抗菌肽A24在制备抗菌药物中的应用

本发明涉及生物，具体地说，涉及抗菌肽a24在制备抗菌药物中的应用。

背景技术：

1、抗菌肽(amps)是多细胞生物为保护宿主免受病原微生物侵害而产生的内源性多肽，由于它们在构成先天性免疫系统中起着至关重要的作用，因此抗菌肽(amps)也被定义为宿主防御肽。通常具有阳离子、两亲性、氨基酸序列短等特点，能够对细菌、真菌、病毒，原生动物起到抑制和杀伤作用(zasloff等，2002)；低耐药和多种杀菌靶位点，杀菌机制与现有抗生素不同以及作为免疫调节剂的广泛活性，因此amps被认为是未来抗菌药物最有力的候选物之一(ali adem bahar等，2013)。但是天然抗菌肽存在抗菌活性较低、合成困难且成本较高、产量低、不易纯化等缺点。因此如何降低成本和获取较高纯度和产量抗菌肽药物是开发难点和希望所在。因此通过发酵表达和纯化流程相结合解决产量低和纯度低的问题。

2、plectasin是mygid等人在2005年从北欧松林地表腐生子囊菌中分离得到，对革兰氏阳性菌具有较好的活性。其包括前体肽和成熟肽，前体肽一般不具活性，成熟多肽由40个氨基酸组成，含有6个cys残基和5个lys残基，一个区别的四肽(dedd)模式，分子量为4407.99da，净电荷在+1～+3之间变化，主要取决于它的两个组氨酸的离子状态。其6个cys在分子内形3对二硫键(cys4-cys30，cys15-cys37，cys19-cys39)，二级结构由3对二硫键稳定的一个n端α-螺旋和c端的两个反向平行的β-折叠结构以及螺旋和折叠结构之间的loop区组成。mygind等研究了plectasin对130余株不同来源肺炎链球菌的抑制作用，发现对于青霉素敏感或抗性菌株，最小杀菌浓度(mic)均在0.1-8μg/ml之间，mic50为1μg/ml(mygind,fischer等，2005)。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供抗菌肽a24在制备抗菌药物中的应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供抗菌肽a24在制备抗菌药物中的应用，所述抗菌肽a24包含如下氨基酸序列或由其组成：

3、i)如seq id no:1所示的氨基酸序列；或

4、ii)在i)的n端和/或c端连接标签得到的氨基酸序列；或

5、iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽。

6、本发明中，所述菌为革兰氏阳性菌，包括但不限于金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、停乳链球菌(streptococcus dysgalactiae)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)。

7、本发明还提供抗菌肽a24的以下任一应用：

8、1)用于食品保鲜；

9、2)用于制备食品添加剂或饲料添加剂；

10、3)用于化妆品领域；

11、4)用于制备消毒剂或防腐剂。

12、第二方面，本发明提供抗菌肽a24的制备方法，包括以下步骤：

13、(1)衍生肽序列设计：依据抗菌肽ap138(seq id no:4)，借助抗菌肽数据库camp，利用random forest进行点突变设计衍生肽50条，并对序列理化性质预测分析，优选衍生肽a24，序列如seq id no:1所示。

14、(2)基因表达框的设计：对编码抗菌肽a24的dna序列按照毕赤酵母所偏爱的密码子进行优化，在优化后的基因序列(seq id no:2)的5’端添加xhoi酶切位点和kex2切割位点，在3’端添加taa和tag终止子序列以及xbai酶切位点，具有如seq idno:3所示的核苷酸序列。

15、(3)重组酵母表达载体的构建：将seq id no:3所示的dna序列和载体ppiczαa经xhoi和xbai双酶切后连接，构建重组酵母表达载体。

16、(4)基因工程菌制备：将重组酵母表达载体线性化后转化毕赤酵母x-33，筛选出高水平表达抗菌肽a24的重组酵母菌。

17、(5)抗菌肽a24的制备：对步骤(4)获取的重组酵母菌进行发酵培养，通过补加50％葡萄糖和甲醇进行诱导，获取发酵液，收集上清，纯化，脱盐后得到抗菌肽a24。

18、步骤(5)具体如下：

19、①种子液的制备：挑取筛选后的高表达酵母转化子单菌落于10ml ypd培养基含100μg/ml zeocin(博来霉素)，30℃，250rpm，摇床培养18-24h，以0.5％-1％接种于200mlypd液体培养基中，30℃，250rpm，摇床培养16-18h，至od600nm值为5，即得种子液；

20、②发酵培养初始阶段：将200ml种子液以10％的比例全部接种于2l基础盐培养基(45g葡萄糖、50g nh4h2po4、20g k2so4、15g mgso4·7h2o、6g kh2po4、0.4g caso4和1.5gkoh，加水定容至2l)中，温度控制在29℃，调ph值至5.0，通气量维持在8-10vvm，转速以600rpm先维持6h，后调至800rpm,溶氧维持在20％以上；

21、③补糖生长阶段：观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升，转速上调至1000rpm,溶氧升至70％以上，开始补加含12‰pmt1(feso4·7h2o 65g，zncl2 20g，cuso4·5h2o 6g，mnso4·5h2o 3g，cocl2 0.5g，na2moo4 0.2g，ki 0.08g，h3bo4 0.02g，生物素0.2g，浓度为98.3％的h2so4 5ml，加水定容至1l)的50％葡萄糖溶液，流加速度为12～36ml/l/min，连续流加6～8h，溶氧维持在20％以上；

22、④甲醇诱导：流加葡萄糖后，饥饿0.5h-1h，开始补加100％甲醇，由第一小时的流速1ml/l/min逐渐增加到第十小时的10ml/l/min，转速上调至1100rpm，ph上调至5.5，控制溶氧在20％以上，至发酵结束。

23、本发明还提供上述毕赤酵母x-33基因工程菌分泌的重组蛋白的纯化方法，其包括对发酵液进行离子交换层析、脱盐、冷冻真空干燥、复溶等步骤。

24、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

25、本发明以真菌防御素plectasin衍生肽ap138为模板，利用生物信息学设计抗菌肽，优选a24，通过对编码抗菌肽a24的基因进行密码子优化，使其在毕赤酵母中重组表达。本发明首次实现抗菌肽a24在毕赤酵母基因工程菌高产表达，发酵液上清蛋白浓度达3.95g/l，发酵液经离子交换柱纯化获得高纯度样品，对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌atcc25923、atcc43300、cvcc546、临床分离株e48，链球菌atcc13813、atcc3399、cau-fri2、cau-fri2，表皮葡萄球菌atcc35984、atcc12228具有较好的抗菌活性，mic在1-4μg/ml(0.22-0.9μm)；同时抗菌肽a24具有低细胞毒性和低溶血性的特点，可应用于抗菌药物、食品保鲜剂、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂开发等领域，具有广阔的应用前景。