酸类材料相变温度的温度下，将所述超声后的混合物通过脂质体挤出器往复挤压5～40次(优选为10～30次，例如11次、13次、15次、16次、17次、18次、20次、22次、25次、28次、35次)，得到核酸递运系统；其中，所述脂质体挤出器中聚碳酸酯膜的孔径为80～200nm(优选为100～200nm，例如110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm)。

50、本发明第九方面涉及的混合法制备方式包括以下步骤：

51、(1)将阳离子脂质体和负电荷磷脂以最佳摩尔比混合溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜，

52、(2)加入无rna酶水并超声得到空脂质体水溶液，

53、(3)将egfp mrna溶液(1mg/ml)加入与其混合得到脂质体/mrna复合物溶液。

54、本发明第九方面的一些实施方式中，步骤(2)中所加入的无rna酶水和步骤(3)中的egfp mrna溶液总体积为500μl。

55、本发明第九方面的一些实施方式中，步骤(3)中混合时间为5～15min,如6min、7min、8min、9min、10min，优选10min。

56、本发明第九方面涉及的乙醇混合法制备方式包括以下步骤：

57、(1)将阳离子脂质体和负电荷磷脂以最佳摩尔比混合溶于乙醇中，将egfp mrna取(1mg/ml)溶于无rna酶水并置于鸡心瓶中。

58、(2)放入磁子，打开磁力搅拌器。

59、(3)用移液枪将脂质体的乙醇溶液缓慢滴加至mrna水溶液中。

60、(4)滴加完成后，用旋蒸仪旋蒸除去乙醇。

61、本发明第九方面的一些实施方式中，步骤(1)中所加入的无rna酶水和egfp mrna溶液总体积为500μl，乙醇体积为水相总体积的1/3，总脂质体在水相的最终浓度为0.192mg/ml。

62、本发明第九方面的一些实施方式中，步骤(2)中磁力搅拌器的转速为500～1000rpm，如600rpm,700rpm,800rpm,900rpm。

63、本发明第十方面涉及本发明第九方面混合法制备方式制备的由阳离子脂质和负电荷磷脂所形成不同摩尔比的脂质体/mrna复合物在neuro-2a细胞上的转染效果。

64、本发明第十方面的一些实施方式中，阳离子脂质体dotap的绝对浓度始终保持一致为0.1328mg/ml。

65、本发明第十方面的一些实施方式中，阳离子脂质体和负电荷磷脂的摩尔比范围为7：0～7：14，如7：0、7：3、7：7、7：14。

66、本发明第十方面的实施方式中，转染时间为24小时。

67、本发明第十一方面涉及本发明第二方面所述核酸递运系统的合成方法。

68、本发明第十一方面涉及可电离脂质和负电荷磷脂在总浓度相同条件下，不同摩尔比所形成的核酸递运系统在neuro-2a细胞上转染效果的影响。

69、本发明第十一方面的实施方式中，阳离子脂质体dotap由可电离脂质体代替，其中可电离脂质材料优选dodap、dodma、dlin-mc3-dma，进一步优选为dodap。负电荷磷脂材料选自磷脂酰丝氨酸(ps)，进一步优选为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(pops)。

70、本发明第十一方面的实施方式中，可电离脂质体和负电荷磷脂的摩尔比范围为10:0-0:10，优选9：1～2：8，进一步优选8：2～3：7，如8：2、6：4、5：5、4：6、3：7。

71、本发明第十一方面的实施方式中，脂质体总浓度均为0.48mg/ml。

72、本发明第十一方面的实施方式中，转染时间为24小时。

73、本发明第十二方面涉及本发明第二方面所述核酸递运系统的合成方法。其中所用脂质体为可电离脂质体dodap，未加负电荷磷脂。mrna溶液体系为无rna酶水或ph＝4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

74、本发明第十二方面的实施方式中，脂质体总浓度均为0.384mg/ml。

75、本发明第十二方面的实施方式中，转染时间为24小时。

76、本发明中，如无特殊说明，其中：

77、术语“mrna”是指信使核糖核酸，是由dna的一条链作为模板转录而来，携带遗传信息、能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。

78、术语“mem”是指最低必须培养基。

79、术语“egfp mrna”是能表达增强型绿色荧光蛋白的mrna。

80、术语“pbs”是指磷酸盐缓冲溶液。

81、术语“hoechst 33342”是一种用于细胞核染色的蓝色荧光染料。

82、术语“pops”是指1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸。

83、术语“dotap”指(2，3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵。

84、术语“dodap”指1，2-二油酰氧基-3-(二甲氨基)丙烷。

85、术语“cck-8”是指一种基于wst-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。

86、术语“neuro-2a细胞”是指小鼠神经瘤细胞。

87、本发明取得的有益效果：

88、1、本发明揭示了脂质体主要材料、正负电荷摩尔比、脂质体浓度、辅助材料、摄取时间、转染时间、制备方式、净电荷多种条件参数对egfp mrna在neuro-2a细胞上转染效果的影响。

89、2、本发明引入了负电荷磷脂材料，在保证转染效果有效性的同时，也保证了递送系统的安全性。在此次实验总脂质体浓度为0.48mg/ml时，纯dotap组的细胞活力仅为10％左右。而dotap：pops摩尔比为7：3组的细胞活力在80％以上，可见引入负电荷磷脂材料对mrna递运系统安全性的改善。