间充质干细胞细胞碎片在免疫调节中的应用的制作方法

1.本发明涉及干细胞技术领域，尤其是涉及一种间充质干细胞细胞碎片在免疫调节中的应用。


背景技术：

2.间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的成体细胞，其来源丰富，如骨髓、脂肪、牙髓、胎盘、脐带等均能分离得到。目前大量的研究表明间充质干细胞具有免疫调节作用，临床研究已将其用于治疗移植排斥反应、自身免疫性疾病，其主要机制是间充质干细胞被募集到受损组织，通过旁分泌作用分泌细胞因子，改善微环境，促进受损器官组织结构功能的修复。
3.目前大量的研究报道间充质干细胞发挥免疫调节作用主要表现其可以通过对dc细胞、nk细胞、b细胞、t细胞、调节性t细胞等免疫细胞的影响来发挥免疫调节作用，其中炎症因子ifn-γ、tnf-α等因子在间充质干细胞发挥免疫调节的过程中起着重要作用。目前针对间充质干细胞对免疫细胞的体外免疫抑制效应包括抑制t细胞的增殖以及抑制nk细胞分泌tnf-α等，针对发挥免疫抑制效应的机制目前有研究报道人脐带间充质干细胞是通过可溶性因子前列环素e2(pge2)来实现的。
4.在研究间充质干细胞免疫调节作用的机制过程中研究者还发现其分泌的细胞因子、外泌体具有类似功能。与单纯应用间充质干细胞相比，具有稳定性好、方便保存、无免疫原性的特点，更好弥补移植应用的不足。在提取外泌体或细胞因子过程中，首先会低速去除间充质干细胞培养上清中的细胞碎片，作为一种废弃物，目前暂无其功能研究的报道，这些弃掉的细胞碎片是否也具有与完整间充质干细胞相似的免疫调节作用以及作用机制更是无人知晓。因此，如何利用这些弃掉的细胞碎片，以实现对间充质干细胞资源的充分利用，是目前有待解决的问题。
5.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的在于提供一种间充质干细胞细胞碎片在非诊断和治疗目的的免疫调节或制备免疫调节制剂中的应用，以缓解现有技术存在的对间充质干细胞细胞碎片资源缺乏有效利用手段的问题。
7.本发明的第二目的在于提供一种免疫调节制剂。
8.为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
9.本发明提供了一种间充质干细胞细胞碎片在非诊断和治疗目的的免疫调节或制备免疫调节制剂中的应用。
10.优选地，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞。
11.优选地，所述脐带间充质干细胞为p3～p8代脐带间充质干细胞。
12.优选地，所述免疫调节包括调节dc细胞、nk细胞、b细胞和t细胞中的至少一种；
13.优选地，所述免疫调节包括调节调节性t细胞；
14.优选地，所述免疫调节包括抑制th1细胞和th17细胞；
15.优选地，所述免疫调节包括抑制免疫细胞分泌tnf-α。
16.优选地，所述间充质干细胞细胞碎片的制备方法包括：收集间充质干细胞培养上清，4000～8000g后弃上清，得到所述间充质干细胞细胞碎片。
17.优选地，所述间充质干细胞细胞碎片的制备方法包括：将间充质干细胞反复冻融，4000～8000g离心后弃上清，得到所述间充质干细胞细胞碎片；
18.优选地，先将间充质干细胞重悬为1～5
×
106cells/ml的细胞悬液，再反复冻融；
19.优选地，所述反复冻融包括经液氮速冻和30～40℃水浴复融，重复2～4次；
20.优选地，所述反复冻融包括经液氮速冻和37℃水浴复融，重复3次；
21.优选地，4000～8000g离心5～10min后弃上清，得到所述间充质干细胞细胞碎片。
22.优选地，所述间充质干细胞细胞碎片的制备方法包括：将间充质干细胞超声破碎，4000～8000g离心后弃上清，得到所述间充质干细胞细胞碎片；
23.优选地，先将间充质干细胞重悬为1～5
×
106cells/ml的细胞悬液，再超声破碎；
24.优选地，所述超声破碎的条件为超声清洗机30～50khz频率超声破碎5～10min；
25.优选地，4000～8000g离心5～10min后弃上清，得到所述间充质干细胞细胞碎片。
26.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种免疫调节制剂，该免疫调节制剂包含间充质干细胞细胞碎片，所述间充质干细胞细胞碎片采用上述制备方法制备得到。
27.优选地，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞。
28.优选地，所述脐带间充质干细胞为p3～p8代间充质干细胞。
29.优选地，所述免疫调节制剂包括间充质干细胞细胞碎片的悬浮液。
30.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
31.本发明通过实验发现，将间充质干细胞细胞碎片作用于人外周血淋巴细胞中，能够体外抑制th1细胞和th17细胞，以及抑制人外周血淋巴细胞分泌tnf-α。并且，间充质干细胞细胞碎片中的peg2和hgf的含量远低于间充质干细胞培养上清和细胞内容物中的peg2和hgf的含量；同时，将间充质干细胞细胞碎片作用于人外周血淋巴细胞后，共培养后上清中peg2和hgf的含量也远低于间充质干细胞与人外周血淋巴细胞共培养后培养基上清中peg2和hgf的含量。因此，本发明发现，间充质干细胞细胞碎片以不同于间充质干细胞以及间充质干细胞培养上清的作用机制对免疫细胞进行调节。
32.基于上述发现，本发明提供了一种间充质干细胞细胞碎片在非诊断和治疗目的的免疫调节或制备免疫调节制剂中的应用。实验证实，间充质干细胞细胞碎片对人外周血淋巴细胞中th1和th17的抑制作用优于完整的间充质干细胞细胞；并且，间充质干细胞细胞碎片对人外周血淋巴细胞分泌tnf-α的抑制作用也优于完整的间充质干细胞。本发明提供的间充质干细胞细胞碎片在非诊断和治疗目的的免疫调节或制备免疫调节制剂中的应用为后续免疫方面的疾病的治疗提供了新的治疗手段与技术支持，并且也实现了充分利用间充质干细胞资源。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体
实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1为实施例1提供的细胞碎片悬液光镜照片，图中箭头所示即为细胞碎片；
35.图2和图3为hucmsc碎片悬液-1、hucmsc碎片悬液-2、hucmsc内溶物悬液、去除细胞碎片的hucmsc培养基上清中peg2和hgf的含量差异情况；
36.图4和图5为实施例2中人脐带间充质干细胞碎片悬液作用人淋巴细胞后，流式细胞术检测th1和th17细胞的检测结果；
37.图6为实施例2中人脐带间充质干细胞碎片悬液作用人淋巴细胞后对其亚群th1和th17的比例的影响；
38.图7为实施例2中人脐带间充质干细胞碎片悬液作用人淋巴细胞后对其亚群th1和th17的比例的影响。
具体实施方式
39.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.需要说明的是：本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案；本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。
41.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种间充质干细胞细胞碎片在免疫调节中的应用，所述在免疫调节中的应用主要包括在非诊断和治疗目的的免疫调节中的应用，以及在制备免疫调节制剂中的应用。其中，非诊断和治疗目的的免疫调节的实例包括但不限于体外对细胞的免疫调节，例如对dc细胞(dendritic cells，树突状细胞)、nk细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)、b细胞(b lymphocytes，b淋巴细胞)和t细胞(tlymphocytes，t淋巴细胞)等免疫细胞的免疫调节作用，以研究相关分子作用机制或信号通路等，也可以应用于相关药物研究等。
42.本发明通过实验发现，将间充质干细胞细胞碎片作用于人外周血淋巴细胞中，能够体外抑制th1细胞和th17细胞，以及抑制人外周血淋巴细胞分泌tnf-α(tumor necrosis factor，肿瘤坏死因子-α)。并且，经验证，间充质干细胞细胞碎片中的peg2(前列环素e2)和hgf(肝细胞生长因子)的含量与间充质干细胞细胞培养上清、以及间充质干细胞细胞内容物中的peg2和hgf的含量具有很大差异，远低于间充质干细胞细胞培养上清和细胞内容物中的peg2和hgf的含量。并且，将间充质干细胞细胞碎片作用于人外周血淋巴细胞后，共培养后上清中peg2和hgf的含量也远低于间充质干细胞与人外周血淋巴细胞共培养后培养基上清中peg2和hgf的含量。上述实验结果说明间充质干细胞细胞碎片发挥免疫抑制功介导的因子与目前报道人脐带间充质干细胞分泌的pge2和hgf存在明显差异。
43.在一些可选的实施方式中，所述免疫调节包括调节dc细胞、nk细胞、b细胞和t细胞
中的至少一种。可选地，所述免疫调节包括调节性t细胞；可选地，所述免疫调节包括抑制th1细胞和th17细胞。如上所述，实验证实将间充质干细胞细胞碎片作用于人外周血淋巴细胞后能够体外抑制th1细胞和th17细胞，其中th1细胞包括cd3
+
cd8-ifn-γ
+
th1细胞，th17细胞包括cd3
+
cd8
－
il-17
+
th17细胞。间充质干细胞细胞碎片相比于完整的间充质干细胞，对于上述两种辅助t细胞的抑制率更低。
44.在一些可选的实施方式中，所述免疫调节包括抑制免疫细胞分泌tnf-α。如上所述，实验证实将间充质干细胞细胞碎片作用于人外周血淋巴细胞后能够体外抑制其分泌tnf-α，间充质干细胞细胞碎片相比于完整的间充质干细胞，对于tnf-α的抑制率也更低。
45.在一些可选的实施方式中，间充质干细胞的来源包括但不限于骨髓、脐带血、脐带组织、胎盘组织和脂肪组织，优选为脐带间充质干细胞，更优选为p3～p8代脐带间充质干细胞。
46.在一些可选的实施方式中，采用直接离心法获取间充质干细胞碎片，所述间充质干细胞细胞碎片的制备方法包括：收集间充质干细胞培养上清，4000～8000g后弃上清，得到所述间充质干细胞细胞碎片。
47.在另一些可选的实施方式中，采用反复冻融法获取间充质干细胞碎片，所述间充质干细胞细胞碎片的制备方法包括：将间充质干细胞反复冻融，4000～8000g离心后弃上清，离心力例如可以为但不限于为4000、5000、6000、7000或8000g，得到所述间充质干细胞细胞碎片。在该方法中，优选先将间充质干细胞重悬为1～5
×
106cells/ml的细胞悬液，例如可以为但不限于为1、2、3、4或5
×
106cells/ml的细胞悬液，再反复冻融；优选先制备成2
×
106cells/ml的细胞悬液再反复冻融。反复冻融的条件参数优选包括经液氮速冻和30～40℃水浴复融，重复2～4次，优选为经液氮速冻和37℃水浴复融，重复3次。优选将经反复冻融的间充质干细胞4000～8000g离心5～10min后弃上清，得到所述间充质干细胞细胞碎片，其中优选离心10min后弃上清。
48.在另一些可选的实施方式中，采用超声破碎法获取间充质干细胞碎片，所述间充质干细胞细胞碎片的制备方法包括：将间充质干细胞超声破碎，4000～8000g离心后弃上清，离心力例如可以为但不限于为4000、5000、6000、7000或8000g，得到所述间充质干细胞细胞碎片。在该方法中，优选先将间充质干细胞重悬为1～5
×
106cells/ml的细胞悬液，例如可以为但不限于为1、2、3、4或5
×
106cells/ml的细胞悬液，再超声破碎；优选先制备成2
×
106cells/ml的细胞悬液再超声破碎。超声破碎的条件参数优选包括超声清洗机30～50khz频率超声5～10min，超声频率例如可以为但不限于为30、35、40、45或50khz，优选为40khz；超声时间例如可以为但不限于为5、6、7、8、9或10min。优选将经超声破碎的间充质干细胞4000～8000g离心5～10min后弃上清，得到所述间充质干细胞细胞碎片，其中优选离心10min后弃上清。
49.在一些可选的实施方式中，将间充质干细胞细胞碎片应用于非诊断和治疗目的免疫调节，是通过将间充质干细胞细胞碎片制备成间充质干细胞细胞碎片悬液实现的，间充质干细胞细胞碎悬液为将间充质干细胞细胞碎片采用缓冲液重悬后得到的制剂，优选使用pbs重悬。采用直接离心获取的间充质干细胞碎片优选每100ml培养基获得的细胞碎片沉淀用0.5ml pbs的比例进行悬浮。
50.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种免疫调节制剂，该免疫调节制剂
包含间充质干细胞细胞碎片，该免疫调节制剂中的间充质干细胞细胞碎片采用上述直接离心法、反复冻融法或超声破碎法制备得到。本发明提供的免疫调节制剂中用于制备细胞碎片的间充质干细胞的的来源包括但不限于骨髓、脐带血、脐带组织、胎盘组织和脂肪组织，优选为脐带间充质干细胞，更优选为p3～p8代脐带间充质干细胞。
51.本发明提供的免疫调节制剂可选择本领域一般的制剂形式，只要不影响其中的间充质干细胞细胞碎片发挥正常的生理功能即可，例如可以为但不限于为固体制剂，比如冻干剂；液体制剂，比如混悬液；或者凝胶剂等。免疫调节制剂中可以含有本领域可接受的一般的辅料，包括但不限于ph调节剂、缓冲液、载体、赋形剂或保湿剂等。
52.下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
53.实施例1
54.将收集的三个来源的p5代hucmsc的培养基上清100ml，制备成三个0.5ml细胞碎片悬液样本，分别为样本1、样本2和样本3。制备方法如下：样本收集：将hucmsc以4000～8000/cm2密度接种至175cm2塑料细胞培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、含5％co2培养箱中培养，培养基体积20～30ml，72小时后收集培养基上清以及细胞；将收集的培养基上清采用4000～8000g离心10min后弃上清，每100ml培养基获得的细胞碎片沉淀用0.5ml pbs的比例进行悬浮，制成细胞碎片悬液，细胞碎片悬液照片如图1所示，图中箭头所示即为细胞碎片。
55.然后采用淋巴分离液分离人外周血中的淋巴细胞，计数，用完全培养基(1640培养基+10％fbs+2.5μg/ml pha)以1
×
106cell/ml密度悬浮，接种于6孔板，每孔2ml，共计接种12个复孔。最后进行实验组分组，包括对照组、样本组1、样本组2和样本组3，每组3个复孔，依次加入100μl pbs、100μl样本1、100μl样本2和100μl样本3。完成处理后置于饱和湿度co2培养中培养3天后收集人淋巴细胞，采用流式细胞术检测th1(cd3
+
cd8-ifn-γ
+
)和th17(cd3
+
cd8
－
il-17
+
)的比例，同时保留培养基上清采用tnf-α、pge2和hgf的elisa试剂盒检测其中的含量。最后根据抑制率计算公式计算出相应的抑制率，其公式为：抑制率％＝(1－实验组(比例或含量)/对照组(比例或含量))
×
100％，以及通过检测培养基上清中的pge2和hgf含量来判断细胞碎片悬液发挥免疫抑制功能是否与人脐带间充质干细胞一样依赖于相同分泌因子。
56.实施例2
57.将hucmsc以4000～8000/cm2密度接种至175cm2塑料细胞培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、含5％co2培养箱中培养，培养基体积20～30ml，72小时后200～400g离心6min后洗涤2遍后弃上清保留细胞沉淀并计数。按照上述步骤消化收集3瓶不同来源的175cm2培养瓶的hucmsc，分别获得0.8
×
107cells、1
×
107cells和1
×
107cells。将各样本制成2
×
106cells/ml的pbs悬液，经过液氮速冻和37℃水浴复融，反复进行3次后4000～8000g、10min离心弃上清，采用pbs重悬制成4
×
106cells/ml三个样本的细胞碎片悬液，分别记为样本1、样本2和样本3。
58.然后采用淋巴分离液分离人外周血中的淋巴细胞，计数，用完全培养基(1640培养基+10％fbs+2.5μg/ml pha)以1
×
106cell/ml密度悬浮，接种于6孔板，每孔2ml，共计接种12个复孔。最后进行实验组分组，包括对照组、样本组1、样本组2和样本组3，每组3个复孔，依次加入100μl pbs、100μl样本1、100μl样本2和100μl样本3。完成处理后置于饱和湿度co2培养中培养3天后收集人淋巴细胞，采用流式细胞术检测th1(cd3
+
cd8-ifn-γ
+
)和th17(cd3
+
cd8
－
il-17
+
)的比例，流式细胞术检测结果如图4和图5所示。同时保留培养基上清采用tnf-α、pge2和hgf的elisa试剂盒检测其中的含量，最后根据抑制率计算公式计算出相应的抑制率，其公式为：抑制率％＝(1－实验组(比例或含量)/对照组(比例或含量))
×
100％，以及通过检测培养基上清中的pge2和hgf含量来判断细胞碎片悬液发挥免疫抑制功能是否与人脐带间充质干细胞一样依赖于相同分泌因子。人脐带间充质干细胞碎片悬液作用人淋巴细胞，对其亚群th1和th17的比例的影响结果如图6所示，人脐带间充质干细胞碎片悬液作用人淋巴细胞，对其分泌tnf-α的影响如图7所示。
59.实施例3
60.消化收集3瓶不同来源的175cm2培养瓶的hucmsc，分别获得0.8
×
107cells、1
×
107cells和1
×
107cells，经过反复冻融离心去上清后，采用pbs重悬制成2ml、2.5ml和2.5ml三个样本的细胞碎片悬液，分别记为样本1、样本2和样本3，具体步骤同实施例2。然后采用淋巴分离液分离人外周血中的淋巴细胞，计数，用完全培养基(1640培养基+10％fbs+2.5μg/ml pha)以1
×
106cell/ml密度悬浮，接种于6孔板，每孔2ml，共计接种12个复孔。最后进行实验组分组，包括对照组、样本组1、样本组2和样本组3，每组3个复孔，依次加入100μl pbs、50μl样本1+50μl pbs、50μl样本2+50μl pbs和50μl样本3+50μl pbs。完成处理后置于饱和湿度co2培养中培养3天后收集人淋巴细胞，采用流式细胞术检测th1(cd3
+
cd8-ifn-γ
+
)和th17(cd3
+
cd8
－
il-17
+
)的比例，同时保留培养基上清采用tnf-α、pge2和hgf的elisa试剂盒检测其中的含量。最后根据抑制率计算公式计算出相应的抑制率，其公式为：抑制率％＝(1－实验组(比例或含量)/对照组(比例或含量))
×
100％，以及通过检测培养基上清中的pge2和hgf含量来判断细胞碎片悬液发挥免疫抑制功能是否与人脐带间充质干细胞一样依赖于相同分泌因子。
61.对照例1
62.消化收集实施例1来源的3瓶175cm2培养瓶的hucmsc，收集数量分别为1
×
107cells，1.2
×
107cells和1
×
107cells，然后分别加入2.5ml、3.0ml和2.5ml含10％的fbs和2.5μg/ml pha的1640培养基和3ml pbs重悬，分别制成浓度为4
×
106cells/ml的细胞悬液，标记为样本1、样本2和样本3。然后采用淋巴分离液分离人外周血中的淋巴细胞，计数，用完全培养基(1640培养基+10％fbs+2.5μg/ml pha)以1
×
106cell/ml密度悬浮，接种于6孔板，每孔2ml，共计接种12个复孔。最后进行实验组分组，包括对照组、样本组1、样本组2和样本组3，每组3个复孔，依次加入100μl含10％fbs和2.5μg/ml pha的1640培养基、100μl样本1、100μl样本2和100μl样本3。完成处理后置于饱和湿度co2培养中培养3天后收集人淋巴细胞，采用流式细胞术检测th1(cd3
+
cd8-ifn-γ
+
)和th17(cd3
+
cd8
－
il-17
+
)的比例，同时保留培养基上清采用tnf-α、pge2和hgf的elisa试剂盒检测其中的含量。最后根据抑制率计算公式计算出相应的抑制率，其公式为：抑制率％＝(1－实验组(比例或含量)/对照组(比例或含量))
×
100％，以及通过检测培养基上清中的pge2和hgf含量来判断细胞碎片悬液发挥免疫抑制功能是否与人脐带间充质干细胞一样依赖于相同分泌因子。
63.实验结果：
64.(一)实施例1～实施例3和对照例1制备得到的细胞碎片悬液和细胞悬液对th1、th2和tnf-α分泌的抑制率。
65.表1.各试验组对人淋巴细胞亚群th1和th17增殖以及对tnf-α分泌的影响
[0066][0067]
(二)实施例1～实施例3和对照例1制备得到的细胞碎片悬液和细胞悬液与淋巴细胞共培养后的培养基上清中pge2和hgf的含量。
[0068]
表2各试验组与淋巴细胞共培养后的培养基上清中pge2和hgf的含量
[0069]
[0070][0071]
(三)细胞碎片悬液、hucmsc破碎的内溶物以及培养上清中pge2和hgf的检测：
[0072]
将实施例1和实施例2制备的两个样本1各1ml，分别标记为hucmsc碎片悬液-1和hucmsc碎片悬液-2。收集实施例1在制备细胞碎片过程中4000～8000g、10min离心后的上清标记为hucmsc培养基上清，收集实施例2在制备细胞碎片过程中4000～8000g、10min离心后的上清标记为hucmsc内溶物悬液，然后采用pge2和hgf两种人源elisa试剂盒对制备这四个样本进行检测，实验结果如图2和图3所示，确定采用实施例1和实施例2制备的细胞碎片悬液与脐带间充质干细胞在培养过程中分泌到培养基中的因子以及经过反复冻融释放到pbs中的因子在成分上存在明显差异。
[0073]
从上述实验结果可以看出：hucmsc培养基上清和hucmsc制备的细胞碎片悬液均具有免疫抑制能力，hucmsc制备的细胞碎片悬液的免疫抑制能力更优，并且同等细胞数量hucmsc制备的细胞碎片悬液的免疫抑制能力优于humsc。同时，从表1可以看出采用直接离心法得到的hucmsc细胞碎片悬液的抑制能力也优于完整的hucmsc的th细胞抑制能力，这说明可以将实际生产中hucmsc细胞碎片，而无须单独通过破碎细胞来获得细胞碎片，使实际生产中细胞碎片这一部分“废弃物”得到有效的利用。
[0074]
从表2数据可以看出，hucmsc碎片悬液发挥免疫抑制功能时培养基上清中pge2和hgf含量明显低于hucmsc组，说明hucmsc细胞碎片发挥免疫抑制作用与目前普遍认为的hucmsc的作用机制不同，hucmsc细胞碎片是通过其自身产生的免疫调节作用。这从图2和图3的实验结果也可以看出，间充质干细胞细胞碎片中的peg2和hgf的含量远低于间充质干细胞细胞培养上清和细胞内容物中的peg2和hgf的含量。上述实验结果说明间充质干细胞细胞细胞碎片不是通过间充质干细胞细胞的peg2和hgf发挥的免疫调节作用。
[0075]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。