一种二维纳米溶栓剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物材料领域，具体涉及一种二维纳米溶栓剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.血栓相关疾病严重威胁着人类的健康和生命，是引发急性心肌梗死、脑卒中和肺栓塞等疾病的主要原因。血栓主要由不溶的纤维蛋白、红细胞、活化血小板等血液成分共同组成，可引起循环系统阻塞甚至完全闭塞。血栓会造成远端血液回流受阻，从而导致远端肢体的肿胀、疼痛、相应脏器的缺血、肢体坏死等严重症状，甚至威胁患者的生命。血栓的主要成因之一是由血管内皮损伤进而导致局部血小板的募集和凝血因子水平的上调，导致血液凝固和血管堵塞，此外血栓部位的高活性氧水平也会进一步加重血小板的活化导致血栓的不断加重。
3.临床上常用的血栓治疗手段主要有溶栓治疗、抗凝治疗和介入治疗。其中对于已经形成的血栓最常用的策略就是通过静滴纤溶酶原激活剂等药物进行紧急溶栓。这类药物主要包括阿替普酶、尿激酶、链激酶等，这类药物能够激活纤溶酶原进而作用于纤溶系统，发挥溶栓作用。然而此类药物半衰期短、特异性差，难以持续发挥溶栓效果，并且增加全身性出血风险，带来极大的副作用。因此，开发一种效果好、副作用低的溶栓剂具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种二维纳米溶栓剂，以实现溶栓酶的血栓靶向递送以及氢气介导的血栓微环境调控，能够提高药物半衰期和特异性，发挥持续溶栓效果，降低全身出血风险；解决了溶栓治疗靶向性差、副作用大和血栓易复发等问题。
5.本发明还提出一种上述二维纳米溶栓剂的制备方法。
6.本发明还提出一种上述二维纳米溶栓剂的应用。
7.根据本发明的一个方面，提出了一种二维纳米溶栓剂，包括：二维氢硅烯纳米片、纤维蛋白原和溶栓酶。
8.在本发明的一些实施方式中，所述溶栓酶包括但不限于尿激酶、链激酶、阿替普酶、瑞替普酶等能够激活体内溶栓系统的药物。
9.在本发明的一些实施方式中，所述二维氢硅烯纳米片、纤维蛋白原和溶栓酶的质量比为1：(0.2～2)：(0.01～1)。
10.在本发明的一些优选的实施方式中，所述二维氢硅烯纳米片、纤维蛋白原和溶栓酶的质量比为1：1：0.1。
11.在本发明的一些实施方式中，所述二维氢硅烯纳米片的结构为：直径为200～1000nm的单层纳米片，其主体部分由硅原子呈六元翘曲结构排布组成。
12.根据本发明的再一个方面，提出了上述二维纳米溶栓剂的制备方法，包括以下步
骤：
13.s1、制备二维氢硅烯纳米片；
14.s2、将纤维蛋白原和溶栓酶分散于二维氢硅烯纳片中，制备得到所述纳米溶栓剂。
15.在本发明的一些实施方式中，所述步骤s1具体包括以下步骤：将硅化钙和浓盐酸混合，在-30℃～-10℃温度下反应3～10天，得到所述二维氢硅烯纳片。
16.在本发明的一些优选的实施方式中，所述步骤s1更具体地包括以下步骤：将硅化钙分散于浓盐酸中，并将混合液在-20℃、氩气保护的条件下剧烈搅拌3-10天；反应结束后离心洗涤，并在无水乙醇中探头超声2-16小时得到分散均匀的氢硅烯纳米片。
17.在本发明的一些实施方式中，所述步骤s2具体包括一下步骤：将所述二维氢硅烯纳片分散后，加入纤维蛋白原和溶栓酶，沉淀洗涤后分散于生理盐水中，得到所述二维纳米溶栓剂。
18.在本发明的一些优选的实施方式中，所述步骤s2更具体地包括以下步骤：
19.s21、取1mg制备好的二维氢硅烯纳米片，分散于1ml无水乙醇中，取适量的纤维蛋白原和尿激酶溶解于1ml超纯水中，在剧烈搅拌的条件下将纤维蛋白原和尿激酶的水溶液逐滴加入二维氢硅烯纳米片分散液中，并持续搅拌30min。
20.s22、将上述产物12000rpm离心十分钟，取沉淀，并用超纯水洗涤三次，清洗后的样品分散于1ml生理盐水中，并超声1min使其完全分散，得到二维纳米溶栓剂的分散液。
21.根据本发明的另一个方面，提出了上述二维纳米溶栓剂在制备治疗血栓的药物中的应用。
22.在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、糖浆、悬浮剂或注射剂。
23.在本发明的一些优选的实施方式中，所述药物的剂型为注射剂。
24.本发明涉及一种响应性的二维纳米溶栓剂，具体由二维氢硅烯纳米片、纤维蛋白原和溶栓酶组成。该纳米溶栓剂能够在血液循环中保持稳定，抵达血栓部位后纤维蛋白原被切割成为不溶的纤维蛋白，从而促进纳米溶栓剂在血栓部位的沉积，并缓慢释放溶栓酶和氢气，实现溶栓和抗炎。本发明提供的纳米溶栓剂不仅可以增加溶栓酶的体内循环时间和血栓靶向性，起到更好的溶栓作用并降低出血风险，还能够通过氢气治疗实现活性氧清除和内皮组织修复，调节血栓微环境，防止血栓复发，起到联合抗血栓的作用。
25.本发明至少具有以下有益效果：
26.1)实现了溶栓酶的血栓靶向递送：通过在材料表面包覆纤维蛋白原，能够响应血栓部位的高凝状态，从而实现可溶性纤维蛋白原到不溶的纤维蛋白的转变，促进纳米溶栓剂在血栓部位的沉积。
27.2)有效地延长了溶栓酶的半衰期：溶栓酶是蛋白类生物活性药物，分子量小，半衰期短，极易被代谢排出体外。通过将溶栓酶负载在二维纳米材料上，可以使其具备纳米材料的长循环特性。
28.3)降低了溶栓酶的副作用：溶栓酶不具有特异性，临床使用常伴随着全身性出血风险，通过二维纳米材料的负载和纤维蛋白原的修饰，可以使溶栓酶在循环过程中不会激活纤溶系统，而是在富集到血栓部位后缓慢释放，实现持续的溶栓，从而降低全身副作用。
29.4)氢气治疗防止血栓复发：血栓的主要成因之一是血管内皮的破损激活自身凝血
系统，并且伴随着局部的高活性氧环境，又会进一步促进血小板的募集和活化，导致血栓的加重。单一的溶栓治疗无法从根本上解决这一问题，局部氧化应激和血管破损依旧会诱导血栓复发。而氢气具有抗氧化应激和促组织修复的功能，因此可以起到联合抗血栓的作用，防止血栓的加重和复发。
附图说明
30.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
31.图1为本发明实施例2中二维纳米溶栓剂的凝血酶响应聚集情况实验的透射电镜图，其中，左图为未加入凝血酶时，右图为加入凝血酶后。
32.图2为本发明实施例3中二维纳米溶栓剂的血栓靶向能力实验的扫描电镜图，其中，左图为未加入二维纳米溶栓剂的对照组，右图为加入二维纳米溶栓剂的实验组。
33.图3为本发明实施例4中二维纳米溶栓剂的体外溶栓效果实验的实验结果图。
34.图4为本发明实施例5中二维纳米溶栓剂的体内溶栓效果实验的实验结果图。
具体实施方式
35.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
36.在本发明的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
37.本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
38.由于常规的溶栓药物半衰期短，无法持续发挥作用；特异性差，易导致全身凝血障碍，增加出血风险；难以持续发挥溶栓效果，无法解决血管内皮破损和炎症微环境的问题，无法避免血栓的复发。因此，本发明开发一种响应性二维纳米溶栓剂，能够有效地响应凝血酶发送聚集和沉积，提高药物的血栓靶向和富集效率；延长药物的半衰期，增加体内循环时间；同时实现抗炎和血管修复，防止血栓复发。
39.本发明的一个实施例，制备一种二维纳米溶栓剂，它包括如下组分：二维氢硅烯纳米片、纤维蛋白原、溶栓酶，质量比为1：(0.2～2)：(0.01～1)，在本发明的一个优选的实施例中，使用二维氢硅烯纳米片、纤维蛋白原、尿激酶，质量比为1：1：0.1。
40.本发明的另一个实施例，该二维纳米溶栓剂的制备方法：
41.s1、二维氢硅烯纳米片的制备：
42.将硅化钙分散于浓盐酸中，并将混合液在-20℃、氩气保护的条件下剧烈搅拌3-10天。反应结束后离心洗涤，并在无水乙醇中探头超声2-16小时得到分散均匀的氢硅烯纳米片。
43.s2、纤维蛋白原和尿激酶的负载：
44.取1mg制备好的二维氢硅烯纳米片，分散于1ml无水乙醇中，取适量的纤维蛋白原和尿激酶溶解于1ml超纯水中，在剧烈搅拌的条件下将纤维蛋白原和尿激酶的水溶液逐滴加入二维氢硅烯纳米片分散液中，并持续搅拌30min。
45.将上述产物12000rpm离心十分钟，取沉淀，并用超纯水洗涤三次，清洗后的样品分散于1ml生理盐水中，并超声1min使其完全分散，得到二维纳米溶栓剂的分散液。
46.下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并不一定要限定与下文示例的具体数值。
47.实施例1：二维纳米溶栓剂的制备
48.将1g硅化钙溶解于100ml浓盐酸中，在氩气保护的条件下-20℃反应7天，反应结束后10000rpm离心10分钟后取沉淀用丙酮和乙醇分别清洗两次，并重悬于乙醇中。探头超声(600w)6小时，得到氢硅烯纳米片。将氢硅烯纳米片分散于乙醇中(1mg/ml)，纤维蛋白原(1mg/ml)和尿激酶(100u/ml)溶解于去离子水中，与氢硅烯分散液逐滴混合。得到的混合溶液用去离子水清洗3次后重悬于生理盐水中，得到二维纳米溶栓剂的分散液。
49.实施例2：二维纳米溶栓剂的凝血酶响应聚集情况
50.向二维纳米溶栓剂中加入凝血酶(1u/ml)，37℃孵育5分钟后将处理前后的二维纳米溶栓剂滴加在铜网上，并通过透射电子显微镜观察。如图1所示(其中，左图为未加入凝血酶时，右图为加入凝血酶后)，处理前的二维纳米溶栓剂基本为单分散状态，而经过凝血酶处理的材料则呈现为大面积聚集情况，说明二维纳米溶栓剂能够有效地响应凝血酶发送聚集和沉积。
51.实施例3：二维纳米溶栓剂的血栓靶向能力
52.将小鼠的全血与凝血缓冲液(含氯化钙、氯化钠、tris hcl、和凝血酶)混合，在37℃孵育30分钟，制备血凝块，将血凝块与二维纳米溶栓剂的分散液在37℃条件下共孵育10分钟后固定、脱水，并用扫描电子显微镜进行观察。未经二维纳米溶栓剂处理的血凝块作为对照组。如图2所示(其中，左图为未加入二维纳米溶栓剂的对照组，右图为加入二维纳米溶栓剂的实验组)，与对照组的血凝块相比，经二维纳米溶栓剂处理的血凝块中能够观察到二维纳米片的分布(箭头所指位置)，说明该纳米溶栓剂能够快速地富集并沉积在血栓部位。
53.实施例4：二维纳米溶栓剂的体外溶栓效果
54.将小鼠的全血与凝血缓冲液(含氯化钙、氯化钠、tris hcl、和凝血酶)混合，在37℃孵育30分钟，制备血凝环。将血凝环与含不同浓度尿激酶的纳米溶栓剂分散液(分别包括0μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml和2μg/ml)和尿激酶溶液共孵育，并在不同时间点观察(分别记录2小时和12小时后的血凝环情况)，判断其溶栓能力。如图3所示(图3中拍摄了不
同浓度尿激酶的纳米溶栓剂、以及在不同时间观察点下的凝血环照片)，二维纳米溶栓剂表现出不弱于尿激酶的溶栓效果。说明纳米溶栓剂具有很好的血栓溶解能力。
55.实施例5：二维纳米溶栓剂的体内溶栓效果
56.将10％氯化铁溶液浸润的滤纸贴敷于小鼠颈动脉10min，进行颈动脉血栓造模。造模后将二维纳米溶栓剂尾静脉注射，并在1天后观察其血栓溶解情况。如图4所示(左图为给药前，右图为给药后)，给药前小鼠颈动脉局部颜色加深，呈暗红色，说明存在局部血栓。而尾静脉注射二维纳米溶栓剂后颈动脉恢复鲜红色，说明该溶栓剂具有良好的血栓溶解能力。
57.上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。