羟基取代的鞘脂的制作方法

本发明提供了羟基取代的鞘脂(sphingolipids)及其制备和用途，以及其作为组成成分的化妆品配制品。

背景技术：

0、现有技术

1、护理化妆品的目的是保持外表年轻的印象，例如皮肤和头发年轻的印象。原则上有多种方法可以实现这一点。例如，现有的皮肤损伤，如不规则色素沉着或皱纹，可以通过遮瑕粉或遮瑕霜来修复。

2、另一种方法是保护皮肤免受导致永久性损伤并因此导致皮肤衰老的环境影响。因此，该想法是进行预防性干预，从而延缓衰老过程。

3、皮肤最重要的功能是一方面保护身体免得水分不受控制地逸出，另一方面防止有害化学物质或细菌和太阳照射的侵入。人皮肤长期暴露在阳光下会导致光诱导的皮肤衰老和/或色素沉着障碍的发展。

4、阳光的这种有害影响尤其归因于阳光光谱中存在的uvb照射(280-320nm)。

5、人们仍然一直在寻求能够减少或甚至防止尤其是由太阳照射引起的皮肤衰老迹象的发展的皮肤护理物质。

6、fr2855049公开了用于加强皮肤屏障的基于6-羟基-鞘氨醇的神经酰胺。

7、fr2874610公开了n-二羟烷基羟基链烷酰胺衍生物及其在化妆品中的用途。

8、本发明的目的是提供减少由太阳照射引起的衰老迹象的物质。

9、发明描述

10、出人意料地发现，下文所述的神经酰胺衍生物能够实现本发明的目的并抑制由uv光引起的活性氧物质(ros)的形成。

11、据此，本发明提供了某些羟基取代的鞘脂(sphingolipids)及其制备方法和用途。

12、本发明还提供包含所述羟基取代的鞘脂的化妆品配制品。

13、本发明的鞘脂的优点是其对dna损伤的保护作用，特别是uv诱导的损伤，特别是在皮肤中。

14、本发明的鞘脂的另一个优点是其增稠作用，特别是在化妆品配制品中。

15、因此，本发明提供了通式i的鞘脂

16、

17、其中

18、r1是具有2至54个、优选2至30个、更优选2至18个碳原子的烃基，其被至少一个选自-oh和-cooh的基团取代，并且任选地可以被至少一个-o-中断，

19、r2是h、磷酸胆碱、丝氨酸、乙醇胺或糖，优选糖或h，更优选h，

20、x是ch＝ch、ch2-ch2或ch2-hcoh，优选ch2-hcoh，并且

21、y选自-oh和h，

22、前提条件是，当r1是在ω-位置仅被-oh基团取代的线性烷基时，x是ch2-hcoh。

23、通式i的鞘脂具有多个立体异构中心，所有这些都包括在通式i中。

24、除非另有说明，所有陈述的百分比(％)均为质量百分比。

25、本发明优选的鞘脂的特征在于

26、r1优选选自具有2至54个、优选2至30个、更优选2至18个碳原子的线性或支链烷基，其被至少一个选自-oh和-cooh的基团取代，优选地并且

27、r2、y是h，特别优选地并且

28、x是ch2-hcoh。

29、在本发明的优选实施方案中，r1的烷基优选是直链的。

30、本发明进一步优选的鞘脂的特征在于

31、r1优选选自具有2至54个、优选2至30个、更优选2至18个碳原子的烃基，其在ω-位置被至少一个选自-oh和-cooh的基团取代，优选地并且

32、r2、y是h，特别优选地并且

33、x是ch2-hcoh。

34、在本发明的优选实施方案中，r1的烃基优选是直链的。

35、本发明特别优选的鞘脂选自

36、羟基丁酰基植物鞘氨醇

37、

38、琥珀酰基植物鞘氨醇

39、

40、葡糖酰基植物鞘氨醇(gluconoyl phytosphingosine)

41、

42、乳糖酰基植物鞘氨醇(lactobionoyl phytosphingosine)

43、和

44、2-羟基-3，3-二甲基-羟基丁酰基植物鞘氨醇

45、

46、由于本发明的鞘脂表现出突出的治疗效果，本发明还提供了本发明的鞘脂用于细胞损伤的治疗中，特别是用于细胞损伤的预防，优选由uv照射引起的细胞损伤，特别是皮肤细胞损伤，根据本发明的细胞损伤优选是dna损伤。

47、本发明的鞘脂也可用于纯化妆品应用，因此本发明还提供了至少一种本发明的鞘脂用于预防由uv照射引起的皮肤衰老的美容性非治疗用途。

48、本发明的鞘脂可以很容易地掺入化妆品配制品中。因此，本发明还提供包含至少一种本发明的鞘脂的化妆品配制品，该鞘脂的量优选为0.02重量％至1.50重量％，优选为0.03重量％至1.00重量％，更优选为0.05重量％至0.50重量％，按重量计的百分比是基于总配制品。

49、本发明的化妆品配制品特别是用于防晒的配制品并且因此优选包含uv光保护过滤剂。

50、因此，本发明的优选配制品是包含以下的那些：

51、至少一种本发明的鞘脂，和

52、至少一种uv光保护过滤剂物质。

53、所使用的uv光保护过滤剂可以是例如能够吸收紫外线照射并且然后以较长波照射例如热的形式重新发射所吸收的能量的有机物质。

54、uvb过滤剂可以是油溶性的或水溶性的。油溶性uvb光保护过滤剂的实例包括：

55、3-亚苄基樟脑及其衍生物，例如3-(4-甲基亚苄基)樟脑，

56、4-氨基苯甲酸衍生物，例如4-(二甲基氨基)苯甲酸2-乙基己基酯和4-(二甲基氨基)苯甲酸戊基酯，

57、肉桂酸的酯，例如4-甲氧基肉桂酸2-乙基己基酯、4-甲氧基肉桂酸异戊基酯、2-氰基-3-苯基肉桂酸2-乙基己基酯(奥克利林(octocrylene))，

58、水杨酸的酯，例如水杨酸2-乙基己基酯、水杨酸4-异丙基苄基酯、水杨酸高薄荷基酯，

59、二苯甲酮的衍生物，例如2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基-4′-甲基二苯甲酮、2，2′-二羟基-4-甲氧基二苯甲酮，

60、亚苄丙二酸的酯，例如4-甲氧基亚苄丙二酸二-2-乙基己基酯，

61、三嗪衍生物，例如2，4,6-三苯胺基-(对-碳-2′-乙基-1′-己基氧基)-1，3，5-三嗪、辛基三嗪酮以及ep 1180359和de 2004/027475中描述的那些，

62、丙烷-1，3-二酮，例如1-(4-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)丙烷-1，3-二酮。

63、合适的水溶性uvb光保护过滤剂包括：

64、2-苯基苯并咪唑-5-磺酸及其碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、烷基铵盐、烷醇铵盐和葡糖铵盐，

65、二苯甲酮的磺酸衍生物，例如2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸及其盐，

66、3-亚苄基樟脑的磺酸衍生物，例如4-(2-氧代-3-亚冰片基甲基)苯磺酸和2-甲基-5-(2-氧代-3-亚冰片基)磺酸及其盐。

67、合适的典型uva光保护过滤剂包括特别是苯甲酰甲烷的衍生物，例如1-(4′-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)丙烷-1,3-二酮或1-苯基-3-(4′-异丙基苯基)丙烷-1，3-二酮。当然也可以使用uv-a过滤剂和uv-b过滤剂的混合物。

68、除了列举的可溶性物质外，不溶性颜料也适用于此目的，即精细分散的金属氧化物或盐，例如二氧化钛、氧化锌、铁氧化物、氧化铝、铈氧化物、锆氧化物、硅酸盐(滑石)、硫酸钡和硬脂酸锌。这里的颗粒应具有小于100nm的平均直径，例如在5和50nm之间，特别是在15和30nm之间。它们可以是球形的，尽管也可以使用椭圆形的或具有以某种其他方式偏离球形的形状的颗粒。一类相对较新的光保护过滤剂是微粉化有机颜料，例如具有＜200nm的粒度的2,2′-亚甲基双{6-(2h-苯并三唑-2-基)-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯酚}，其可作为例如50％水性分散体获得。

69、更多合适的uv光保护过滤剂可以在p.finkel in122，543(1996)的综述中找到。

70、与本发明的配制品相关，所述配制品优选包含亲脂性、疏水性uv光保护过滤剂物质，特别是三嗪衍生物。

71、此处特别优选使用以下uv光保护过滤剂物质作为uv-b过滤剂：2-氰基-3-苯基肉桂酸2-乙基己基酯、2,4-双{[4-(2-乙基己基氧基)-2-羟基]苯基}-6-(4-甲氧基苯基)-1，3，5-三嗪、二辛基丁基氨基三嗪酮、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基-4′-甲基二苯甲酮、2，2′-二羟基-4-甲氧基二苯甲酮、二-2-乙基己基4-甲氧基苯丙二酸酯(di-2-ethylhexyl 4-methoxybenzmalonate)、2,4,6-三-[苯胺基-(对碳-2′-乙基-1′-己基氧基)]-1，3，5-三嗪、2，4-双[5，1(二甲基丙基)苯并噁唑-2-基-(4-苯基)亚氨基]-6-(2-乙基己基)亚氨基-1，3，5-三嗪、2,4-双-{[4-(2-乙基己基氧基)-2-羟基]苯基}-6-(4-甲氧基苯基)-1，3，5-三嗪和2-[4，6-双(2，4-二甲基苯基)-1，3，5-三嗪-2-基]-5-(辛基氧基)苯酚。

72、使用的uv-a过滤剂优选为1-(4′-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)丙烷-1，3-二酮、1-苯基-3-(4′-异丙基苯基)丙烷-1，3-二酮。

73、特别优选的uv-a过滤剂是4-(叔丁基)-4′-甲氧基二苯甲酰基甲烷(cas号70356-09-1)(它由dsm以1789牌号出售以及由merck以商品名9020出售)和根据de 102004027475的羟基二苯甲酮，特别优选2-(4′-二乙基氨基-2′-羟基苯甲酰基)苯甲酸己基酯(也称：氨基二苯甲酮)，可从basf以名称uvinul a plus获得。

74、其他优选的uv过滤剂物质是其他所谓的宽带过滤剂，即吸收uv-a和uv-b照射的过滤剂物质。在该组中，优选使用2，2′-亚甲基双(6-(2h-苯并三唑-2-基)-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯酚)，其可从ciba chemikalien gmbh以商品名m获得，和2-(2h-苯并三唑-2-基)-4-甲基-6-[2-甲基-3-[1，3，3，3-四甲基-1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]二硅氧烷基]丙基]苯酚(cas号：155633-54-8)，其具有inci名称甲酚曲唑三硅氧烷(drometrizoletrisiloxane)。

75、除了上述两组主要uv光保护过滤剂之外，还可以使用抗氧化剂类型的次级光稳定剂，其阻止当uv照射穿透皮肤时引发的光化学反应链。

76、本发明的化妆品配制品包含基于总体配制品优选0.01重量％至15重量％、优选0.05重量％至10重量％、更优选0.1重量％至5重量％的量的量的uv光保护过滤剂。

77、优选地，本发明的化妆品配制品包含两种或更多种不同的uv光保护过滤剂的组合。

78、当uva光保护过滤剂和uvb光保护过滤剂用于本发明的配制品中时，这些过滤剂的重量比优选为1：2至1：4。

79、本发明的配制品可还包含选自下组的至少一种另外组分：

80、润肤剂，

81、乳化剂，

82、增稠剂/粘度调节剂/稳定剂，

83、抗氧化剂，

84、助水溶物(或多元醇)，

85、固体和填料，

86、成膜剂，

87、珠光添加剂，

88、除臭和止汗活性物质，

89、驱虫剂，

90、自美黑剂；

91、防腐剂，

92、调理剂，

93、香料，

94、染料，

95、气味吸收剂，

96、化妆品活性物质，

97、护理添加剂，

98、富脂剂，

99、溶剂。

100、可以用作各个组的示例性代表的物质是本领域技术人员已知的并且例如可以在德国专利申请de 102008001788.4中找到。该专利申请特此作为参考并入并因此构成本公开的一部分。

101、关于其他任选组分和这些组分的使用量，明确参考本领域技术人员已知的相关手册，例如k.schrader，″grundlagen und rezepturen der kosmetika″[fundamentals andformulations of cosmetics]，第2版，第329至341页，hüthig buch verlag heidelberg。

102、每种添加剂的用量由预期用途指导。

103、用于特定应用的典型框架配方是现有技术已知的并且包含在例如特定基础材料和活性成分的制造商的手册中。这些现有的配方通常可以不加改动地采用。但是，当需要进行调整和优化时，可以通过简单的测试以直接的方式执行期望的修改。

104、本发明还提供了一种制备鞘脂的方法，特别是制备本发明的鞘脂的方法，该方法包括以下方法步骤：

105、i)提供第一组分，至少是通式ii的溶性鞘脂

106、

107、其中

108、r2b是h、磷酸胆碱、丝氨酸、乙醇胺或糖，优选糖或h，更优选h，并且

109、xb是ch＝ch、ch2-ch2或ch2-hcoh，优选ch2-hcoh，并且

110、ii)提供第二组分，至少是式r1bcybhcooh的羟基羧酸的分子内环酯，

111、其中

112、r1b是具有2至54个、优选2至30个、更优选2至18个碳原子的烃基，其被至少一个选自-oh和-cooh的基团取代，并且任选地可以被至少一个-o-中断，

113、yb选自-oh和h，并且

114、iii)使该第一组分与该第二组分反应以获得鞘脂，并且任选地

115、iv)纯化该鞘脂。

116、本发明的方法优选的特征在于方法步骤iii)在40℃至95℃、优选50℃至80℃、更优选60℃至70℃的温度范围内进行。

117、本发明还提供了一种制备鞘脂的备选方法，特别是制备本发明的鞘脂的方法，该方法包括以下方法步骤：

118、a)提供第一组分，至少是通式ii的溶性鞘脂

119、

120、其中

121、r2b是h、磷酸胆碱、丝氨酸、乙醇胺或糖，优选糖或h，更优选h，并且

122、xb是ch＝ch、ch2-ch2或ch2-hcoh，优选ch2-hcoh，并且

123、b)提供第二组分，至少是式r1bcybhcooh的羟基羧酸，

124、其中

125、r1b是具有2至54个、优选2至30个、更优选2至18个碳原子的烃基，其被至少一个选自-oh和-cooh的基团取代，并且任选地可以被至少一个-o-中断，

126、yb选自-oh和h，并且

127、c)使用至少一种用于活化该羟基羧酸的偶联剂，使该第一组分与该第二组分反应，以获得该鞘脂，并且任选地

128、d)纯化该鞘脂。

129、本发明的备选方法优选的特征在于在方法步骤c)中，使用的所述偶联剂为选自下组中的至少一种，该组包含以下物质，优选由以下物质组成：二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-环己基-n′-(2′-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐、n-苄基-n′-3′二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、n-乙基碳二亚胺盐酸盐和羰基二咪唑，特别优选二环己基碳二亚胺和二异丙基碳二亚胺。

130、本发明的备选方法优选的特征在于在方法步骤c)中，使用至少一种选自下组的催化剂，该组包含以下，优选由以下组成：n-乙基二异丙基胺、三烷基胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶和羟基苯并三唑，尤其是羟基苯并三唑。

131、本发明的方法优选的特征在于方法步骤c)在40℃至95℃、优选50℃至80℃、更优选55℃至65℃的温度范围内进行。

132、根据本发明优选的方法优选产生上述根据本发明优选的鞘脂。

133、下面的实施例通过示例的方式描述了本发明，而本发明的应用范围从整个说明书和权利要求中是明显的，并不意味着本发明受限于实施例中指定的实施方案。

134、以下附图构成实施例的一部分：

135、图1：uv照射后产生ros

136、图2：uv照射后的dna损伤

137、图3：应用测试配制品两周、四周和八周后ita°增加

138、图4：应用测试配制品两周、四周和八周后l*增加

139、图5：应用测试配制品两周、四周和八周后皮肤粗糙度下降

140、图6：应用测试配制品两周、四周和八周后皮肤密度增加

141、实施例：

142、实施例1：4-羟基丁酰基植物鞘氨醇

143、将植物鞘氨醇和y-丁内酯以1∶1的摩尔比溶解在甲醇中。混合物在65℃反应，直到不能再检测到植物鞘氨醇。冷却至室温得到4-羟基丁酰基植物鞘氨醇晶体，将其抽滤并用1∶1thf/水混合物洗涤。收率>80％，纯度>90％。

144、实施例1b：6-羟基己酰基植物鞘氨醇

145、将植物鞘氨醇和ε-己内酯以1∶1的摩尔比溶解在甲醇中。混合物在65℃反应，直到不能再检测到植物鞘氨醇。冷却至室温得到6-羟基己酰基植物鞘氨醇晶体，将其抽滤并用1∶1thf/水混合物洗涤。收率>80％，纯度>90％。

146、实施例1c(不是根据本发明)：3-羟基丙酰基植物鞘氨醇

147、将植物鞘氨醇和β-丙内酯以1∶1的摩尔比溶解在甲醇中。混合物在65℃反应，直到不能再检测到植物鞘氨醇。冷却至室温得到3-羟基丙酰基植物鞘氨醇晶体，将其抽滤并用1∶1thf/水混合物洗涤。收率>80％，纯度>90％。

148、实施例2：琥珀酰基植物鞘氨醇

149、将植物鞘氨醇和琥珀酸酐以1∶1的摩尔比溶解在甲醇中。混合物在65℃反应，直到不能再检测到植物鞘氨醇。冷却至室温得到琥珀酰基植物鞘氨醇晶体，将其抽滤并用1∶1thf/水混合物洗涤。收率>80％，纯度>90％。

150、实施例3：葡糖酰基植物鞘氨醇

151、将植物鞘氨醇和d-葡萄糖酸内酯以1∶1的摩尔比溶解在甲醇中。混合物在65℃反应，直到不能再检测到植物鞘氨醇。

152、通过逐渐将温度降低至10℃的结晶化进行后处理。

153、产物借助于真空滤出并用乙醇洗涤。干燥至恒定质量后，收率>80％，纯度>90％。

154、实施例4：乳糖酰基植物鞘氨醇

155、将71.66g乳糖酸和75.44g植物鞘氨醇溶解在二甲基甲酰胺(dmf)中。添加2g n-羟基琥珀酰亚胺(hsu)和15ml n，n-二异丙基碳二亚胺(dic)，并且将混合物在60℃下反应2h。添加15ml水并让混合物进一步反应1/2小时，以淬灭残留的dic。对于后处理，蒸馏出二甲基甲酰胺，然后将产物残余物溶解在甲醇中。然后通过缓慢冷却至10℃使产物结晶。滤出由此获得的产物，用甲醇洗涤并干燥。收率>80％，纯度>90％。

156、实施例5：2-羟基-3,3-二甲基-羟基丁酰基植物鞘氨醇

157、将植物鞘氨醇和d-泛酸内酯以1∶1的摩尔比溶解在乙醇中。混合物在60℃反应8h。然后通过缓慢冷却至10℃使产物结晶。然后将产物滤出并干燥。收率>80％，纯度>90％。

158、实施例5b：2-羟基-3,3-二甲基-羟基丁酰基二氢鞘氨醇

159、将二氢鞘氨醇和d-泛酸内酯以1∶1的摩尔比溶解在乙醇中。混合物在60℃反应8h。然后通过缓慢冷却至10℃使产物结晶。然后将产物滤出并干燥。收率>80％，纯度>90％。

160、实施例6：预防uv损伤

161、检测了本发明的物质能够对暴露于uv照射的正常人表皮角质形成细胞(nhek)发挥保护作用的程度。

162、为此，对活性氧物质(ros)的生物标志物进行了相应的研究，用2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯进行定量，并且对dna损伤和修复用彗星试验(comet assay)进行定量。

163、活性氧物质(ros)

164、反应性有机物质(ros)的细胞内形成尤其是导致细胞dna因uv照射而受损的因素。

165、96孔板接种角质形成细胞，在培养基中培养24小时，然后在测定培养基中再培养24小时。然后将培养基替换为含有测试化合物或参考(100μm维生素e和10μm egcg)或不合它们(照射对照)的测试培养基，并将细胞预孵育24小时。预孵育后，去除培养基并更换为测试培养基，加入荧光探针(2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(测试培养基中含有10μm 2,7-dcdhf-da)，并且将细胞在37℃下孵育30分钟。然后用pbs溶液清洗细胞，并在不合化合物或参考的情况下用100mj/cm2 uvb+uva(+0.7j/cm2)照射。使用的灯是带有h2过滤器的sol500太阳模拟器(ag)。照射后，将细胞孵育30分钟。平行进行未照射的对照和没有样品(背景噪声)的条件。

166、所有实验条件一式三份进行。

167、使用(perkinelmer)酶标仪测量荧光发射强度(ex＝485nm，em＝538nm)。

168、代谢的样品(dcf)的荧光强度与ros的形成成比例。因此，ros的产生表示为荧光的相对强度。

169、图1显示了相应的结果。

170、可以看出，人表皮角质形成细胞中活性氧物质(ros)的产生是由uv光照射引起的(对应0％的保护作用)。测试中使用的维生素e和表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)阳性对照已知具有抗uv照射的保护作用，因此显示出30％-40％的抗ros形成的保护作用。本发明所使用的物质随着浓度的增加同样表现出超过40％的显著保护作用。对于鞘脂/神经酰胺而言，以前没有描述这种作用。

171、作为基础，还测试了类鞘氨醇碱植物鞘氨醇(sphingoid base phytosphingosine，ps)。这里没有明显的保护作用。

172、以下实验未在图1中描绘：

173、在上述情况中，2-羟基-3，3-二甲基-羟基丁酰基二氢鞘氨醇在浓度为5μm时显示出22％的保护作用，2-羟基-3，3-二甲基-羟基丁酰基植物鞘氨醇在浓度为5μm时显示出38％的保护作用。

174、在上述情况中，神经酰胺3(也称为神经酰胺np)在浓度为10μm时显示出4％的保护作用，3-羟基丙酰基植物鞘氨醇在浓度为10μm时显示出5％的保护作用。

175、dna损伤与修复

176、将角质形成细胞接种到6孔板中，在培养基中孵育48小时，24小时后补充培养基。然后将培养基替换为含有测试化合物或参考(0.3mm对照)或不合它们(对照)的培养基，并将细胞孵育24小时。预孵育后，去除培养基并再次添加测试培养基，并在不存在化合物的情况下用250mj/cm2uvb+uva(+1.6j/cm2)照射细胞。使用的灯是装有h2过滤器的sol500太阳模拟器(ag)。平行进行未照射的对照条件。所有实验条件均一式两份进行。

177、在照射结束时，丢弃培养物上清液，并在分析前用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。

178、将细胞用胰蛋白酶消化并计数，并且离心后除去上清液。然后将细胞用pbs溶液洗涤并悬浮在相同的pbs溶液中，以达到1×105个细胞/ml的细胞浓度。然后将细胞悬浮液与熔化的(37℃)1％低熔点琼脂糖凝胶混合，并用移液器移至comet显微镜载玻片上(对每种条件进行一式两份分析)。为进行细胞裂解，将显微镜载玻片浸入电泳支持物上新鲜制备的碱性溶液(200mmnaoh，其中含有1mm edta，ph>13)中。凝胶电泳在21伏特下进行30分钟。comet显微镜载玻片用水洗涤两次，每次5分钟，然后用70％乙醇洗涤5分钟，并在37℃风干15分钟。

179、电泳后，每个干燥的样品用dna嵌入荧光染料(sybr green溶液)染色。然后使用自动in cell analyzertm 2200显微镜图像分析仪(ge healthcare)(×10物镜)在落射荧光中观察细胞。在激发(ex 494nm，em524nm)时，结合dna的green发出绿光。在健康细胞中，荧光仅限于类核：未损伤的dna是超螺旋的，因此在电流的影响下不会从类核中大量迁移。如果发生dna损伤，碱处理会导致dna卷起，释放出在暴露于电场时迁移到细胞外的片段。带负电荷的dna迁移到阳极，挤出长度与超螺旋结构的松弛成比例，这是损伤的指标。当采用碱性电泳条件时，尾部和彗星头部之间的dna的分布可用于确定dna损伤的程度。

180、使用opencomet结合imagej软件分析细胞图像。在分析的每个重复样品中，分析了500个事件的最小值。

181、图2显示了相应的结果。

182、用uv光照射人表皮角质形成细胞造成的dna损伤是可辨别的。凭借其已知的抗氧化特性，tiron阳性对照能够保护防止dna损伤，因此在uv照射后显示出大约60％的dna损伤的保护作用。本发明的物质同样显示出超过60％的保护作用。这种作用对于鞘脂/神经酰胺是未知的，并且在该测试中对于纯类鞘氨醇碱植物鞘氨醇(ps)也无法证明这种作用。

183、以下实验未在图2中描绘：

184、在上述情况中，2-羟基-3，3-二甲基-羟基丁酰基二氢鞘氨醇在浓度为5μm时显示出24％的保护作用，2-羟基-3,3-二甲基-羟基丁酰基植物鞘氨醇在浓度为2μm时显示出39％的保护作用。

185、在上述情况中，神经酰胺3(也称为神经酰胺np)在浓度为10μm时显示出12％的保护作用，3-羟基丙酰基植物鞘氨醇在浓度为10μm时显示出13％的保护作用。

186、实施例7：体内数据

187、对于体内研究，招募了24名皮肤受到日晒应激的测试受试者(男性和女性)。为确保皮肤受到日晒应激，本研究在9月至11月期间进行。假设是皮肤在夏季结束时表现出最大程度的日晒应激。

188、测试受试者接受两种不同的测试配制品，他们分别将其应用于一只前臂，或者接受一种测试配制品，将其应用于一只前臂，另一只前臂未处理(对照)。测试配制品是媒剂和含有0.1％的羟基丁酰基植物鞘氨醇(羟基丁酰基ps)的配制品。各种测试组合被随机分配给测试受试者。

189、测试配制品的组成如表1所示。测试受试者每天两次将测试配制品应用到每种情况下一只前臂的内侧和外侧，持续8周。在开始应用之前以及两周、四周和八周后对前臂进行了以下测定：

190、1.颜色测定：使用比色计探头(skin-colorimeter cl 400，courage&khazaka,cologne)测定前臂外侧的参数l*和ita°。l*描述皮肤的黑/白值，ita°描述皮肤色调。当皮肤变得更亮时，这两个值都会增加。

191、2.皮肤粗糙度：该参数是通过前臂内侧的专用相机(visioscan vc 98，courage&khazaka)确定的。该相机记录皮肤的数字黑白图像。图像的灰度分布可以用来确定皮肤粗糙度。

192、3.真皮密度：通过前臂外侧的超声波(skinlab combo，cortex technologies，denmark)确定真皮的密度。为此，专用探头将超声波信号传输到皮肤并记录反射。该反射可用于确定皮肤密度的值。皮肤密度降低尤其表现在非常强烈暴露于阳光下的皮肤区域。

193、

194、表1：测试配制品的组成

195、图3显示了在应用测试配制品两周、四周和八周后ita°的增加。

196、图4显示了在应用测试配制品两周、四周和八周后l*的增加。

197、图xy1和xy2中颜色参数l*和ita°的增加表明在整个测量期间，皮肤变得更亮，与媒剂配制品或未处理的对照相比，在用羟基丁酰基植物鞘氨醇处理的皮肤区域亮度的增加最显著。在这种情况下，这不能归因于皮肤中黑色素的破坏。皮肤晒黑在夏季结束时最为明显，然后由于正常的皮肤再生周期而在秋季消退。羟基丁酰基植物鞘氨醇加强了这个循环，在这种情况下会导致皮肤更快变亮。

198、图5显示了在应用测试配制品两周、四周和八周后皮肤粗糙度的降低。

199、从图5可以看出，与未处理的对照相比，尤其是与媒剂相比，含有羟基丁酰基植物鞘氨醇的测试配制品情况下的皮肤粗糙度降低最为明显。这支持肤色测量结果：受日晒应激的皮肤的特征是皮肤粗糙度增加。由于正常的皮肤再生，这种粗糙度同样会在秋季降低。因为羟基丁酰基植物鞘氨醇有助于皮肤更新周期，所以皮肤粗糙度的降低比媒剂配制品或未处理的对照更明显。

200、图6显示了应用测试配制品两周、四周和八周后皮肤密度的增加。

201、暴露于太阳照射更多的皮肤区域显示皮肤密度降低。皮肤研究的结果表明，与未处理的对照或媒剂相比，使用两周后，羟基丁酰基植物鞘氨醇情况下的皮肤密度已经显著增加。

202、使用6-羟基己酰基植物鞘氨醇(实施例1b)、2-羟基-3，3-二甲基-羟基丁酰基鞘氨醇(实施例5b)、神经酰胺3(也称为神经酰胺np)和3-羟基丙酰基植物鞘氨醇(示例1c)以同样的方式重复进行了实验。

203、

技术实现思路