具有高糖胺聚糖/羟脯氨酸比率的生物材料、组合物、方法和应用

本公开一般涉及一系列新型生物材料，包括但不限于包含糖胺聚糖(gag)组分和细胞外基质(ecm)组分的组合物。特别地，本发明涉及一种具有由可控量的gag组分和ecm组分(如胶原、透明质酸(ha))形成的沉淀的组合物，并且该沉淀具有gag/hyp比率。更具体地，其涉及新型gag固定化生物材料的组合物、材料、制备方法和应用。

背景技术：

1、蛋白聚糖常见于富含gag的组织如髓核、软骨、神经组织、滑液、玻璃体液、心脏瓣膜、肺、肝、皮肤、血管，以及其它组织的ecm中。它们通过硫酸化gag与蛋白聚糖分子的核心蛋白进行结合而形成。gag是一种由有利于保水的富有负电荷的二糖链构成的多糖。因此，gag可以结合大量的水，维持水合作用，并在富含gag的组织中充当空间保持物。

2、在天然富含gag的组织中，gag与透明质酸(ha)形成较大的“瓶刷”，如蛋白聚糖聚集体，并且蛋白聚糖聚集体分布在胶原网络中。监测富含gag的组织的正常功能的一个关键参数是gag/羟脯氨酸(hyp，代表胶原)比率，即富含gag的基质与胶原网络的相对丰度。gag/hyp比率是富含gag的组织(如椎间盘、软骨及其它组织)的质量的良好指标。由于gag在组织功能中的重要性，开发出具有高gag含量的组织工程支架来模拟天然组织的组成、结构和功能对于富含gag的组织工程很有价值。然而，由于gag是高度可溶于水的高度亲水性多糖链，因此难以使gag在体外固定化并维持在固体胶原网络中。

技术实现思路

0、发明概述

1、本文提供了衍生自ecm组分的一系列富含gag的生物材料的组合物，包括但不限于ha、胶原和gag。本发明涉及一种可控gag组合物，例如胺化胶原-胺化ha-gag(acol-aha-gag)和相关联的生物材料。这种类型的生物材料可以通过化学修饰胶原和ha，并使它们与gag(优选地阴离子gag)反应来制造，从而产生具有可控且合适的gag/hyp比率的复杂ecm结构，该结构极其适于模拟天然组织基质或细胞培养等。沉淀(特定的共沉淀)可以呈纳米级“珠粒”状和“瓶刷”状超微结构，并且具有良好的生物相容性，且在结构和功能上模拟天然富含gag的组织，如青年成人髓核(np)、软骨以及其它组织。

2、在一些实施方案中，已经开发出一系列新型生物材料，即具有极高且可控gag/hyp比率的胺化胶原-胺化ha-gag(acol-aha-gag)和相关联结构，其在结构和功能上模拟了富含gag的天然组织(如椎间盘的np和软骨)的特征。富含gag的组合物通过对细胞外基质(ecm)胺化修饰以及胺化ecm组分与阴离子gag组装形成共沉淀而产生。通过使化学修饰的胺化部分与带负电荷的gag部分进行反应，可以形成具有可控的gag/hyp比率、仿生组成和结构特征以及良好的生物相容性的acol-aha-gag。该组合物以受控方式显示出高密度gag，具有生理相关的仿生超微结构、良好的生物相容性、生物力学特性和功能，如折减弹性模量和补液功能。因此，所述组合物对于生物医学应用是理想的，包括但不限于用于富含gag的组织(如髓核、软骨以及其它组织)的生物分子、细胞和组织工程疗法的3d培养基质、递送装置和支架。

3、该组合物使用包括一种或多种ecm组分和化学修饰试剂的制剂。在优选的实施方案中，ecm组分能够为细胞提供支持并与细胞相互作用，允许细胞迁移和渗透，并有利于蛋白聚糖复合物结构的形成，是ha、胶原、gag、或其它支持细胞生长和迁移并支持gag连接和固定的材料，如纤粘蛋白、层粘连蛋白、核心蛋白、连接蛋白，以及肽，包括但不限于自组装肽(sam)和合成肽序列，如ecm组分的功能表位，包括但不限于arg-gly-asp(rgd)肽、arg-gly-asp-ser(rgds)、纤连蛋白的gly-arg-gly-asp-ser-pro(grgdsp)、胶原的gly-phe-吡咯赖氨酸-gly-glu-arg(gfoger)，以及层粘连蛋白的ile-lys-val-ala-val(ikvav)。这些ecm组分可以通过胺化化学修饰而被修饰成控制表面电荷的密度。这些经修饰胺化ecm组分和gag能够以自组装的共沉淀导致生物材料的物理特性(如体积、超微结构、形态、ecm密度、gag/hyp比率、gag保留能力、机械特性和稳定性)变化的方式相互作用，从而模仿天然富含gag的组织。

4、组合物可以通过化学修饰来制造，其包括在特定胺化试剂、ph、摩尔比、浓度、温度、交联剂、交联剂浓度和反应时间中暴露如ha或胶原的物类而与胺化试剂反应。所用胺化试剂为含有氨基的化学物质，如乙二胺(eda)、三(2-氨基乙基)胺(taea)、l-精氨酸、二甲双胍，以及多胺等。所用交联剂包括1-乙基-3(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc)的di水，以及edc/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲溶液。使ecm、胺化试剂和交联剂充分混合。此外，未反应的胺化化学物质可以通过但不限于透析来移除。在移除未反应的化学物质后，收集胺化ecm。

5、组合物可以通过混合各组分、涡旋和离心来制造。富含gag的共沉淀可以通过不同的胺化ecm混合物来制造。ecm组分的表面电荷密度取决于胺化过程期间的胺化试剂浓度，且与较高浓度胺化试剂反应的ecm组分具有较高的gag引入。共沉淀的尺寸、gag保留特性，以及机械特性可以通过混合物的组成、组分的比率和浓度、表面电荷密度、ph和涡旋速度等进行控制。

6、该组合物衍生自ecm、ha、胶原和gag，以支持细胞存活、增殖、和/或分化。在实施方案中，沉淀的gag/hyp比率较高并且可控制在1:1至100:1、或1:1至50:1的范围内。而且，共沉淀显示出高gag保留能力(例如7天内10％-40％)，解决了从固体网络中快速gag洗脱的问题。共沉淀显示出sem中的纳米级“珠粒”状结构，以及tem中的“瓶刷”状结构，在结构上高度模拟了天然富含gag的组织，如天然np。共沉淀还显示出良好的生物相容性、高细胞活力(>93％)、在蛋白质和基因水平上细胞表型的维持，以及与天然np相当的机械特性。此外，共沉淀促进干细胞分化为软骨和np样谱系，通过gag-水相互作用维持支架体积，模拟天然软骨和np的细胞周基质，增强成软骨标记和成椎间盘标记的基因表达。最后但并非最不重要的一点是，共沉淀在体内显示出能够与天然细胞和组织成一体的良好生物相容性，并维持高gag含量。此外，新型生物材料还有利于和促进干细胞如骨髓间充质干细胞向谱系(包括但不限于成软骨和椎间盘谱系)的多重分化潜能。

7、概括地说，该新型组合物由高密度gag组成。该组合物显示出显著较高的gag引入和保留、具有纳米级gag“珠粒”状和“瓶刷”状结构的仿生超微结构、良好的生物相容性，以及细胞表型维持，在结构和功能上高度仿生天然富含gag的组织。此外，它还促进干细胞分化(如成软骨和成椎间盘)，通过gag-水相互作用维持支架体积，模拟天然组织(如软骨、np、神经组织、滑液、玻璃体液、心脏瓣膜、肺、肝、皮肤和血管)的细胞周基质的超微结构，增强组织特异性基因表达(如成软骨和成椎间盘标记)，良好的体内生物相容性，并且在至少一个月内在体内维持高gag含量，表明了其潜在应用如用于富含gag的组织再生的支架。

8、在本发明的一个方面，提供了一种组合物，该组合物包含糖胺聚糖组分，以及与糖胺聚糖组分形成沉淀的一种或多种细胞外基质(ecm)组分，其中沉淀具有约1:10至约100:1的糖胺聚糖与羟脯氨酸的比率。

9、在一些实施方案中，一种或多种ecm组分选自胶原、透明质酸、纤连蛋白、层粘连蛋白、核心蛋白、连接蛋白、肽、它们的衍生物、它们的盐，以及它们的组合。在一个具体实施方案中，一种或多种ecm组分包含核心蛋白、连接蛋白、肽例如自组装肽(sam)、合成肽、ecm组分的功能表位。ecm组分的功能表位可选自arg-gly-asp(rgd)肽、arg-gly-asp-ser(rgds)、纤连蛋白的gly-arg-gly-asp-ser-pro(grgdsp)、胶原的gly-phe-吡咯赖氨酸-gly-glu-arg(gfoger)、层粘连蛋白的ile-lys-val-ala-val(ikvav)或它们的组合。

10、在一些实施方案中，一种或多种ecm组分包含胶原、透明质酸、它们的衍生物、和/或它们的盐，并且至少一种细胞外基质组分具有与糖胺聚糖组分反应形成沉淀的官能团。

11、在一些实施方案中，糖胺聚糖组分选自硫酸化糖胺聚糖、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、它们的衍生物、或它们的组合。

12、在一些实施方案中，一种或多种ecm组分具有用于与糖胺聚糖组分反应形成沉淀的一个或多个氨基基团，并且一种或多种ecm组分带正电或呈中性。

13、在一些实施方案中，ecm组分包含胺化胶原、和/或胺化透明质酸，优选地包含胺化胶原和胺化透明质酸两者。在胶原和/或ha胺化的实施方案中，其通过选自乙二胺(eda)、三(2-氨基乙基)胺(taea)、l-精氨酸、二甲双胍、或多胺的胺化试剂胺化，并且优选地胺化试剂是乙二胺或三(2-氨基乙基)胺。

14、在一些实施方案中，沉淀包含acol(eda)-gag、acol(taea)-gag、acol(eda)-aha-gag、或acol(taea)-aha-gag。

15、羟脯氨酸(hyp)是胶原的标记。在一些实施方案中，沉淀具有1:1至100:1、1:1至50:1，优选地5:1或27:1的糖胺聚糖与羟脯氨酸(gag/hyp)的比率。在实施方案中，沉淀具有1:1至90:1、1:1:至80:1、1:1至70:1、1:1至60:1、1:1至50:1、1:1至40:1、1:1至30:1、1:1至20:1、1:1至10:1、或1:1至5:1的gag/hyp比率。在一些实施方案中，沉淀具有约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1的gag/hyp比率。

16、在一个实施方案中，沉淀具有1:1至10:1的gag/hyp比率，其适于分化间充质干细胞(msc)。在另一个实施方案中，沉淀的gag/hyp比率为约5:1，用于创建适于msc分化成软骨细胞或促进成软骨分化的环境；或者沉淀的gag/hyp比率为约7:1，用于创建适于msc的椎间盘源性分化，或促进干细胞的椎间盘源性分化(即分化为髓核(npc))的环境。组合物中组分的量可以根据各种应用而改变，例如，目的是模拟具有所期望gag/hyp比率的天然组织基质。这在治疗患有组织障碍的受试者的应用中特别有利。

17、在一些实施方案中，沉淀显示1至100天内，优选地至少7天内的gag保留为1％至99％，优选地50％。

18、在一些实施方案中，沉淀呈较小纳米级“珠粒”状结构、微尺度聚集、或“瓶刷”状结构的形式。沉淀可以模拟天然组织基质。

19、在一些实施方案中，沉淀在体外细胞活力方面具有50％至99％、70至99％、或95％范围内的生物相容性。

20、在一些实施方案中，沉淀促进并维持细胞表型，支持细胞存活和细胞增殖，和/或模拟天然富含gag的组织的机械特性。

21、在一些实施方案中，沉淀能够增强成软骨标记如col2、acan和sox9的基因表达，和/或成椎间盘标记如pax1和foxf1的基因表达。

22、在一些实施方案中，沉淀具有用于与天然细胞和组织成一体的体内生物相容性。

23、在一些实施方案中，沉淀能够在体外或体内在1天至100天范围内维持高gag含量。

24、在本发明的另一方面，提供了一种制备如本文所述的组合物的方法。该方法包括以下步骤：

25、(i)提供一种或多种ecm组分，任选地一种或多种ecm组分通过如上所述的胺化试剂胺化；

26、(ii)任选地通过透析纯化一种或多种ecm组分；

27、(iii)提供一种或多种ecm组分的水溶液；

28、(iv)将步骤(iii)的水溶液与糖胺聚糖组分混合以形成沉淀，任选地随后摇动或涡旋；以及

29、(v)收集沉淀；

30、其中沉淀具有约1:10至约100:1的糖胺聚糖与羟脯氨酸比率。

31、在一些实施方案中，胺化试剂是包含至少两个伯氨基的阳离子化学物质。

32、在一些实施方案中，胺化试剂为乙二胺(eda)、三(2-氨基乙基)胺(taea)、l-精氨酸、二甲双胍、多胺、或它们的组合。

33、在另一个方面，提供了一种在受试者中治疗组织障碍的方法，该方法包括向受试者施用如本文所公开的组合物，其中组合物充当用于植入到受试者的富gag组织中的溶胀剂和/或体积填充剂。

34、在一些实施方案中，富含gag的组织是髓核(np)或软骨。

35、在又一方面，提供了一种培养具有丰富gag的组织的方法。该方法包括提供如本文所公开的组合物作为基质、无细胞支架或细胞微载体的步骤。该组合物可用于3d培养以维持天然组织中实质细胞的生理相关表型。

36、在一些实施方案中，组织是髓核(np)或软骨。

37、在一些实施方案中，实质细胞是软骨中的软骨细胞。

38、在一些实施方案中，实质细胞是np中的髓核细胞(npc)。

39、在本发明的另一方面，提供了一种包含如本文所公开的组合物的装置。在一个实施方案中，该装置还包含干细胞、或从软骨、骨和髓核分离的细胞。