用于防治犊牛细菌性腹泻的中药组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及兽药技术领域，具体涉及用于防治犊牛细菌性腹泻的中药组合物、及防治犊牛细菌性腹泻的中药组合物的制备方法，及中药组合物在制备预防或治疗犊牛细菌性腹泻药物中的应用。


背景技术：

2.犊牛细菌性腹泻是是危害犊牛健康的常见疾病之一，该病不分季节性，一年四季均可发生，尤其是在哺乳期的犊牛更易发生腹泻病，并且发病率非常高，严重影响了奶牛产业的健康有序发展，犊牛腹泻也被称为犊牛的“杀手”疾病。导致犊牛腹泻的原因非常多，而大肠杆菌是犊牛腹泻的重要原因之一。大肠杆菌作为肠道菌群的正常组成部分，一般情况下是非致病的，但是一些特殊血清型的大肠杆菌可导致家畜的腹泻及败血症，产肠毒素大肠杆菌是引起幼畜腹泻的主要致病菌，常见血清型为大肠杆菌k99。当犊牛身体抵抗力下降，再加上外界恶劣环境、天气等原因，极易引起犊牛消化道功能紊乱、病菌感染或毒素中毒，从而导致出现腹泻。
3.研究表明，大肠杆菌产生耐药性速度很快，耐药频率也逐渐提升，耐药谱范围变得更加广泛，对常用的抗生素已经广谱耐药。目前，常用的庆大霉素、土霉素等抗生素都是极易产生耐药性，降低甚至没有治疗效果，加量使用也会引起食品安全和公共卫生问题。因此，抗生素的替代药物是市场需要的。中兽药在我国畜牧业生产中的应用上千年，起到了积极作用，其具有不易产生耐药性、多靶点起作用的特点。
4.药物联合应用增效的研究是药物筛选中一个重要的方法，常用于抗菌药物联合增效研究。同一类型抗菌药物的协同抑菌作用具有较大的差异，有研究表明，丁香酚与黏杆菌素，尼泊金酯钠与林可霉素，羧甲壳聚糖与多西环素，乙基麦芽酚与阿莫西林的fic指数均显著高于同一单体与其他抗菌药物联用的fic指数，可能与不同类型抗菌药物的作用机制有关，抗菌药物的抑菌机制不同，从而引起单体的增效机制不同。同一抗菌药物与不同单体的联合作用也有明显差异，如阿莫西林与丁香酚联用时具有拮抗作用，与没食子酸酯联用具有无关作用，而与尼泊金酯钠和羧甲壳聚糖联用则具有相加作用，与乙基麦芽酚联用则具有协同作用。因此，不同药物的协同或相加作用是研究热点。
5.方剂的配伍是药物产生疗效的关键所在，合理的配伍使药物之间相辅相成，共同发挥药效。不合理的配伍使药物之间产生拮抗作用或毒副反应，即使遵循“君臣佐使”的原则进行配伍，筛选出对犊牛细菌性腹泻有效的方剂依然非常困难，因为中药材中具有抗腹泻作用的药材有很多，例如乌梅、青蒿、厚朴、金银花、博落回、射干、诃子、金果榄、肉豆蔻等等，加之中药成分复杂，体外实验效果较好的方剂，内服效果不一定明显，大大阻碍了中兽药的研发难度。


技术实现要素：

6.发明目的
7.本发明的目的在于提供一种防治犊牛细菌性腹泻的中药组合物及其制备方法和应用，该中药组合物用于犊牛腹泻疗效确切、稳定可靠、制备方法简单，且乌梅和金果榄具有协同增效效果。
8.解决方案
9.为实现本发明目的，本发明采用的技术方案如下：
10.第一方面，本发明提供了一种用于防治犊牛细菌性腹泻的中药组合物，活性成分由乌梅和金果榄组成，乌梅和金果榄原料药的重量比为1：(0.1～10)，可选地为1：(0.2～5)，可选地为1：(0.3～3)，可选地为1：(0.33～2)，可选地为1：(0.5～1.5)；可选地为1：(0.5～1.2)，可选地为1：(0.5～1)，可选地为1：(0.65～1)，优选为1：(0.7～1)，可选地为1：0.5，优选为1：1。
11.本发明中药组合物中各药材的药性和功效如下：
12.乌梅：味酸、涩，性平。归肝、脾、肺、大肠经。具有敛肺，涩肠，生津，安蛔之功效。常用于肺虚久咳，久泻久痢，虚热消渴，蛔厥呕吐腹痛。
13.金果榄：味苦，性寒。归肺、大肠经。有清热解毒，利咽，止痛之功效。用于咽喉肿痛，痈疽疔毒，泄泻，痢疾，脘腹疼痛。
14.本发明的中药组合物的乌梅和金果榄能够协同发挥最佳药效，犊牛内服的治疗效果显著，可以有效替代抗生素且抗菌效果好。
15.进一步地，所述组合物的剂型为注射剂、粉剂、胶囊剂、片剂、口服液、灌注剂中的任意一种。
16.进一步地，所述组合物的剂型为口服液。
17.进一步地，口服液的生药量为0.5～2g/ml，可选地为1g/ml。
18.进一步地，口服液为中药组合物经过煎煮、浓缩而得。
19.第二方面，提供一种所述的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：按比例取各药材原料，粉碎，煎煮，浓缩而得。
20.进一步的，包括如下步骤：按比例取原料药，加入原料药总重量8～15倍重量的水，煎煮1～3h；药液浓缩至生药量为0.5～2g/ml，灭菌后即制备出口服液。
21.所述制备方法中，煎煮次数为1～4次，可选地，煎煮次数为2～4次，将每次煎煮后药液混合后浓缩。
22.第三方面，提供一种第一方面所述的中药组合物或第二方面所述的制备方法制备的中药组合物在制备预防或治疗犊牛细菌性腹泻药物中的应用。
23.可选地，所述犊牛细菌性腹泻的病原菌为大肠杆菌k99、k88、sta中的一种或几种。
24.有益效果
25.本发明的中药组合物的乌梅和金果榄能够协同发挥最佳药效，犊牛内服的治疗效果显著，可以有效替代抗生物且抗菌效果好，有效率达到80％甚至90％以上，且使用方便，制备方法简单，安全可靠。
附图说明
26.一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。
这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
27.图1本发明的检测样本的pcr-电泳检测结果，其中，m：marker
[0028][0029]
图2本发明的检测样本的pcr-电泳检测结果，其中，m：marker
[0030][0031]
图3本发明的犊牛细菌性腹泻的的犊牛服药后的粪便情况；其中，a为粪便成型，判断为腹泻治愈；b为粪便形态好转，判断为有效；c为粪便不成形，表示腹泻一直存在，判定为无效。
[0032]
图4本发明的抗腹泻中药筛选实验中的小鼠粪便情况，其中，a为小鼠腹泻粪便图片，粪便呈水样粪便，b为健康小鼠的粪便，水圈为尿圈。
具体实施方式
[0033]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034]
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
[0035]
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
[0036]
本发明通过对大量抗腹泻抗菌中药材筛选，发现乌梅、青蒿、厚朴、金银花、博落回、射干、诃子、金果榄、肉豆蔻、连翘等对大肠杆菌k99具有较好的抑制作用，部分筛选结果如下：
[0037]
一、体外抗菌效果筛选
[0038]
1.1试验材料
[0039]
试验菌株及培养基
[0040]
大肠杆菌k99，c83262，购自中国兽医药品监察所。培养基采用普通肉汤培养基。
[0041]
1.2试验药材
[0042]
乌梅、青蒿、厚朴、金银花、博落回、射干、黄连、连翘购自安国聚福中药材有限公司。
[0043]
1.3试验仪器
[0044]
yhc-6102a型电子天平；sc-3616型低速离心机；bd5200光学倒置显微镜；dl-cj-1nd-11洁净工作台；lx-106l型立式压力蒸汽灭菌器；gh-600恒温培养箱；酶标仪。
[0045]
1.4体外抑菌试验方法
[0046]
1.4.1体外抗菌药物筛选
[0047]
药材的提取和试验步骤：取各药材1.5g，加入到20ml的西林瓶中，加入15ml的水，放入95-100℃的水中，进行保温4个小时，待水温降到室温，再晃动药液，使药液混合均匀，继续保温4小时，待将至室温后，离心，取上清，待用。
[0048]
每个药材提取液取0.6ml的进行抗菌实验，筛选出具有抗菌效果的药材，再进行抗病毒效果检测，最后选取同时具有抗菌和抗病毒作用的药材，进行下一步组方筛选。
[0049]
mtt(噻唑蓝)的配制：取mtt 0.5g，加入到100ml的生理盐水中，0.22μm滤膜过滤。分装成5ml的小包装，保存于-20℃冰箱中，备用。
[0050]
菌悬液的制备：取1支灭菌的20ml试管，加入10ml培养基，接种100μl病原菌(大肠杆菌k99)，于37℃环境培养24h，取出，作为试验用菌悬液，备用。
[0051]
mtt法抗菌试验步骤：1)取灭菌1.5ml离心管，加入0.6ml的培养基(2
×
)，再加入0.6ml的药材提取液，吸取20μl菌悬液，加入混合液中；另取不加药材提取液的培养液(1
×
)，加入20μl菌悬液作为阳性对照。37℃环境培养16～18h。每个试验组重复一次。
[0052]
2)离心培养液(8000r/min)，弃去上清液。
[0053]
3)加入1ml灭菌生理盐水、100μl的mtt溶液，充分混匀，37℃反应4h。
[0054]
4)离心(8000r/min)，弃去上清液，加入1ml二甲基亚枫(dmso)，振荡使沉淀充分溶解。
[0055]
5)吸取200μl至96孔板，492nm处观察od值。
[0056]
各药材提取液效果检测如表1所示。
[0057]
表1.药材提取液抗菌效果检测
[0058]
药材名称od值青蒿0.311
±
0.011b黄连0.446
±
0.030b金银花0.432
±
0.043b厚朴0.518
±
0.063b射干0.392
±
0.033b乌梅0.000
±
0.000d博落回0.127
±
0.036c连翘0.728
±
0.042b模型组2.648
±
0.120a
[0059]
注：同列相比较，小写字母不同，表示差异显著(p＜0.05)，小写字母相同，表示差
异不显著(p＞0.05)。
[0060]
根据抗菌效果判定标准，od值越小，说明抗菌效果越好。由表1可知，选取的几个抗菌药材，同等剂量下，乌梅的体外抗大肠杆菌k99株效果最好，博落回次之。
[0061]
二、抗腹泻中药筛选
[0062]
选取报道具有泄泻功效的中药材，筛选抗腹泻中药材。
[0063]
2.1试验材料
[0064]
2.1.1实验动物及管理
[0065]
实验动物：健康spf km小鼠120只(雄性)，体重40-50g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物购入后在北京生泰尔科技股份限公司动物房饲养3天适应环境。
[0066]
饲养管理：实验动物为健康spf级km小鼠，自由采食和饮水，饲料由北京科澳协力饲料有限公司购入。
[0067]
2.1.2试验药物及试剂
[0068]
番泻叶、金果榄、诃子、肉豆蔻、黄连、马齿苋、蒲公英，购自北京同仁堂。
[0069]
阳性对照：蒙脱石散。
[0070]
2.1.3试验器材
[0071]
鼠笼、卷尺、滤纸、16号灌胃针、1ml一次性注射器等。
[0072]
2.2方法
[0073]
2.2.1试验用药的配置
[0074]
100％番泻叶水煎剂：取100.0g番泻叶干燥叶，加入8倍沸水煎煮10-20min，过滤，取滤渣加8倍水煎煮10-20min，合并滤液浓缩，浓缩至100ml，得到浓度为1g/ml的100％番泻叶水煎剂，备用。
[0075]
金果榄：粉碎，过80目筛，取4g过筛的药粉适量纯化水分散后，定容至40ml，摇匀，备用。
[0076]
诃子：粉碎，过80目筛，取4g过筛的药粉适量纯化水分散后，定容至40ml，摇匀，备用。
[0077]
肉豆蔻：粉碎，过80目筛，取4g过筛的药粉适量纯化水分散后，定容至40ml，摇匀，备用。
[0078]
黄连：粉碎，过80目筛，取4g过筛的药粉适量纯化水分散后，定容至40ml，摇匀，备用。
[0079]
马齿苋：粉碎，过80目筛，取4g过筛的药粉适量纯化水分散后，定容至40ml，摇匀，备用。
[0080]
蒲公英：粉碎，过80目筛，取4g过筛的药粉适量纯化水分散后，定容至40ml，摇匀，备用。
[0081]
蒙脱石散：取药粉4g加纯化水定容至40ml，摇匀，制备成混悬液，备用。
[0082]
2.2.2分组处理
[0083]
各样品对番泻叶所致小鼠腹泻的影响
[0084]
将120只km小鼠随机分为8组，每组两个平行组，每个平行组10只。分别为模型组、阳性组、诃子组、金果榄组、肉豆蔻组、马齿苋、蒲公英和黄连组。
[0085]
每组小鼠均灌服给药，连续服药2天，每日一次，分组和服药情况见表2。
[0086]
表2分组与给药
[0087][0088]
2.2.3检测指标
[0089]
番泻叶所致小鼠的稀便率
[0090]
按照2.2.2的分组给药1h后，各组小鼠灌胃番泻叶水煎液(0.5ml/只)，每只笼下铺设滤纸(一笼一鼠)，观察各组小鼠活动情况并记录排便次数，连续观察5h，计算稀便率，计算公式如下。(粪便情况如图4所示，图4a为小鼠腹泻粪便图片，粪便呈水样粪便，图4b为健康小鼠的粪便，水圈为尿圈)
[0091][0092]
2.2.4数据分析
[0093]
采用spss21对数据进行分析，数据用x
±
s表示，以p＜0.05表示差异具有统计学意义
[0094]
2.3结果
[0095]
2.3.1各样品对番泻叶所致小鼠稀便率的影响
[0096]
各药对番泻叶所致小鼠稀便率结果如表3所示：
[0097]
表3各组药品对番泻叶所致小鼠的稀便率疗效
[0098]
[0099][0100]
注：同列相比较，小写字母不同，表示差异显著(p＜0.05)，小写字母相同，表示差异不显著(p＞0.05)。
[0101]
由表3可知，所有中药组的抗腹泻效果，以金果榄最好，相对模型组和其它中药组均有显著差异(p＜0.05)，与阳性药物组效果相当。
[0102]
根据上述各药材的抗菌效果和抗腹泻效果的筛选，其中，乌梅的抗菌效果最佳，博落回次之；金果榄的抗腹泻效果最好，黄连次之。选取体外实验较好的几种中药进行组合，开展临床效果验证。方剂组合如下：
[0103]
实施例1：取乌梅10份、金果榄5份，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时，浓缩至生药量1g/ml，既得。
[0104]
实施例2：取乌梅15份、金果榄5份，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时，浓缩至生药量1g/ml，既得。
[0105]
实施例3：取乌梅15份、金果榄10份，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时，浓缩至生药量1g/ml，既得。
[0106]
实施例4：取乌梅15份、金果榄15份，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时，浓缩至生药量1g/ml，既得。
[0107]
实施例5：取乌梅10份、金果榄15份，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时，浓缩至生药量1g/ml，既得。
[0108]
实施例6：取乌梅5份、金果榄10份，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时，浓缩至生药量1g/ml，既得。
[0109]
对比例1：取厚朴15份，诃子15份，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时，浓缩至生药量1g/ml，既得。
[0110]
对比例2：取乌梅15份、黄连15份，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时，浓缩至生药量1g/ml，既得。
[0111]
对比例3：取博落回15份、金果榄15份，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时，浓缩至生药量1g/ml，既得。
[0112]
对比例4：取乌梅15份、金果榄15份、博落回15份，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时，浓缩至生药量1g/ml，既得。
[0113]
对比例5：取乌梅15份，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时，浓缩至生药量1g/ml，既得。
[0114]
对比例6：取金果榄15份，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时，浓缩至生药量1g/ml，既得。
[0115]
三、临床效果验证
[0116]
在某大型养殖场，发生了犊牛腹泻疾病，经过初步诊断后，采样粪便后进行实验室基因检测，检测项目为大肠杆菌分型、bvdv、隐孢子虫、brv、bcv病原，采用pcr或rt-pcr检测验证，所用引物为常规检测引物，pcr或rt-pcr试剂市售获得。
[0117]
大肠杆菌f41、sta、k88、k99的检测引物为人工合成，可根据特异性片段进行常规引物设计，也可参考文献《pcr detection of virulence factor genes in escherichia coli isolates fromweaned piglets with edema disease and or diarrhea in china》。
[0118]
隐孢子虫cp18s的检测引物为人工合成，可根据常识进行常规引物设计，例如，引物可以如下：
[0119]
c.p-18s-f(seq id no:1)：ggaagggttgtatttattag
[0120]
c.p-18s-r(seq id no:2)：cttgtcactacctccctgtatt
[0121]
轮状病毒brv、bcv的检测引物为人工合成，可根据常识进行常规引物设计，也可参考文献《柳强，侯喜林，车车，刘双翼，刘合义.牛冠状病毒和轮状病毒的双重rt-pcr检测方法的建立及应用[j].中国预防兽医学报,2009,031(009):701-704.》
[0122]
病毒性腹泻病毒bvdv的检测引物为人工合成，可根据常识进行常规引物设计，例如，引物可以如下：
[0123]
bvdv3-f(seq id no:3)：catgcccatagtaggac
[0124]
bvdv3-r(seq id no:4)：ccatgtgccatgtacag
[0125]
病毒基因组dna/rna提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司。
[0126]
pcr、rt-pcr试剂盒，购自北京全式金生物科技有限公司。
[0127]
结果如图1、图2、表4、表5所示，经过综合判断，诊断为大肠杆菌引起的犊牛腹泻。
[0128]
表4病原检测结果
[0129]
[0130][0131]
表4中，“+”为阳性；
“‑”
为阴性；
“±”
为可疑。
[0132]
表4中，bvdv为病毒性腹泻分型，k88、k99、sta、f41为大肠杆菌分型，cp18s为隐孢子虫分型，brv、bcv为轮状病毒分型。
[0133]
表5病原检测结果
[0134]
养殖区编号阳性项目1号大肠杆菌k88、大肠杆菌k99、大肠杆菌sta2号大肠杆菌k88、大肠杆菌sta3号大肠杆菌k88、大肠杆菌k99、大肠杆菌sta4号大肠杆菌k88、大肠杆菌k99、大肠杆菌sta
[0135]
根据表5诊断为1～4号养殖区的犊牛腹泻为大肠杆菌引起的腹泻。
[0136]
使用实施例1～6和对比例1～6的中兽药开展临床实验验证，每组中药组20头牛，每组服用3天，每日分别经口灌服各中兽药50毫升，每日一次，对照组不服药，观察粪便成型情况。分组情况如表6所示。
[0137]
表6.实验分组情况
[0138][0139][0140]
日粮与饲养
[0141]
日粮根据养殖户水平正常饲喂，不做处理；整个试验期，犊牛正常饲养，饲喂次数、饮水不做处理。
[0142]
指标测定和方法
[0143]
腹泻率：眼观结合饲养人员评价每头犊牛粪便成型情况，统计有效率。
[0144]
试验结果
[0145]
犊牛治疗前后粪便情况判断有效率。判定标准为：
[0146]
治愈：病牛饮食与精神均恢复正常，腹泻症状消失、体温正常、鼻镜湿润、粪便软硬适中,则判断为腹泻治愈(见图3a)
[0147]
有效：病牛饮食与精神均有所缓解，腹泻症状消失或显著改善，粪便形态好转，但在4d内并未得到完全康复,则判断为有效(见图3b)
[0148]
无效：病牛经过治疗后，粪便不成形，腹泻一直存在，疾病症状未得到任何程度的改善或症状更加严重,则判定为无效(见图3c)
[0149]
各组实验情况如表7所示。
[0150]
表7.各组实验有效率
[0151][0152]
从表7的结果来看，实施例1-6对于犊牛腹泻均有一定的治疗效果，且实施例4有效率可达90％，显著优于其它实施例。当乌梅和金果榄等比例混合使用时，治疗大肠杆菌引起的犊牛腹泻效果最佳。对比例1(厚朴+诃子)、对比例2(乌梅+黄连)、对比例3(博落回+金果榄)等采用其它抗菌和抗腹泻的配方时，治疗有效率不超过50％有效率，说明具有相近功效的药材组合时不一定能治疗犊牛腹泻，需要经过验证才能判断出组方的优劣，此外，在乌梅和金果榄的基础上增加博落回的方剂(对比例4)的治疗有效率反而降低，说明博落回的加入没有起到加和作用；虽然乌梅和金果榄分别在抗菌和抗腹泻的筛选中具有优异的实验室效果，但在内服时的临床效果并不显著，如对比例5(单独服用乌梅)和对比例6(单独服用金果榄)时，有效率分别为55％、45％，与对照组(自愈率30％)相比，的确有比较好的防治效果，但在同样给药剂量下，疗效远不如两者复配的效果，说明两种药材复配时，能明显协同提高对犊牛腹泻的治疗效果，同时说明本发明的组方可以明显的提高有效率，具有显著效果。
[0153]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。