用于抑制血管紧张素转化酶2(ACE2)和/或TMPRSS2表达的组合物的制作方法

本公开涉及用于抑制血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2(transmembraneprotease,serine 2)表达的组合物。

背景技术：

1、新型冠状病毒(sars-cov2)所引起的感染性疾病(covid-19)的发病会引起被称为细胞因子风暴的过度炎症反应。迄今为止的研究成果提示sars-cov2与其说是感染所有细胞，不如说是特异性地感染在细胞表面表达血管紧张素转化酶2(ace2)的细胞。进而，最近也相继出现了通过tmprss2(transmembrane protease,serine2)这种蛋白分解酶，存在于sars-cov2表面的刺突蛋白(spike protein)被切断而感染力进一步提高等报告。在非专利文献1中，总结了迄今为止关于sars-cov2的见解。

2、现有技术文献

3、非专利文献

4、非专利文献1：

5、https://www.nature.com/articles/d41586-020-00502-w

技术实现思路

1、发明要解决的课题

2、随着sars-cov2感染的扩大，全世界期待对sars-cov2的治疗法及预防法的开发。众所周知，sars-cov2经由ace2感染，对该ace2的中和抗体的制作等正在迅速进行，但至今还没有达到实用化。因此，本公开的目的在于提供与covid-19的治疗、预防有关的用于抑制ace2和/或tmprss2的基因表达量(mrna量)的组合物。

3、用于解决课题的手段

4、发明人进行了深入研究，发现通过调节foxo1的信号通路，使ace2和tmprss2的mrna量减少。具体而言，发现通过用直接作用于foxo1的抑制剂、直接作用于存在于foxo1上游的pdk1的抑制剂、胰岛素类化合物(其是受体的配体，在下游通过信号通路影响foxo1)、生长因子(其是受体的配体，在下游通过信号通路影响foxo1)等处理，ace2和/或tmprss2的表达量发生显著变化。

5、进而，发现上述ace2和/或tmprss2的表达量减少与新型冠状病毒的刺突蛋白向细胞内进入的减少有关。

6、本公开的发明是基于上述见解完成的，在一个方面中，包括以下发明。

7、(发明1)

8、用于抑制血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2表达的组合物，其中，

9、所述组合物含有foxo1抑制剂。

10、(发明2)

11、发明1的组合物，其中所述foxo1抑制剂是由下式表示的化合物或其盐，

12、[化学式1]

13、

14、{其中，

15、r1是nh或ch2，

16、r2是n-r8或ch-r8(r8：c1～c3烷基)，

17、r3是f、cl、br或i，

18、r4分别独立是h或ch3，

19、r5是s或o，

20、r6是羧基，

21、r7是nh2或ch3，

22、n是1～11。

23、}

24、(发明3)

25、发明1的组合物，其中所述抑制剂是由下式表示的化合物或其盐，

26、[化学式2]

27、

28、{其中，

29、r1是nh，

30、r2是n-r8(r8：c1～c3烷基)，

31、r3是f、cl、br或i，

32、r4分别独立是h或ch3，

33、r5是o，

34、r6是羧基，

35、r7是nh2，

36、n是1～11。

37、}

38、(发明4)

39、发明1的组合物，其中所述抑制剂是as1842856或as1708727。

40、(发明5)

41、发明1的组合物，其中所述foxo1抑制剂是胰岛素类化合物。

42、(发明6)

43、发明5的组合物，其中所述胰岛素类化合物是野生型胰岛素。

44、(发明7)

45、发明5的组合物，其中所述胰岛素类化合物是改变型胰岛素。

46、(发明8)

47、发明7的组合物，其中所述改变型胰岛素是选自超短效型胰岛素、短效型胰岛素、中效型胰岛素、长效型溶解性胰岛素、混合型胰岛素及预混溶解性胰岛素中的一种以上。

48、(发明9)

49、发明7的组合物，其中所述改变型胰岛素具有与人野生型胰岛素90％以上同一性的氨基酸序列。

50、(发明10)

51、发明7的组合物，其中所述改变型胰岛素具有与人野生型胰岛素95％以上同一性的氨基酸序列。

52、(发明11)

53、发明9或10的组合物，其中所述改变型胰岛素的a链具有与人野生型胰岛素的a链100％同一性的氨基酸序列。

54、(发明12)

55、发明1的组合物，其中所述foxo1抑制剂是生长因子和/或编码它的核酸。

56、(发明13)

57、发明12的组合物，其中所述生长因子具有与选自以下任一种90％以上同一性的氨基酸序列：

58、igf1、igf2、egf、fgf2、fgf14、vegf、hgf。

59、(发明14)

60、发明13的组合物，其中所述生长因子具有与选自以下任一种95％以上同一性的氨基酸序列：

61、igf1、igf2、egf、fgf2、fgf14、vegf、hgf。

62、(发明15)

63、发明14的组合物，其中所述生长因子具有与选自以下任一种100％以上同一性的氨基酸序列：

64、igf1、igf2、egf、fgf2、fgf14、vegf、hgf。

65、(发明16)

66、发明1的组合物，其中所述foxo1抑制剂是foxo1作用型抑制剂。

67、(发明17)

68、发明1的组合物，其中所述foxo1抑制剂是pi3k/pdk1/akt作用型抑制剂。

69、(发明18)

70、发明1的组合物，其中所述foxo1抑制剂是foxo1的基因表达抑制剂。

71、(发明19)

72、发明1～18中任一种所述的组合物，其是用于预防或治疗冠状病毒感染性疾病的组合物(糖尿病患者作为施用对象除外)。

73、(发明20)

74、用于预防或治疗冠状病毒感染性疾病的组合物，其含有foxo1抑制剂(糖尿病患者作为施用对象除外)。

75、发明效果

76、本公开的组合物含有foxo1抑制剂。由此，可以使ace2和/或tmprss2基因的表达量减少。

77、附图简单说明

78、[图1]是添加叉头(forkhead)型转录因子foxo1抑制剂as1842856(在图下示出浓度)后的ace2和tmprss2基因在hepg2细胞中的相对表达量的图。此外，其是foxo1诱导ace2和tmprss2基因表达的机制的示意图。

79、[图2]是在作为sars-cov2表面蛋白的刺突蛋白中的ace2结合域(rbd)的重组蛋白(rbd-mfc)向细胞内进入分析的示意图。在rbd中融合有来自小鼠igg的fc序列(mfc)，通过使用识别小鼠igg的荧光标记抗体(例如，alexa fluor(r)488抗体)的免疫染色法，可以定量进入细胞内的rbd的量。

80、[图3]是在作为sars-cov2表面蛋白的刺突蛋白中的ace2结合域(rbd)的重组蛋白(rbd-mfc)向hepg2细胞内进入的分析中，实际进入的rbd蛋白的典型的显微镜图像。

81、[图4]是使用流式细胞仪，对进入的rbd蛋白的重组蛋白(rbd-mfc)进行定量，并将平均荧光强度相对化的图。

82、[图5]是表示通过叉头型转录因子foxo1抑制剂as1842856的ace2和/或tmprss2的表达抑制和与刺突蛋白的结合·进入抑制的关系的示意图。

83、[图6]是添加野生型胰岛素的ace2和tmprss2基因在hepg2细胞中的相对表达量的图。

84、[图7]是添加改变型胰岛素的ace2和tmprss2基因在hepg2细胞中的相对表达量的图。

85、[图8]是使用流式细胞仪，对进入的s1和rbd蛋白进行定量，并将平均荧光强度相对化的图。

86、[图9]是表示胰岛素导致的ace2和/或tmprss2的表达抑制和与刺突蛋白的结合·进入抑制的关系的示意图。

87、[图10]是添加各种生长因子的ace2和tmprss2基因在hepg2细胞中的相对表达量的图。

88、[图11]是添加hgf的ace2和tmprss2基因在hepg2细胞中的相对表达量的图。

89、[图12]是添加sirna的ace2和tmprss2基因在hepg2细胞中的相对表达量的图。

90、发明的具体实施方式

91、以下，对用于实施本公开的发明的具体实施方式进行说明。以下的说明用于促进对发明的理解。即，并不意图限定本发明的范围。

92、1.定义

93、本说明书中记载的术语“用于抑制血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2的表达”包括改善与ace2和/或tmprss2相关的特定疾病的目的。进而，该术语并不限于治疗目的。例如，该术语包括即使没有特定疾病也预防该疾病的发生的目的。

94、本说明书中记载的术语“foxo1抑制剂”具有广义和狭义的含义，只要没有特别说明，以前者的含义进行解释。

95、在狭义的含义的情况下，上述术语是指与foxo1直接结合而作用的抑制剂(在本说明书中，在狭义的含义的情况下，也称为“foxo1作用型抑制剂”)。另一方面，在广义的含义的情况下，上述术语是指直接或间接作用于foxo1而抑制foxo1的作为转录因子的活性的抑制剂。在间接作用的情况下，上述术语包括作用于foxo1上游信号通路的抑制剂。作为一个例子，可以举出直接作用于foxo1上游的akt或pdk1而使其活化的药剂。作为另一个例子，可以举出影响foxo1活性的(更具体而言，成为抑制foxo1活性的信号通路的触发剂)受体的配体。作为受体，可以举出胰岛素受体、生长因子受体等。换言之，上述术语包括胰岛素受体的配体、生长因子受体的配体。另外，在广义的含义的情况下，上述术语进一步包括抑制“foxo1”自身表达的物质。作为典型的例子，包括核酸，例如可以举出反义核酸、shrna、sirna、mirna等。

96、具体而言，其是关于“抑制foxo1的作为转录因子的活性”这一言语的定义，这可以通过本领域公知的分析方法进行判别。例如，实施使用了已知与foxo1结合的共有序列(gtaaa(t/c)aa)的荧光素酶分析，基于荧光强度等是否产生显著差别来进行判别。或者，也可以使用市售的elisa型活性检测分析(active motif公司，transamrfkhr(foxo1)，产品编号：46396)等。在任何实验条件的情况下，将如下试验物质作为“抑制foxo1的作为转录因子的活性”的物质来定义，上述试验物质与添加了水、或作为溶剂使用的溶液(dmso等)的作为对照条件下的foxo1的活性指标的值比较，通过添加试验物质能够将指标的平均值抑制在60％以下。

97、2.所使用的用于抑制血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2的表达量的组合物

98、在一个实施方式中，本公开涉及一种组合物，其是用于抑制血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2表达的组合物，所述组合物含有foxo1抑制剂。

99、在另一个实施方式中，以下任一种作为foxo1抑制剂可以作为有效成分包含在上述组合物中。在另一方面，本公开涉及它们任一种以上有效成分用于制备医药组合物的应用。

100、·胰岛素类化合物

101、·生长因子或编码它的核酸

102、·foxo1作用型抑制剂和/或pi3k/pdk1/akt作用型抑制剂

103、·foxo1的基因表达抑制剂

104、以下，对各抑制剂进行详细说明。

105、2-1.使用了胰岛素类化合物的用于抑制血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2的表达量的组合物

106、在一个实施方式中，这种组合物含有胰岛素类化合物(例如，人胰岛素)。由此，ace2和/或tmprss2的基因的转录被抑制，mrna量减少。

107、另外，本说明书中记载的“胰岛素类化合物”是指在细胞内部将胰岛素信号传递通路活化的药剂。因此，本说明书中记载的“胰岛素类化合物”不仅包括在人活体内表达的所谓“野生型胰岛素”，还可以包括使用基因改变技术制备的“改变型胰岛素”，进而，还可以包括在生物体内作用于胰脏的β细胞而促进胰岛素表达的药剂。优选的“胰岛素类化合物”是野生型胰岛素或改变型胰岛素。作为改变型胰岛素的例子，可以举出超短效型胰岛素、短效型胰岛素、中效型胰岛素、长效型溶解胰岛素、混合型胰岛素、预混(配制)溶解性胰岛素。

108、另外，改变型胰岛素也可以具有与人野生型胰岛素一定程度同一性的氨基酸序列。例如，90％以上，优选95％以上(例如，利用blastp等判定的同一性)。此外，野生型胰岛素是a链和b链的异二聚体。因此，这里所述的同一性是指将a链和b链连接起来作为一个氨基酸序列进行比较时的同一性。更优选地，改变型胰岛素的a链具有与人野生型胰岛素的a链100％同一性的氨基酸序列。

109、胰岛素作为抑制血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2基因转录的因子而作用。因此，通过添加胰岛素，可以抑制这些基因的表达。由此，可以减少病毒利用刺突蛋白进入细胞内。

110、2-2.使用了生长因子的用于抑制血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2的表达量的组合物

111、在一个实施方式中，组合物含有生长因子。由此，ace2和/或tmprss2的基因的转录被抑制，mrna量减少。

112、本说明书中记载的术语“生长因子”是指满足所有以下条件的物质。

113、·至少部分含有肽或蛋白

114、·抑制细胞内的foxo1的转录因子的活性

115、关于上述“至少部分含有肽或蛋白”，肽或蛋白可以是天然存在的，也可以是人工产生的。例如，也包括对天然存在的蛋白或肽进行了化学修饰的物质。肽或蛋白不仅可以是单体形态，还可以是二聚体以上的形态。肽或蛋白可以是例如环状的，而不是直链上的。另外，在为二聚体以上的形态的情况下，也可以适当地设置人工接头。例如，根据kenichiroito等人(nat commun.2015 mar 11；6:6373.doi:10.1038/ncomms7373.)的论文，报道称具有用接头将两个环状氨基酸序列结合的独特结构的物质作为hgf受体的激动剂发挥功能。

116、在本技术的申请日之后，也可以开发以往不存在的各种类型的新的生长因子受体的激动剂，但只要满足上述的条件，这种生长因子受体的激动剂也包括在本说明书中记载的术语“生长因子”中。

117、另外，关于生长因子的种(species)没有特别限定，优选是人型。

118、虽没有限定，但作为生长因子的一个例子，可以举出以下任一种以上：igf1、igf2、egf、fgf2、fgf14、vegf、hgf。

119、进而，其它生长因子可以具有与上述举出的任一种一定程度同一性的氨基酸序列。例如，90％以上，优选95％以上，最优选100％(例如，利用blastp等判定的同一性)。

120、进而，报道称对于上述hgf已开发了使用环状肽的替代肽(https://www.nature.com/articles/ncomms7373)，具有与hgf的功能相同的功能。这样的替代生长因子功能而被开发的中～高分子化合物也可以充分用于本次的目的。

121、另外，除了包含上述生长因子之外，或者替代上述生长因子，也可以在组合物中配制编码上述生长因子(也包括上述的具有同一性的氨基酸序列的物质)的核酸。核酸可以是dna，并且也可以是rna(例如，mrna)。优选地，本公开的组合物可以含有任意形态的上述dna。例如，上述dna的包被区可以整合到质粒、载体等中。这些核酸最终产生生长因子，通过上述作用，ace2和/或tmprss2基因的转录被抑制，mrna量减少。

122、2-3.使用了foxo1作用型抑制剂和/或pi3k/pdk1/akt作用型抑制剂的用于抑制血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2的表达量的组合物

123、在一个实施方式中，组合物含有foxo1作用型抑制剂和/或pi3k/pdk1/akt作用型抑制剂。由此，ace2和/或tmprss2的基因的转录被抑制，mrna量减少。

124、关于本说明书中记载的术语“foxo1作用型抑制剂”的含义，如上述的狭义的“foxo1抑制剂”中说明的一样。另外，本说明书中记载的术语“pi3k/pdk1/akt作用型抑制剂”是指满足所有以下三个条件的物质。

125、·透过细胞膜而增加细胞内的pip3和/或直接作用于pi3k、pdk1、akt中的至少任一种

126、·作用的结果是改变pi3k、pdk1及akt中的至少任一种的活性

127、·改变活性的结果是抑制细胞内的foxo1的转录因子的活性

128、因此，为了避免语病而进行补充的话，术语“pi3k/pdk1/akt作用型抑制剂”虽然称为“抑制剂”，但是指对pi3k/pdk1/akt示出活化作用的物质。并且，结果以抑制foxo1的活性的含义来称为“抑制剂”。

129、此外，关于是否抑制foxo1的转录因子的活性，如上述“1.定义”中所述，可以通过所需的分析进行判别。

130、pip3是由以受体和配体的结合为触发的信号生成的第二信使。通过pi3k生成pip3。所生成的pip3使pdk1活化。另外，被活化的pdk1使akt活化。被活化的akt抑制foxo1的活性。因此，通过增加细胞内的pip3和/或直接作用于pi3k、pdk1、akt中的至少任一种而使其活化，可以抑制foxo1的作为转录因子的活性。由此，ace2和/或tmprss2的基因的转录被抑制，mrna量减少。

131、另外，如果是直接抑制性地作用于foxo1的情况，则通过该作用，ace2和/或tmprss2的基因的转录被抑制，mrna量减少。

132、从这种观点出发，foxo1作用型抑制剂和/或pi3k/pdk1/akt作用型抑制剂优选分别如下作用。

133、·对foxo1抑制活性的作用

134、·增加pip3的作用

135、·对pi3k、pdk1、akt中的至少任一种促进活性的作用

136、在优选的实施方式中，作为具有对foxo1抑制活性的作用的药剂，例如可以举出由下式表示的化合物或其盐。

137、[化学式3]

138、

139、{其中，

140、r1是nh或ch2，

141、r2是n-r8或ch-r8(r8：c1～c3烷基)，

142、r3是f、cl、br或i，

143、r4分别独立是h或ch3，

144、r5是s或o，

145、r6是羧基，

146、r7是nh2或ch3，

147、n是1～11。

148、}

149、进而，在优选的实施方式中，作为与foxo1直接结合而抑制的药剂的例子，可以举出由下式表示的化合物或其盐。

150、[化学式4]

151、

152、{其中，

153、r1是nh，

154、r2是n-r8(r8：c1～c3烷基)，

155、r3是f、cl、br或i，

156、r4分别独立是h或ch3，

157、r5是o，

158、r6是羧基，

159、r7是nh2，

160、n是1～11。

161、}

162、作为由上述式表示的化合物或其盐的具体例，可以举出as1842856(casno.836620-48-5)。

163、[化学式5]

164、

165、除了as1842856以外，作为具有对foxo1抑制活性的作用的药剂的例子，可以举出as1708727。

166、另外，作为具有对foxo1抑制活性的作用的药剂，可以举出由kis-154、查耳酮类、三萜类、黄酮类、类单萜类、木脂素类、香豆素类及植物化学成分类组成的foxo1活性抑制剂(再表2018/079715)等。

167、作为具体例，如再表2018/079715的0066和0067所述。例如，可以举出以下的化合物。

168、络石苷元(tranchelogenin)、β-萘黄酮(β-naphthoflavone)、6,7-二羟基黄酮(6,7-dihydroxyflavone)、3,4-二氢香豆素(3,4-dihydrocoumarin)、2-叔丁基对苯醌(2-tert-butyl-p-quinone)、苦杏苷(amarogentin)、(±)异薄荷酮(isomenthone)、皂草苷(saponarin)、4-羟基查耳酮(4-hydroxychalcone)、反式查耳酮(trans-chalcone)、2,3-二甲氧基-2'-羟基查耳酮(2,3-dimethoxy-2'-hydroxychalcone)、科罗索酸(corosolicacid)、6-甲基黄酮(6-methylflavone)、5-甲氧基黄酮(5-methyoxyflavone)、7,8-二羟基黄酮(7,8-dihydroxyflavone)、依普黄酮(ipriflavone)、白杨素(chrysin)、肠二醇(enterodiol)。

169、另一方面，作为具有对pi3k/pdk1/akt促进活性的作用的药剂，例如可以举出以下化合物。

170、vo-ohpic三水合物

171、sf1670

172、bpv(hopic)

173、已知这些化合物通过抑制与pi3k作用相反的pten，具有间接地对pi3k/pdk1/akt促进活性的效果。

174、2-4.使用了foxo1基因表达抑制剂的用于抑制血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2的表达量的组合物

175、在一个实施方式中，组合物含有foxo1基因表达抑制剂。由此，foxo1自身的表达量减少。从而，ace2和/或tmprss2基因的转录减少，mrna量减少。典型地，作为foxo1基因表达抑制剂的例子，可以举出使用了sirna(small interference rna)或mirna(microrna)等的foxo1基因表达的抑制。

176、3.用途

177、在一个实施方式中，本公开的组合物可以利用于血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2所参与的疾病的治疗和/或预防。具体而言，可以利用于它们所参与的感染性疾病的治疗和/或预防。作为感染性疾病的例子，可以举出冠状病毒感染性疾病，例如由sars-cov或sars-cov2等病毒引起的感染性疾病。优选为由sars-cov2引起的感染性疾病(covid19)。这些病毒使自身的刺突蛋白结合到人细胞的ace2受体，并以此为立足点侵入细胞内。另外，sars-cov2与人细胞表面的ace2结合后，通过人细胞的tmprss2的酶处理，向细胞内的侵入效率增强。因此，通过抑制ace2和/或tmprss2的表达，可以抑制这种病毒引起的细胞侵入。由此可以抑制感染。

178、这种方法的优点在于不易受到病毒侧变异的影响。一般以sars-cv2为首的rna型病毒容易引起变异。而且，病毒表面的蛋白(例如，刺突蛋白)虽然被作为疫苗的靶点，但由于该蛋白发生变异，存在疫苗的效果被回避的问题。然而，该方法在不易受到变异的直接影响的方面上是有利的。

179、另外，需要特别说明的是，本公开的组合物不仅可以治疗感染，还可以有助于预防感染。例如，在感染的治疗中，有基于抗炎症作用等的方法，但由于这样的方法成为感染发生后的处理方法，所以无法有助于预防。然而，本公开的组合物从即使一旦发生感染而病毒增殖后也防止进一步感染其他细胞的含义上，还可以用作治疗药。但是，不仅如此，从即使处于感染前的状态下，通过预先施用，抑制病毒感染时成为立足点的基因的表达，从而也防止感染细胞的含义上，还可以用作预防药。

180、因此，在一个实施方式中，根据施用方式，本公开的组合物可以配制适当的附加成分。例如，本公开的组合物可以包含医药品中通常含有的成分。作为该成分的例子，可以举出保存剂、防腐剂、香料、ph调节剂、抗氧化剂、防霉剂、赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂等。

181、在优选的实施方式中，对于本说明书中记载的foxo1抑制剂而言，不包括对于糖尿病患者的施用。

182、实施例

183、4.实施例

184、4-1.实施例1(hepg2细胞的培养)

185、hepg2细胞购自atcc(注册商标)(american type culture collection，hb-8065)。该细胞使用dmem(sigma，d8900)+10％fbs(sigma，f7524)的血清培养基进行传代·维持。

186、4-2.实施例2(foxo1抑制剂as1842856的效果)

187、4-2-1.rna的制备

188、将hepg2细胞以50000细胞/cm2接种到12孔板(corning(注册商标)，3336)的各孔中，并培养过夜。第二天(接种后16～24小时)，以多个浓度添加foxo1抑制剂as1842856(1nm、10nm、50nm、100nm、1μm)，或加入用作其溶剂的dmso作为对照组，培养1天(约24小时)。培养后，使用reliaprep rna miniprep系统(promega(注册商标)，z6012)从hepg2细胞中提取总rna。提取后，使用500ng的rna进行cdna合成(primescript rt master mix；takara(注册商标)，rr036a)，进一步进行定量pcr(thunderbird(注册商标)sybr qpcr mix；toyobo(注册商标)，qps-201x5)。

189、根据以下组成，制备用于cdna合成的混合物(mixture)。

190、5×primescript rt master mix 2μl(最终浓度1×)

191、总rna 500ng

192、去rna酶水 调整为合计10μl

193、使用applied biosystems(注册商标)公司的veriti 96孔热循环仪，在以下条件下处理上述混合物。

194、37℃15分钟

195、↓

196、85℃5秒

197、↓

198、4℃∞

199、使用90μl的te(10mm tris-hcl ph8.0+1mm edta ph8.0)，将合成的cdna(10μl)稀释10倍。将该稀释物供于定量pcr。

200、4-2-3.hepg2细胞中的ace2及tmprss2基因表达的分析

201、更具体而言，将该稀释物在以下条件下混合。

202、

203、对于上述混合物，使用bio-rad(注册商标)公司的cfx-connect，扩增cdna。pcr循环的条件如下所述。

204、1.95℃1分钟(预变性)

205、2.95℃15秒(变性)

206、3.60℃30秒(延伸)

207、(将步骤2～3重复40次，每次步骤3结束时检测荧光信号)

208、4.从65℃到95℃以每次0.5℃使温度上升，每5秒保持温度后检测荧光信号

209、在上述循环中，进行pcr产物的检测，并通过熔解曲线(melting curve)进行pcr产物的单一性的确认。

210、作为内部标准(在所有细胞·条件下进行相同的表达的管家基因)，使用gapdh(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脱氢酶)。

211、用于检测各基因的引物序列如下所述。

212、gapdh正向引物5’-agccacatcgctcagacac-3’(序列号1)

213、gapdh反向引物5’-gcctaatacgaccaaatcc-3’(序列号2)

214、ace2正向引物5’-ttctgtcacccgattttcaa-3’(序列号3)

215、ace2反向引物5’-tcccaacaatcgtgagtgc-3’(序列号4)

216、tmprss2正向引物5’-cgctggcctactctggaa-3’(序列号5)

217、tmprss2反向引物5’-ctgaggagtcgcactctatcc-3’(序列号6)

218、所有的引物都是从fasmac(注册商标)株式会社购买的(反相柱纯化等级)。

219、各基因的表达量表示将通过定量pcr得到的各基因的表达量进一步除以gapdh的表达量而标准化的结果。进而，将未用foxo1抑制剂处理的对照条件(dmso处理)下的表达量标准化为“1”。通过熔解曲线，确认到使用以上引物扩增的pcr产物全是单一的(即，用相同引物，没有扩增多种序列)。

220、将结果示于图1。与对照组的dmso处理比较，加入foxo1抑制剂as1842856时，观察到其浓度依赖性地ace2和tmprss2的mrna的表达减少(多重比较检验(tukey-kramer法))。该结果示出foxo1对于ace2和tmprss2的mrna的表达是必要的。

221、4-2-4.对刺突蛋白进入细胞内的影响

222、接着，对foxo1抑制剂抑制ace2的表达能否抑制sars-cov2与宿主细胞的结合及进入细胞内进行研究。为此目的，准备如下重组蛋白rbd-mfc(sino biological，40592-v05h2)，即，在sars-cov2的刺突蛋白s1中用于与ace2结合的充分必要区域rbd(受体结合域(receptor binding domain)，r319～f541)融合有小鼠igg的fc区。将实验的示意图示于图2。

223、将hepg2细胞以100000个接种到6孔板(cellbind(注册商标)；corning(注册商标)，3335)的各孔中，培养过夜。第二天(接种后16～24小时)，将foxo1抑制剂as1842856以1μm的浓度添加或将用作其溶剂的dmso作为对照组加入，培养3天(约72小时)。培养后，以最终浓度成为100nm的方式添加rbd-mfc，或添加作为对照组未融合的来自小鼠igg的fc区(mfc；abcam(注册商标)，ab179982)，进一步培养3小时。然后，用pbs(-)清洗细胞后，进行剥离并回收细胞。回收的细胞用4％多聚甲醛(pfa)(富士胶片和光纯药，163-204115)在室温下固定15分钟。固定后，用pbs(-)清洗，用alexa fluor(注册商标)488荧光色素共价结合于识别小鼠igg的抗体的二次抗体(jacksonimmunoresearch，715-545-150)，对进入细胞表面或细胞内的mfc进行染色，使用流式细胞仪(beckman coulter(注册商标)，fc500)，对每个细胞的alexa fluor(注册商标)488的荧光强度进行测定和定量。分析中使用了kaluzaanalysis 2.1(beckman coulter(注册商标))。使用荧光显微镜(keyence，bx-700)，拍摄典型细胞的照片。

224、将结果示于图3。首先，使用免疫染色法和荧光显微镜，观察rbd是否可以进入hepg2细胞。添加对照组的mfc时，几乎完全没有检测到荧光信号，而在接近50％的细胞中观察到rbd-mfc。这些结果提示rbd进入了hepg2细胞。

225、接着，使用foxo1抑制剂as1842856而预先抑制ace2的表达时，使用流式细胞仪，对进入的rbd的量是否被抑制进行研究。将荧光强度的不同示于图4。首先，添加作为阴性对照的mfc时的细胞所示的荧光强度，来自不经由ace2仅通过mfc进入的荧光强度、二次抗体非特异性结合的荧光强度、以及细胞所具有的自身荧光这3种，这被认为是背景信号。因此，通过减去mfc处的荧光强度，可以将更准确地进入的rbd来源的信号的差准确地比较。于是，与添加对照组的dmso时的rbd的荧光信号比较，通过用foxo1抑制剂as1842856预先处理，来自rbd的荧光信号的强度显著减少(t检验；p<0.0005)。即，该结果示出通过foxo1抑制剂，rbd向hepg2细胞的进入被抑制，提示foxo1抑制剂对ace2等的mrna表达量的抑制可以控制到能够抑制rbd向hepg2细胞的进入的水平。

226、进而，该结果提示，通过foxo1抑制剂可抑制sars-cov2与宿主细胞结合并感染(进入)。

227、在图5总结了由以上实验结果所示的一个实施方式中本公开的foxo1抑制剂as1842856的抑制新型冠状病毒进入细胞内的作用机制。as1842856作用于细胞内的foxo1而抑制ace2和/或tmprss2基因的表达。由此，细胞表面的ace2和/或tmprss2的量减少。从而，存在于病毒表面的刺突蛋白与ace2的结合被抑制。另外，tmprss2对病毒侵入细胞内的促进效果也被抑制。从而，其结果是导致由ace2和/或tmprss2介导的感染性疾病、特别是冠状病毒或其他疾病的预防或治疗效果。

228、4-3.实施例3(胰岛素的效果)

229、接着，为了研究胰岛素的效果，将hepg2细胞以50000细胞/cm2接种到12孔板(corning(注册商标)，3336)的各孔中，培养过夜。第二天(接种后16～24小时)，将野生型及改变型胰岛素以10μg/ml添加，或将pbs(-)作为对照组加入，培养3天(约72小时)。培养后，如上述实施例2所述，进行总rna提取、cdna合成、定量pcr。

230、将结果示于图6。与对照组的pbs(-)处理比较，加入野生型胰岛素时，观察到ace2和tmprss2的mrna的表达减少(多重比较检验(tukey-kramer法))。该结果示出胰岛素及其下游的信号传递通路抑制ace2和tmprss2的mrna的表达。

231、胰岛素通过基因工程在氨基酸中导入变异，根据其效果在施用后何时出现以及持续到何种程度，可制备超短效型胰岛素、短效型胰岛素、中效型胰岛素等改变型胰岛素，根据糖尿病患者的病情区分使用。因此，使用这些改变型胰岛素，对是否观察到通过野生型胰岛素导致的ace2及tmprss2的mrna的表达减少进行研究。

232、具体而言，使用以下的改变型胰岛素。

233、商品名：lispro(insulin lispro)(超短效型)

234、商品名：novorapid(注册商标)(insulin aspart)(超短效型型)

235、商品名：apidra(注册商标)(insulin glulisine)(超短效型型)

236、商品名：humulin(注册商标)r(regular insulin)(短效型)

237、商品名：humulin(注册商标)n(isophene insulin)(中效型)

238、商品名：novolin(注册商标)n(isophene insulin)(中效型)

239、商品名：novorapid(注册商标)30混合物(将insulin aspart(超短效型)和精蛋白结晶性insulin aspart(中效型)以3:7混合而成)(混合型)

240、商品名：levemir(注册商标)(insulin detemir)(长效型溶解)

241、商品名：ryzodeg(注册商标)(将insulin aspart(超短效型)和insulin degludec(长效型)以3:7混合而成)(预混溶解性)

242、野生型胰岛素由a链和b链结合的共计51个氨基酸序列构成。以下示出上述胰岛素的氨基酸序列。

243、a链(所有共同)

244、

245、(序列号7)

246、b链(下划线部分表示相互不同的氨基酸部分)

247、

248、

249、(人野生型、regular insulin)(序列号8)

250、

251、(序列号9)

252、

253、(序列号10)

254、

255、(序列号11)

256、

257、(序列号12)

258、

259、nε－hexadecandioyl(十六烷二酰)(degludec)(序列号13)

260、isophene insulin又名nph胰岛素，是野生型(regular)胰岛素与精蛋白结合·结晶而成的。精蛋白结晶性insulin aspart是精蛋白与insulin aspart结合·结晶而成的。

261、将结果示于图7。与对照组的pbs(-)处理比较，无论加入何种改变型胰岛素，都观察到与野生型胰岛素相同程度的ace2及tmprss2的mrna的表达减少。该结果示出，无论是何种类型的胰岛素制剂，只要将胰岛素下游的信号传递通路活化，就可以抑制ace2和tmprss2的mrna的表达。

262、4-4.实施例4(胰岛素对刺突蛋白进入细胞内的影响)

263、接着，对胰岛素抑制ace2的表达能否抑制sars-cov2与宿主细胞的结合及进入细胞内进行研究。为此目的，准备如下重组蛋白s1-mfc(sino biological，40592-v05h1)及rbd-mfc(sino biological，40592-v05h2)，即，在sars-cov2的刺突蛋白的s1结构域、以及s1中用于与ace2结合的充分必要区域rbd(受体结合域(receptor binding domain)，r319～f541)融合有小鼠igg的fc区。

264、将hepg2细胞以100000个接种到6孔板(cellbind(注册商标)；corning(注册商标)，3335)的各孔中，培养过夜。第二天(接种后16～24小时)，将野生型胰岛素以10μg/ml浓度添加，或将pbs(-)作为对照组加入，培养3天(约72小时)。培养后，以最终浓度成为100nm的方式添加s1-mfc、rbd-mfc，或添加作为对照组未融合的来自小鼠igg的fc区(mfc；abcam(注册商标)，ab179982)，进一步培养3小时。然后，如上述实施例2所述，对进入细胞内的s1和rbd的量进行定量。

265、首先，添加作为阴性对照的mfc时的细胞所示的荧光强度，来自不经由ace2仅通过mfc进入的荧光强度、二次抗体非特异性结合的荧光强度、以及细胞所具有的自身荧光这3种，这被认为是背景信号。因此，通过减去mfc处的荧光强度，可以将更准确地进入的s1及rbd来源的信号的差准确地比较。因此，在减去mfc处的荧光强度的基础上，与添加对照组的pbs(-)时的s1及rbd的荧光信号比较，通过用胰岛素预先处理，来自s1及rbd的荧光信号的强度显著减少(参见图8，多重比较检验(tukey-kramer法))。即，该结果示出，通过胰岛素，s1及rbd向hepg2细胞的进入被抑制，提示胰岛素对ace2等的mrna表达量的抑制可以控制到能够抑制s1及rbd向hepg2细胞的进入的水平。

266、进而，该结果提示通过胰岛素可抑制sars-cov2与宿主细胞结合并感染(进入)。

267、在图9总结了由以上实验结果所示的一个实施方式中本公开的胰岛素类化合物的抑制新型冠状病毒进入细胞内的作用机制。胰岛素类化合物作用于细胞而抑制ace2和/或tmprss2基因的表达。由此，细胞表面的ace2和/或tmprss2的量减少。从而，存在于病毒表面的刺突蛋白与ace2的结合被抑制。另外，tmprss2对病毒侵入细胞内的促进效果也被抑制。从而，其结果是导致由ace2和/或tmprss2介导的感染性疾病、特别是冠状病毒或其他疾病的预防或治疗效果。

268、4-5.实施例5(生长因子的效果)

269、进行与实施例1～4同样的实验。其中，替代各种胰岛素化合物等，使用10ng/ml的浓度的以下生长因子。已知这些作为信号通路的下游抑制foxo1。

270、igf1(peprotech公司、产品编号af-100-11)、

271、igf2(peprotech公司、产品编号af-100-12)、

272、egf(peprotech公司、产品编号af-100-15)、

273、fgf2(peprotech公司、产品编号af-100-18b)、

274、fgf14(biovision(注册商标)公司、产品编号7347)、

275、vegf165(peprotech公司、产品编号af-100-20)、

276、上述生长因子的氨基酸序列如下所述。

277、igf1

278、https://www.peprotech.com/gb/recombinant-human-igf-i-2

279、

280、

281、igf2

282、https://www.peprotech.com/en/recombinant-human-igf-ii-2

283、

284、(序列号15)

285、egf

286、https://www.peprotech.com/en/recombinant-human-eg

287、

288、(序列号16)

289、fgf2

290、https://www.peprotech.com/en/recombinant-human-fgf-basic-154-aa-2

291、

292、

293、(序列号17)

294、fgf14

295、https://www.biovision.com/fgf14-human-recombinant.html

296、

297、

298、(序列号18)

299、vegf165

300、https://www.peprotech.com/en/recombinant-human-vegfsub165su b-2

301、

302、

303、(序列号19)

304、将结果示于图10。结果是，与对照组相比，任何生长因子都导致ace2和/或tmprss2表达量的显著差别。这表示，与上述胰岛素类化合物同样，生长因子导致由ace2和/或tmprss2介导的感染性疾病、特别是冠状病毒或其他疾病的预防或治疗效果。

305、4-6.实施例6(hgf的效果)

306、进行与实施例1～4同样的实验。其中，替代各种胰岛素化合物等，使用hgf(r&dsystems公司，产品编号294-hgn-005/cf)。众所周知，hgf在与受体结合后，作为细胞内信号通路的下游抑制foxo1。

307、将结果示于图11。结果是，与对照组相比，hgf在1ng/ml以上的浓度下导致ace2和/或tmprss2表达量的显著差别。而且，hgf的抑制程度在10ng/ml以上时，与上述胰岛素类化合物、其他生长因子相比优异。这表示hgf对由ace2和/或tmprss2介导的感染性疾病、特别是冠状病毒或其他疾病的预防或治疗带来非常优异的效果。

308、hgf的氨基酸序列如下所述。

309、https://www.uniprot.org/uniprot/p14210

310、

311、

312、

313、

314、(序列号20)

315、4-7.实施例7(sirna的效果)

316、进行与实施例1～4同样的实验。其中，为了抑制foxo1的基因表达，使用sirna。sirna使用作为对照组不抑制任何的sirna(cell signaling(注册商标)公司，产品编号6568s)、以及以人foxo1基因为靶标的sirna(#1；cell signaling(注册商标)公司，产品编号6242s、及#2；cell signaling(注册商标)公司，产品编号6256s，序列信息包括对照组在内未公开)。sirna向细胞内的导入中，使用转染试剂(horizon discovery公司，dharmafect1，产品编号t2001-01)。导入各种sirna，3天后(约72小时后)回收细胞，如上所述用qpcr进行定量。

317、将结果示于图12。结果是，与导入对照组的sirna的细胞相比，在导入以foxo1为靶标的sirna的细胞中，foxo1 mrna的表达确实减少了。同时，也导致ace2和/或tmprss2表达量的显著差别。该结果示出foxo1确实对于ace2和/或tmprss2的基因表达是必要的。换言之，支持通过抑制foxo1的活性或基因表达量确实可以抑制ace2和/或tmprss2的基因表达的至此所获得的实验结果。

318、以上实验结果可见，关于foxo1抑制剂，一般情况下，对于经由信号传递通路的情况或直接抑制的情况(抑制剂或sirna等)等而言，其抑制方法大不相同，即使这样，也显示出与发挥foxo1抑制剂功能的化合物的含量相应的作为ace2或tmprss2的表达抑制剂或冠状病毒感染抑制剂的有效性。

319、以上，对具体的实施方式进行了说明。上述实施方式只是具体实例，本发明并不限于上述实施方式。例如，上述实施方式之一中公开的技术特征可适用于其他实施方式。另外，除非另有说明，对于特定的方法，也可以将一部分工序与其他工序的顺序替换，也可以在特定的两个工序之间追加进一步的工序。本发明的范围由权利要求书规定。

320、                         序列表

321、<110>  仿生技术支持有限公司

322、<120>  用于抑制血管紧张素转化酶2(ace2)和/或tmprss2表达的组合物

323、<130>  p-2915-wo

324、<150>  jp 2021-68032

325、<151>  2021-04-13

326、<150>  jp 2021-36644

327、<151>  2021-03-08

328、<150>  jp 2021-17835

329、<151>  2021-02-05

330、<150>  jp 2021-13858

331、<151>  2021-01-29

332、<150>  us 63215523

333、<151>  2021-06-28

334、<160>  20

335、<170>  patentin version 3.5

336、<210>  1

337、<211>  19

338、<212>  dna

339、<213>  智人(homo sapiens)

340、<400>  1

341、agccacatcg ctcagacac                                                   19

342、<210>  2

343、<211>  19

344、<212>  dna

345、<213>  智人(homo sapiens)

346、<400>  2

347、gcctaatacg accaaatcc                                                   19

348、<210>  3

349、<211>  20

350、<212>  dna

351、<213>  智人(homo sapiens)

352、<400>  3

353、ttctgtcacc cgattttcaa                                                  20

354、<210>  4

355、<211>  19

356、<212>  dna

357、<213>  智人(homo sapiens)

358、<400>  4

359、tcccaacaat cgtgagtgc                                                   19

360、<210>  5

361、<211>  18

362、<212>  dna

363、<213>  智人(homo sapiens)

364、<400>  5

365、cgctggccta ctctggaa                                                    18

366、<210>  6

367、<211>  21

368、<212>  dna

369、<213>  智人(homo sapiens)

370、<400>  6

371、ctgaggagtc gcactctatc c                                                21

372、<210>  7

373、<211>  21

374、<212>  prt

375、<213>  智人(homo sapiens)

376、<400>  7

377、gly ile val glu gln cys cys thr ser ile cys ser leu tyr gln leu

378、1               5                   10                  15

379、glu asn tyr cys asn

380、            20

381、<210>  8

382、<211>  30

383、<212>  prt

384、<213>  智人(homo sapiens)

385、<400>  8

386、phe val asn gln his leu cys gly ser his leu val glu ala leu tyr

387、1               5                   10                  15

388、leu val cys gly glu arg gly phe phe tyr thr pro lys thr

389、            20                  25                  30

390、<210>  9

391、<211>  30

392、<212>  prt

393、<213>  人工序列(artificial sequence)

394、<220>

395、<223>  来自野生型的改变型肽

396、<400>  9

397、phe val asn gln his leu cys gly ser his leu val glu ala leu tyr

398、1               5                   10                  15

399、leu val cys gly glu arg gly phe phe tyr thr asp lys thr

400、            20                  25                  30

401、<210>  10

402、<211>  30

403、<212>  prt

404、<213>  人工序列(artificial sequence)

405、<220>

406、<223>  来自野生型的改变型肽

407、<400>  10

408、phe val asn gln his leu cys gly ser his leu val glu ala leu tyr

409、1               5                   10                  15

410、leu val cys gly glu arg gly phe phe tyr thr lys pro thr

411、            20                  25                  30

412、<210>  11

413、<211>  30

414、<212>  prt

415、<213>  人工序列(artificial sequence)

416、<220>

417、<223>  来自野生型的改变型肽

418、<400>  11

419、phe val lys gln his leu cys gly ser his leu val glu ala leu tyr

420、1               5                   10                  15

421、leu val cys gly glu arg gly phe phe tyr thr pro glu thr

422、            20                  25                  30

423、<210>  12

424、<211>  29

425、<212>  prt

426、<213>  人工序列(artificial sequence)

427、<220>

428、<223>   insulin detemir

429、<400>  12

430、phe val asn gln his leu cys gly ser his leu val glu ala leu tyr

431、1               5                   10                  15

432、leu val cys gly glu arg gly phe phe tyr thr pro lys

433、            20                  25

434、<210>  13

435、<211>  29

436、<212>  prt

437、<213>  人工序列(artificial sequence)

438、<220>

439、<223>  degludec

440、<400>  13

441、phe val asn gln his leu cys gly ser his leu val glu ala leu tyr

442、1               5                   10                  15

443、leu val cys gly glu arg gly phe phe tyr thr pro lys

444、            20                  25

445、<210>  14

446、<211>  70

447、<212>  prt

448、<213>  智人(homo sapiens)

449、<400>  14

450、gly pro glu thr leu cys gly ala glu leu val asp ala leu gln phe

451、1               5                   10                  15

452、val cys gly asp arg gly phe tyr phe asn lys pro thr gly tyr gly

453、            20                  25                  30

454、ser ser ser arg arg ala pro gln thr gly ile val asp glu cys cys

455、        35                  40                  45

456、phe arg ser cys asp leu arg arg leu glu met tyr cys ala pro leu

457、    50                  55                  60

458、lys pro ala lys ser ala

459、65                  70

460、<210>  15

461、<211>  67

462、<212>  prt

463、<213>  智人(homo sapiens)

464、<400>  15

465、ala tyr arg pro ser glu thr leu cys gly gly glu leu val asp thr

466、1               5                   10                  15

467、leu gln phe val cys gly asp arg gly phe tyr phe ser arg pro ala

468、            20                  25                  30

469、ser arg val ser arg arg ser arg gly ile val glu glu cys cys phe

470、        35                  40                  45

471、arg ser cys asp leu ala leu leu glu thr tyr cys ala thr pro ala

472、    50                  55                  60

473、lys ser glu

474、65

475、<210>  16

476、<211>  53

477、<212>  prt

478、<213>  智人(homo sapiens)

479、<400>  16

480、asn ser asp ser glu cys pro leu ser his asp gly tyr cys leu his

481、1               5                   10                  15

482、asp gly val cys met tyr ile glu ala leu asp lys tyr ala cys asn

483、            20                  25                  30

484、cys val val gly tyr ile gly glu arg cys gln tyr arg asp leu lys

485、        35                  40                  45

486、trp trp glu leu arg

487、    50

488、<210>  17

489、<211>  154

490、<212>  prt

491、<213>  智人(homo sapiens)

492、<400>  17

493、ala ala gly ser ile thr thr leu pro ala leu pro glu asp gly gly

494、1               5                   10                  15

495、ser gly ala phe pro pro gly his phe lys asp pro lys arg leu tyr

496、            20                  25                  30

497、cys lys asn gly gly phe phe leu arg ile his pro asp gly arg val

498、        35                  40                  45

499、asp gly val arg glu lys ser asp pro his ile lys leu gln leu gln

500、    50                  55                  60

501、ala glu glu arg gly val val ser ile lys gly val cys ala asn arg

502、65                  70                  75                  80

503、tyr leu ala met lys glu asp gly arg leu leu ala ser lys cys val

504、                85                  90                  95

505、thr asp glu cys phe phe phe glu arg leu glu ser asn asn tyr asn

506、            100                 105                 110

507、thr tyr arg ser arg lys tyr thr ser trp tyr val ala leu lys arg

508、        115                 120                 125

509、thr gly gln tyr lys leu gly ser lys thr gly pro gly gln lys ala

510、    130                 135                 140

511、ile leu phe leu pro met ser ala lys ser

512、145                 150

513、<210>  18

514、<211>  232

515、<212>  prt

516、<213>  智人(homo sapiens)

517、<400>  18

518、met gly ser ser his his his his his his ser ser gly leu val pro

519、1               5                   10                  15

520、arg gly ser his met gly ser his met ala ala ala ile ala ser gly

521、            20                  25                  30

522、leu ile arg gln lys arg gln ala arg glu gln his trp asp arg pro

523、        35                  40                  45

524、ser ala ser arg arg arg ser ser pro ser lys asn arg gly leu cys

525、    50                  55                  60

526、asn gly asn leu val asp ile phe ser lys val arg ile phe gly leu

527、65                  70                  75                  80

528、lys lys arg arg leu arg arg gln asp pro gln leu lys gly ile val

529、                85                  90                  95

530、thr arg leu tyr cys arg gln gly tyr tyr leu gln met his pro asp

531、            100                 105                 110

532、gly ala leu asp gly thr lys asp asp ser thr asn ser thr leu phe

533、        115                 120                 125

534、asn leu ile pro val gly leu arg val val ala ile gln gly val lys

535、    130                 135                 140

536、thr gly leu tyr ile ala met asn gly glu gly tyr leu tyr pro ser

537、145                 150                 155                 160

538、glu leu phe thr pro glu cys lys phe lys glu ser val phe glu asn

539、                165                 170                 175

540、tyr tyr val ile tyr ser ser met leu tyr arg gln gln glu ser gly

541、            180                 185                 190

542、arg ala trp phe leu gly leu asn lys glu gly gln ala met lys gly

543、        195                 200                 205

544、asn arg val lys lys thr lys pro ala ala his phe leu pro lys pro

545、    210                 215                 220

546、leu glu val ala met tyr arg glu

547、225                 230

548、<210>  19

549、<211>  165

550、<212>  prt

551、<213>  智人(homo sapiens)

552、<400>  19

553、ala pro met ala glu gly gly gly gln asn his his glu val val lys

554、1               5                   10                  15

555、phe met asp val tyr gln arg ser tyr cys his pro ile glu thr leu

556、            20                  25                  30

557、val asp ile phe gln glu tyr pro asp glu ile glu tyr ile phe lys

558、        35                  40                  45

559、pro ser cys val pro leu met arg cys gly gly cys cys asn asp glu

560、    50                  55                  60

561、gly leu glu cys val pro thr glu glu ser asn ile thr met gln ile

562、65                  70                  75                  80

563、met arg ile lys pro his gln gly gln his ile gly glu met ser phe

564、                85                  90                  95

565、leu gln his asn lys cys glu cys arg pro lys lys asp arg ala arg

566、            100                 105                 110

567、gln glu asn pro cys gly pro cys ser glu arg arg lys his leu phe

568、        115                 120                 125

569、val gln asp pro gln thr cys lys cys ser cys lys asn thr asp ser

570、    130                 135                 140

571、arg cys lys ala arg gln leu glu leu asn glu arg thr cys arg cys

572、145                 150                 155                 160

573、asp lys pro arg arg

574、                165

575、<210>  20

576、<211>  728

577、<212>  prt

578、<213>  智人(homo sapiens)

579、<400>  20

580、met trp val thr lys leu leu pro ala leu leu leu gln his val leu

581、1               5                   10                  15

582、leu his leu leu leu leu pro ile ala ile pro tyr ala glu gly gln

583、            20                  25                  30

584、arg lys arg arg asn thr ile his glu phe lys lys ser ala lys thr

585、        35                  40                  45

586、thr leu ile lys ile asp pro ala leu lys ile lys thr lys lys val

587、    50                  55                  60

588、asn thr ala asp gln cys ala asn arg cys thr arg asn lys gly leu

589、65                  70                  75                  80

590、pro phe thr cys lys ala phe val phe asp lys ala arg lys gln cys

591、                85                  90                  95

592、leu trp phe pro phe asn ser met ser ser gly val lys lys glu phe

593、            100                 105                 110

594、gly his glu phe asp leu tyr glu asn lys asp tyr ile arg asn cys

595、        115                 120                 125

596、ile ile gly lys gly arg ser tyr lys gly thr val ser ile thr lys

597、    130                 135                 140

598、ser gly ile lys cys gln pro trp ser ser met ile pro his glu his

599、145                 150                 155                 160

600、ser phe leu pro ser ser tyr arg gly lys asp leu gln glu asn tyr

601、                165                 170                 175

602、cys arg asn pro arg gly glu glu gly gly pro trp cys phe thr ser

603、            180                 185                 190

604、asn pro glu val arg tyr glu val cys asp ile pro gln cys ser glu

605、        195                 200                 205

606、val glu cys met thr cys asn gly glu ser tyr arg gly leu met asp

607、    210                 215                 220

608、his thr glu ser gly lys ile cys gln arg trp asp his gln thr pro

609、225                 230                 235                 240

610、his arg his lys phe leu pro glu arg tyr pro asp lys gly phe asp

611、                245                 250                 255

612、asp asn tyr cys arg asn pro asp gly gln pro arg pro trp cys tyr

613、            260                 265                 270

614、thr leu asp pro his thr arg trp glu tyr cys ala ile lys thr cys

615、        275                 280                 285

616、ala asp asn thr met asn asp thr asp val pro leu glu thr thr glu

617、    290                 295                 300

618、cys ile gln gly gln gly glu gly tyr arg gly thr val asn thr ile

619、305                 310                 315                 320

620、trp asn gly ile pro cys gln arg trp asp ser gln tyr pro his glu

621、                325                 330                 335

622、his asp met thr pro glu asn phe lys cys lys asp leu arg glu asn

623、            340                 345                 350

624、tyr cys arg asn pro asp gly ser glu ser pro trp cys phe thr thr

625、        355                 360                 365

626、asp pro asn ile arg val gly tyr cys ser gln ile pro asn cys asp

627、    370                 375                 380

628、met ser his gly gln asp cys tyr arg gly asn gly lys asn tyr met

629、385                 390                 395                 400

630、gly asn leu ser gln thr arg ser gly leu thr cys ser met trp asp

631、                405                 410                 415

632、lys asn met glu asp leu his arg his ile phe trp glu pro asp ala

633、            420                 425                 430

634、ser lys leu asn glu asn tyr cys arg asn pro asp asp asp ala his

635、        435                 440                 445

636、gly pro trp cys tyr thr gly asn pro leu ile pro trp asp tyr cys

637、    450                 455                 460

638、pro ile ser arg cys glu gly asp thr thr pro thr ile val asn leu

639、465                 470                 475                 480

640、asp his pro val ile ser cys ala lys thr lys gln leu arg val val

641、                485                 490                 495

642、asn gly ile pro thr arg thr asn ile gly trp met val ser leu arg

643、            500                 505                 510

644、tyr arg asn lys his ile cys gly gly ser leu ile lys glu ser trp

645、        515                 520                 525

646、val leu thr ala arg gln cys phe pro ser arg asp leu lys asp tyr

647、    530                 535                 540

648、glu ala trp leu gly ile his asp val his gly arg gly asp glu lys

649、545                 550                 555                 560

650、cys lys gln val leu asn val ser gln leu val tyr gly pro glu gly

651、                565                 570                 575

652、ser asp leu val leu met lys leu ala arg pro ala val leu asp asp

653、            580                 585                 590

654、phe val ser thr ile asp leu pro asn tyr gly cys thr ile pro glu

655、        595                 600                 605

656、lys thr ser cys ser val tyr gly trp gly tyr thr gly leu ile asn

657、    610                 615                 620

658、tyr asp gly leu leu arg val ala his leu tyr ile met gly asn glu

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660、lys cys ser gln his his arg gly lys val thr leu asn glu ser glu

661、                645                 650                 655

662、ile cys ala gly ala glu lys ile gly ser gly pro cys glu gly asp

663、            660                 665                 670

664、tyr gly gly pro leu val cys glu gln his lys met arg met val leu

665、        675                 680                 685

666、gly val ile val pro gly arg gly cys ala ile pro asn arg pro gly

667、    690                 695                 700

668、ile phe val arg val ala tyr tyr ala lys trp ile his lys ile ile

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670、leu thr tyr lys val pro gln ser

671、                725