一种水苦荬提取物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种水苦荬提取物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、心力衰竭，简称心衰，是指在适量静脉回流的情况下，由于心肌舒张和/或收缩功能障碍，心排血量不足以维持组织代谢需要而引起的以循环功能障碍为主的综合征。据统计，全球心衰患者数量已高达6430万，其中发达国家的心衰患病率约为1～2％。据我国最新流行病学调查显示，心衰患病率在过去15年间增加了44％，在≥35岁的居民中，心衰的患病率为1.3％，即大约1370万人罹患心衰，并且随着我国人口老龄化持续加剧，心衰的发病率想必会进一步提高，加重公共卫生医疗负担。

2、近年来，中医药联合西药常规治疗心衰的优势渐显，如芪苈强心胶囊首次被《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》列入中医中药治疗方案。然而，目前常用的中成药或者复方药物大多是以原药材或者粗提物为原料，其有效成分、无效成分以及毒性成分不明确，存在处方剂量大、服用不方便和安全性低等问题。为了解决上述问题，一类以中药主要活性成分为原料的现代中成药进入市场，如用于心脑血管疾病的银杏内酯注射液、注射用丹参多酚酸等，但目前尚无用于心衰治疗的口服现代中成药。

3、目前有基于临床治疗慢性心力衰竭的验方的有效成分提取研究[1]，通过水煮鹿角、红花、补骨脂、淫羊藿、山茱萸、女贞子和沉香7味原料药组成的中药复方，从中提取得到羟基红花色素、马钱苷、补骨脂苷、异补骨脂苷、没食子酸、5-羟甲基糠醛、特女贞苷、沉香四醇8种有效成分，但其没有除去非有效部分，上述问题依旧存在。另一方面，也有从单味药材中得到具有心肌保护作用的组分组合物[2]，例如由杜仲总黄酮、杜仲环烯醚萜和杜仲木质素组成的组合物，然而，比起这类组合物，单一有效部位更容易明确物质基础，生产成本以及工艺难度更低，也更容易进行质量控制。

4、开发物质基础基本明确、作用机理相对清楚、疗效确切、安全性高的中药有效部位药物具有重要的社会意义和广阔的市场前景。已有文献报道了北水苦荬含有一系列环烯醚萜类成分[3,4]，其中胡黄连苷ii可通过减少活性氧产生的机制改善线粒体功能，从而抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡[5]，因此值得进一步研究其活性成分以获得更安全有效的抗心衰有效部位。

5、现有技术中还公开了一种用于治疗冠心病、高脂血症的中药有效部位、制备方法及从中分离有效成分的方法(cn104840451a，2015.08.19)，其以姜黄科植物毛郁金(curcuma aromatica salisb.)的干燥根茎为药用部位，经有机溶剂提取，提取物经分离、纯化得到含有倍半萜类成分的有效部位，有效部位中倍半萜类成分的含量大于50％，药理实验研究表明莪术二醇、原莪术醇、莪术二酮和及总提取物均有显著治疗心肌缺血作用，可明显减小缺血所致大鼠心肌损伤心肌梗塞区范围，对冠脉结扎大鼠心肌缺血损伤具有明显的保护作用。该专利涉及到5种制备方法，其中4种方法涉及到除乙醇以外的有机溶剂，在生产工艺过程中需要考察有机溶剂残留，生产成本以及环保成本较高，另一种大孔树脂分离的方法得到的有效部位中活性成分的含量为54.06％，仍有较大一部分物质基础未能阐明。

6、参考文献如下：

7、[1]一种抗慢性心衰中药复方有效成分的提取方法。公开号cn113181201a，公开日：2021.07.30；

8、[2]一种具有心肌保护作用的杜仲组分组合物及其制剂。公开号cn104435067a，公开日：2015.03.25；

9、[3]harput u s,varel m,nagatsu a,et al.acylated iridoid glucosidesfrom veronica anagallis-aquatica[j].phytochemistry,2004,65(14):2135-2139；

10、[4]su b n,zhu q x,jia z j.aquaticol,a novel bis-sesquiterpene fromveronica anagallis-aquatica[j].tetrahedron letters,1999,40(2):357-358；

11、[5]li j,yu s,mo d,et al.picrosideⅱinhibits hypoxia/reoxygenation-induced cardiomyocyte apoptosis by ameliorating mitochondrial functionthrough a mechanism involving a decrease in reactive oxygen speciesproduction.[j].international journal of molecular medicine,2015,35(2):446-452。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中治疗心肌缺血的药物要么治疗效果欠佳、要么物质作用基础不明确的缺陷，而提供了一种水苦荬提取物及其制备方法和应用。本发明中明确了水苦荬提取物的活性成分，制备得到了质量稳定的有效部位，明确了药效的物质作用基础，有效提升了用药安全性。

2、对于水苦荬提取物，本发明通过制备液相从水苦荬乙醇提取物(例如北水苦荬75％乙醇提取物)中制备得到环烯醚萜苷有效部位，并利用高速逆流色谱技术从中分离得到毛蕊花甙(verproside)、梓苷(catalposide)、胡黄连苷ii(picroside ii)三个活性成分，并在体内外验证了其抗心衰药效和安全性。

3、本发明提供了一种水苦荬提取物，所述水苦荬提取物中包含环烯醚萜苷类活性成分，所述环烯醚萜苷类活性成分中包含毛蕊花甙、梓苷和胡黄连苷ii；其中：

4、所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比为40-90％；

5、所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(3.0-5.0):1；

6、所述梓苷和所述胡黄连苷ii的质量比为1:(0.1-3.0)。

7、本发明中，所述水苦荬提取物可为本领域常规的车前科植物北水苦荬(veronicaanagallis-aquatica l.)及水苦荬(veronica undulata wall.)的全草的提取物；优选地，所述水苦荬提取物为车前科植物北水苦荬veronica anagallis-aquatica l.及水苦荬veronica undulata wall.的地上部分的提取物。

8、其中，所述北水苦荬可为产自云南省大理州漾濞县的北水苦荬，也可为产自云南省大理市的北水苦荬。

9、本发明中，所述水苦荬提取物可采用下述方法制得：将水苦荬粗提物经柱层析洗脱，即可；其中：

10、所述柱层析中的吸附剂为十八烷基硅烷键合硅胶；

11、所述洗脱的流动相为水和乙腈。

12、其中，所述水苦荬粗提物可为本领域常规的水苦荬粗提物，例如体积分数为0-95％(例如70-80％，再例如75％)乙醇提取得到的提取物。

13、所述水苦荬粗提物可采用下述方法制得：将植物药材水苦荬和提取溶剂混合，经加热提取、过滤得滤液，制得；所述提取溶剂可为体积分数为0-95％的乙醇。

14、所述植物药材水苦荬可经过粉碎预处理再经加热提取。所述粉碎可为粉碎至30目。

15、所述提取溶剂可为体积分数为70-80％的乙醇，例如体积分数为75％的乙醇。

16、所述植物药材水苦荬的质量g和所述提取溶剂的体积ml之比可为本领域常规的比例，例如1:(5-15)，再例如1:10。

17、所述加热提取的温度可为92-98℃，例如95℃。

18、所述加热提取的方式可为加热回流提取。

19、所述加热提取的次数可为一次或两次及以上。

20、所述加热提取的时间可为1-3h，例如2h。当所述加热提取的次数为两次次及以上时，所述加热提取的单次时间可为1-3h，例如2h。

21、所述过滤的筛网目数可为200目。

22、所述滤液还可按照本领域常规手段进行浓缩、干燥。所述浓缩可为65℃±5℃旋蒸浓缩至稠膏。所述干燥可为真空干燥。

23、其中，所述水苦荬粗提物在经柱层析洗脱前可用水溶解。所述水苦荬粗提物在溶解后可经过滤除去不溶物。

24、其中，所述吸附剂的粒径可为5-15μm，例如10μm。

25、其中，所述柱层析的柱温可为20-30℃，例如25℃。

26、其中，所述柱层析中的柱子可为dac50柱。

27、其中，所述洗脱可为梯度洗脱。

28、优选地，当所述洗脱为梯度洗脱时，流动相a为水，流动相b为乙腈；以所述流动相a和b的总体积为100％计，所述梯度洗脱的程序如下：

29、在0-10min，所述流动相a的体积为95％；

30、在10-20min，所述流动相a的体积由95％递减至90％；

31、在20-60min，所述流动相a的体积由90％递减至50％。

32、当采用上述梯度洗脱的程序时，可接取24-40min的洗脱液。

33、其中，所述流动相的流速可为50-90ml/min，例如70ml/min。

34、其中，所述洗脱后所得的洗脱液，可按本领域常规手段进行后处理，例如，先经减压浓缩除去乙腈，再经冷冻干燥得到固体有效部位。

35、本发明中，优选地，所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(3.5-4.8):1，例如(3.56-4.75):1，再例如3.56:1或4.75:1。

36、本发明中，优选地，所述梓苷和所述胡黄连苷ii的质量比为1:(0.3-2.8)，例如1:(0.33-2.5)，再例如1:0.33或1:2.5。

37、本发明中，优选地，所述毛蕊花甙、梓苷和胡黄连苷ii的质量比为4.75:1:2.5或3.56:1:0.33。

38、本发明中，优选地，所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(4.0-5.0):1，所述梓苷和所述胡黄连苷ii的质量比为1:(0.3-3.0)。

39、本发明中，优选地，所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(3.0-5.0):1，所述梓苷和所述胡黄连苷ii的质量比为1:(0.31-2.5)。

40、本发明中，所述毛蕊花甙和梓苷的质量比可为(4.0-5.0):1或(3.0-4.0):1，例如4.75:1或3.56:1。

41、本发明中，所述梓苷和胡黄连苷ii的质量比可为1:(0.31-3.0)，例如1:0.33或1:(2.0-3.0)，还例如1:2.5。

42、本发明中，所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比优选为40-80％，例如40-50％、50-80％或50-70％，还例如44％或66％。

43、本发明中，所述毛蕊花甙在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为30-50％，例如32％、38％。所述重量百分比的计算中，不包含所述水苦荬提取物中所含有的溶剂。

44、本发明中，所述梓苷在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为5-15％，例如8％或9％。所述重量百分比的计算中，不包含所述水苦荬提取物中所含有的溶剂。

45、本发明中，所述胡黄连苷ii在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为1-40％，例如3％或20％。

46、优选地，当所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比为50-80％(例如66％)时，毛蕊花甙在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为30-50％(例如38％)，梓苷在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为5-15％(例如8％)，胡黄连苷ii在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为10-30％(例如20％)。

47、优选地，当所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比为40-80％(例如44％)时，毛蕊花甙在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为30-50％(例如32％)，梓苷在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为5-15％(例如9％)，胡黄连苷ii在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为1-20％(例如3％)。

48、本发明还提供了一种水苦荬提取物的制备方法，其包括下述步骤：将水苦荬粗提物经柱层析洗脱，即可；其中：

49、所述柱层析中的吸附剂为十八烷基硅烷键合硅胶；

50、所述洗脱的流动相为水和乙腈。

51、本发明中，所述水苦荬提取物可为本领域常规的玄参科植物北水苦荬veronicaanagallis-aquatica l.及水苦荬veronica undulata wall.的全草的提取物，优选为地上部分的提取物。

52、本发明中，所述水苦荬粗提取物可采用下述方法制得：将植物药材水苦荬和提取溶剂混合，经加热提取、过滤得滤液，即可；所述提取溶剂可为体积分数为0-95％的乙醇。

53、所述植物药材水苦荬可经过粉碎预处理再经加热提取。所述粉碎可为粉碎至30目。

54、所述提取溶剂可为体积分数为70-80％的乙醇，例如体积分数为75％的乙醇。

55、所述植物药材水苦荬的质量g和所述提取溶剂的体积ml之比可为本领域常规的比例，例如1:(5-15)，再例如1:10。

56、所述加热提取的温度可为92-98℃，例如95℃。

57、所述加热提取的方式可为加热回流提取。

58、所述加热提取的次数可为一次或两次及以上。

59、所述加热提取的时间可为1-3h，例如2h。当所述加热提取的次数为两次次及以上时，所述加热提取的单次时间可为1-3h，例如2h。

60、所述过滤的筛网目数可为200目。

61、所述滤液还可按照本领域常规手段进行浓缩、干燥。所述浓缩可为65℃±5℃旋蒸浓缩至稠膏。所述干燥可为真空干燥。

62、本发明中，所述水苦荬粗提物在经柱层析洗脱前可用水溶解。所述水苦荬粗提取物在溶解后可经过滤除去不溶物。

63、本发明中，所述吸附剂的粒径可为5-15μm，例如10μm。

64、本发明中，所述柱层析的柱温可为20-30℃，例如25℃。

65、其中，所述柱层析中的柱子可为dac50柱。

66、本发明中，所述洗脱可为梯度洗脱。

67、其中，优选地，当所述洗脱为梯度洗脱时，流动相a为水，流动相b为乙腈；以所述流动相a和b的总体积为100％计，所述梯度洗脱的程序如下：

68、在0-10min，所述流动相a的体积为95％；

69、在10-20min，所述流动相a的体积由95％递减至90％；

70、在20-60min，所述流动相a的体积由90％递减至50％。

71、当采用上述梯度洗脱的程序时，可接取24-40min的洗脱液。

72、本发明中，所述流动相的流速可为50-90ml/min，例如70ml/min。

73、本发明中，所述洗脱后所得的洗脱液，可按本领域常规手段进行后处理，例如，先经减压浓缩除去乙腈，再经冷冻干燥得到固体有效部位。

74、本发明还提供了一种水苦荬提取物，其采用上述方法制得。

75、本发明还提供了一种所述水苦荬提取物在制备治疗和/或预防心力衰竭的药物中的应用。

76、本发明还提供了一种治疗和/或预防心力衰竭的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的所述水苦荬提取物。

77、术语“心力衰竭”是指在适量静脉回流的情况下，由于心肌舒张和/或收缩功能障碍，心排血量不足以维持组织代谢需要而引起的以循环功能障碍为主的综合征，集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。

78、术语“治疗有效量”是指为缓解个体的心力衰竭的症状所需要的量。对每种具体情况中的个体要求调节剂量。该剂量可以在较宽范围内变化，其取决于许多因素如待治疗病症的严重性、患者的年龄和总体健康状况、患者正用于治疗的其他药物、给药的途径和形式以及医生的偏好和经验。

79、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

80、本发明所用试剂和原料均市售可得。

81、本发明的积极进步效果在于：

82、从单味中药材水苦荬的提取物(例如75％乙醇提取物)中通过制备液相制备得到了主要由三个活性成分构成的环烯醚萜苷有效部位，在体外细胞水平上验证了对心肌细胞氧糖剥夺损伤的保护作用，在异丙肾上腺素诱导心衰小鼠模型和左冠状动脉前降支结扎心衰小鼠模型上验证了体内抗心衰药效，并通过亚急毒实验验证了其安全性。