通过包含酶如胞壁质酶的选择性饲料添加剂干预减少致病性大肠杆菌的方法与流程

本发明涉及减少大肠杆菌(e.coli)发病机理。本发明涉及一种通过减少动物胃肠道中大肠杆菌病原体的群体来改善生产动物的健康的方法。更具体地，本发明涉及减少宿主动物的微生物群系中致病性大肠杆菌菌株的肠上皮细胞清除基因座(locus forenterocyte effacement,lee)基因和非lee致病基因的群体的方法。本发明还涉及减少宿主动物的微生物群系中的多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)的群体。

背景技术：

1、大肠杆菌(escherichia coli)是一种用途极其广泛的微生物。除了作为正常肠道菌群的成员外，大肠杆菌菌株还会引起膀胱感染、脑膜炎和腹泻。致泻性大肠杆菌包括至少五种类型的大肠杆菌，它们会引起范围从霍乱样腹泻到极度结肠炎的各种症状。每种类型的致腹泻性大肠杆菌都具有特定的毒力因子集合，所述毒力因子包括粘附素、侵袭素和/或毒素，所述所述毒力因子负责导致特定类型的腹泻。

2、致肠病性大肠杆菌(enteropathogenic e.coli,epec)是全世界婴儿腹泻的主要原因。epec疾病的特征为不同严重程度的水样腹泻，以及常伴有体液损失的呕吐和发烧。除了发达国家日托和托儿所中的孤立暴发外，epec对发展中国家幼儿(<6个月)构成了主要的地方性健康威胁。

3、肠出血性大肠杆菌(enterohemorragic e.coli，ehec)，也称为产志贺毒素大肠杆菌(shiga toxin producing e.coli,stec)，会导致比epec(肠性结肠炎)更严重的腹泻，并且在约10％的病例中，这种疾病会进展为一种往往致命的肾脏疾病，溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,hus)。ehec o157:h7是加拿大和美国最常见的血清型，并且与食物和水中毒相关联(perna等人，2001,nature 409:529-533)。ehec的其他血清型也在世界范围内引起重大问题。ehec寄生于牛并引起a/e病变，但不会引起成年动物患病，而是替代地将生物体排入环境中。然而，这会导致严重的健康问题，因为感染人类所需的ehec相对较少。

4、与其他大肠杆菌腹泻(例如产肠毒素大肠杆菌)不同，ehec和epec引起的腹泻不是由毒素介导的。相反，epec和ehec与肠表面结合(epec与小肠表面结合，ehec与大肠表面结合)并引起特征性组织学病变，称为粘附和消除(attaching and effacing,a/e)病变(tauschek等人2002,mol.microbiol 44；1533-1550.)。a/e病变的标志是细菌附着部位处的肠刷状缘表面溶解和上皮微绒毛丧失(消除)。一旦结合，细菌就会驻留在杯状突起或基座上。在上皮细胞中在这个基座下方是几种细胞骨架组分，包括肌动蛋白和肌动蛋白相关的细胞骨架蛋白。在附着的细菌下方a/e病变和富含肌动蛋白的基座的形成是a/e病原体的组织病理学标志(nataro等人,1998,clin microbiol rev 11:142-201,和frankel等人,1998mol microbiol 30:911-921)。

5、epec和ehec属于a/e病原体家族，包括几种引起兔子(repec)、猪(pepec)和小鼠(鼠柠檬酸杆菌(citrobacter rodentium))疾病的类epec动物病原体。这些病原体包含致病岛(pathogenicity island,pai)，所述致病岛编码对疾病至关重要的专门分泌系统和分泌的毒力因子。a/e病变形成所需的基因被认为聚集在单个染色体毒力岛中，所述单个染色体毒力岛被称为肠上皮细胞清除基因座(lee)，所述lee包括调控元件、iii型分泌系统(type iii secretion system,ttss)、分泌的效应蛋白及其同源伴侣(elliott等人,1998,mol microbiol 28:1-4；perna等人,1998,infect immun 66:3810-3817；zhu等人,2001,infect immun 69:2107-2115；deng等人,2001,infect immun 69:6323-6335)。

6、lee包含41个基因，使其成为较复杂的pai之一。lee ttss的主要功能是将效应物递送到宿主细胞内，它们在所述宿主细胞破坏宿主细胞功能并介导疾病。已鉴定出五种lee编码的效应物(tir、espg、espf、map和esph)。tir(用于易位的紧密黏附素受体)易位到宿主细胞中，它在所述宿主细胞中结合宿主细胞骨架和信号传导蛋白并在细菌附着位点处启动肌动蛋白聚合，从而导致在粘附细菌下方形成肌动蛋白基座结构，所述肌动蛋白基座结构经由细菌外膜蛋白紧密黏附素直接与tir的细胞外环相互作用。cest作为tir稳定性和分泌的伴侣蛋白发挥作用。

7、a/e病原体中还已表征了另外四种lee编码的ttss易位效应物：esph增强肌动蛋白基座的伸长；espf在拆分肠上皮细胞之间的紧密接合部中发挥作用；espg与志贺氏菌属微管结合效应物vira相关；并且map定位于线粒体，但也在肌动蛋白动力学中发挥作用。ler(用于lee编码的调节物)是鉴定出的唯一lee编码的调节物。

8、禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic e.coli,apec)是禽类肠外感染的病原体，是属于expec类的致病型。apec引起的肠外感染被称为大肠杆菌病并且表征为内脏器官周围的纤维蛋白病变，例如败血症、肠炎、肉芽肿、脐炎、鼻窦炎、气囊炎、关节炎/滑膜炎、腹膜炎、心包炎、肝周炎、蜂窝组织炎和肿头综合征(kunert等人,2015,world's poultryscience journal.71；249-258)。apec感染还会导致蛋的产量、品质和孵化率下降。必须考虑人畜共患传播的可能性，因为家禽是apec的主要宿主并且食用未煮熟的家禽可能会感染人类，人类可作为这种病原体的贮库(markland等人,zoonoses and public health.2015；doi:10.1111/zph.12194)。

9、这种致病型是肉鸡和蛋鸡肠外感染的病原体，并且这些感染统称为大肠杆菌病。大肠杆菌病在许多国家造成了重大经济损失。它影响家禽业的所有生产周期和所有部门。它导致肉鸡和蛋鸡的高发病率和死亡率。大肠杆菌菌株当从具有大肠杆菌病病变特征的禽类和被这种细菌杀死的禽类中分离出时可被指定为apec。被指定为apec的大肠杆菌必须具有一些毒力基因，例如编码粘附素、铁清除系统、保护素和其他毒力性状的毒力基因。仅基于诱发因素的控制方法无法有效预防大肠杆菌病。

10、细菌多形拟杆菌是在人类和小鼠中均最丰富的拟杆菌门物种之一，拟杆菌门是肠道微生物菌群的三大门之一(qin j等人,2010,nature,464,第59-65页)。已经观察到，参与代谢、定殖和毒力的ehec niph-11060424基因的表达响应于与多形拟杆菌(b.thetaiotaomicron)的直接接触以及从多形拟杆菌释放的可溶性因子而受到调节。有人建议与多形拟杆菌的直接接触可以作为生态位特异性信号起作用，所述生态位特异性信号使ehec准备好与宿主细胞更有效地相互作用，从而增加毒力潜力(iversen等人,2015,plosone 10(2):e0118140.doi:10.1371/journal.pone.0118140)。

11、传统上，减少或消除生产动物中的致病性大肠杆菌菌株通常聚焦于借助于例如抗生素的药物来消除动物胃肠道中的细菌。鉴于人们关于微生物群系及其在宿主动物的消化系统中的作用的了解不断增加，需要确定新颖的非抗生素方式来减少生产动物中的致病性大肠杆菌群体。换句话说，需要确定调节微生物群系中致病性大肠杆菌群体的新颖方式，并由此改善宿主动物的健康。

技术实现思路

1、本发明涉及一种减少动物的胃肠道(gastrointestinal tract,git)中的肠出血性大肠杆菌(ehec)、致肠病性大肠杆菌(epec)和禽致病性大肠杆菌(apec)的外源性肠上皮细胞清除基因座(lee)基因和外源性非lee致病基因的群体的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：n-乙酰基-胞壁质酶；蛋白酶；超氧化物歧化酶和/或过氧化氢酶，其中所述外源性lee基因和非lee致病基因的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。在一个实施方式中，外源性lee基因和非lee致病基因的群体被测量为在所述动物的微生物群系内检测到的lee基因和非lee基因的组合拷贝数与在所述微生物群系内检测到的基因的总拷贝数的比率％。在优选的实施方式中，n-乙酰基-胞壁质酶选自由以下组成的组：(a)多肽，所述多肽与seq idno:1至seq id no:71中的任一者具有至少80％序列同一性；(b)具有seq id no:1至seq idno:71中的任一者的多肽变体，所述多肽变体在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置中包含一个或多个氨基酸取代(优选地保守性取代)、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或它们的任意组合；(c)多肽，所述多肽包含(a)或(b)的多肽以及在1个氨基酸与10个氨基酸之间的n末端和/或c末端延伸；和(d)(a)或(b)的多肽的片段，所述片段具有胞壁质酶活性并具有成熟多肽的长度的至少90％；所述蛋白酶选自由以下组成的组：(a')多肽，所述多肽与seq id no:72至seq id no:76中的任一者具有至少70％的序列同一性；(b')seq id no:72至seq id no:76中的任一者的变体，其中所述变体具有蛋白酶活性并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或它们的任意组合；(c')多肽，所述多肽包含(a')或(b')的多肽以及n末端和/或c末端his标签和/或hq标签；(d')多肽，所述多肽包含(a')或(b')的多肽以及至多10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的n末端和/或c末端延伸；以及(e')(a')或(b')的多肽的片段，所述片段具有蛋白酶活性并具有成熟多肽的长度的至少90％；并且所述超氧化物歧化酶选自由以下组成的组：(a”)多肽，所述多肽与seq id no:77具有至少75％的序列同一性；(b”)多肽，所述多肽与seq id no:78具有至少75％的序列同一性；(c”)多肽，所述多肽与seq id no:79具有至少75％的序列同一性；(d”)多肽，所述多肽与seq id no:80具有至少75％的序列同一性；(e”)多肽，所述多肽与seq id no:77的氨基酸残基52至170具有至少85％的序列同一性；(f”)多肽，所述多肽与seq id no:78的氨基酸残基55至136具有至少85％的序列同一性；(g”)多肽，所述多肽与seq id no:79的氨基酸残基12至149具有至少85％的序列同一性；(h”)多肽，所述多肽与seq id no:80的氨基酸残基47至179具有至少85％的序列同一性；(i”)多肽，所述多肽与seq id no:81的序列具有至少80％的序列同一性；(j”)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在中高严格条件下与seq id no:81的编码序列或其全长互补序列杂交；(k”)为seq id no:77、或seq id no:78、或seq id no:79、或seq id no:80、或seq id no:77的氨基酸残基52至170、或seq id no:78的氨基酸残基55至136、或seq idno:79的氨基酸残基12至149、或seq id no:80的氨基酸残基47至179的多肽的变体，所述变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入并且具有超氧化物歧化酶活性；以及(l”)(a”)、(b”)、(c”)、(d”)、(e”)、(f”)、(g”')、(h”)、(i”)、(j”)或(k”)的多肽的片段，所述片段具有超氧化物歧化酶活性。

2、本发明还涉及一种用于减少动物的胃肠道(git)中多形拟杆菌群体的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：n-乙酰基-胞壁质酶；蛋白酶；超氧化物歧化酶和/或过氧化氢酶，其中所述多形拟杆菌的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。在一个实施方式中，多形拟杆菌的群体被测量为在所述动物的微生物群系内检测到的多形拟杆菌的群体与所述微生物群系内的微生物的总群体的比率％。在优选的实施方式中，n-乙酰基-胞壁质酶选自由以下组成的组：(a)多肽，所述多肽与seq id no:1至seq id no:71中的任一者具有至少80％序列同一性；(b)具有seq id no:1至seq id no:71中的任一者的多肽变体，所述多肽变体在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置中包含一个或多个氨基酸取代(优选地保守性取代)、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或它们的任意组合；(c)多肽，所述多肽包含(a)或(b)的多肽以及在1个氨基酸与10个氨基酸之间的n末端和/或c末端延伸；和(d)(a)或(b)的多肽的片段，所述片段具有胞壁质酶活性并具有成熟多肽的长度的至少90％；所述蛋白酶选自由以下组成的组：(a')多肽，所述多肽与seq id no:72至seq id no:76中的任一者具有至少70％的序列同一性；(b')seq id no:72至seq id no:76中的任一者的变体，其中所述变体具有蛋白酶活性并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或它们的任意组合；(c')多肽，所述多肽包含(a')或(b')的多肽以及n末端和/或c末端his标签和/或hq标签；(d')多肽，所述多肽包含(a')或(b')的多肽以及至多10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的n末端和/或c末端延伸；以及(e')(a')或(b')的多肽的片段，所述片段具有蛋白酶活性并具有成熟多肽的长度的至少90％；并且所述超氧化物歧化酶选自由以下组成的组：(a”)多肽，所述多肽与seq id no:77具有至少75％的序列同一性；(b”)多肽，所述多肽与seq id no:78具有至少75％的序列同一性；(c”)多肽，所述多肽与seq id no:79具有至少75％的序列同一性；(d”)多肽，所述多肽与seq id no:80具有至少75％的序列同一性；(e”)多肽，所述多肽与seq id no:77的氨基酸残基52至170具有至少85％的序列同一性；(f”)多肽，所述多肽与seq id no:78的氨基酸残基55至136具有至少85％的序列同一性；(g”)多肽，所述多肽与seq id no:79的氨基酸残基12至149具有至少85％的序列同一性；(h”)多肽，所述多肽与seq id no:80的氨基酸残基47至179具有至少85％的序列同一性；(i”)多肽，所述多肽与seq id no:81的序列具有至少80％的序列同一性；(j”)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在中高严格条件下与seqid no:81的编码序列或其全长互补序列杂交；(k”)为seq id no:77、或seq id no:78、或seq id no:79、或seq id no:80、或seq id no:77的氨基酸残基52至170、或seq id no:78的氨基酸残基55至136、或seq id no:79的氨基酸残基12至149、或seq id no:80的氨基酸残基47至179的多肽的变体，所述变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入并且具有超氧化物歧化酶活性；以及(l”)(a”)、(b”)、(c”)、(d”)、(e”)、(f”)、(g”')、(h”)、(i”)、(j”)或(k”)的多肽的片段，所述片段具有超氧化物歧化酶活性。

3、本发明还涉及一种减少由大肠杆菌感染引起的动物的全身炎症和/或局部炎症的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：n-乙酰基-胞壁质酶；蛋白酶；超氧化物歧化酶和/或过氧化氢酶，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。在一个实施方式中，所述炎症的减少被测量为在所述动物的微生物群系内检测到的lee基因和非lee基因的拷贝数与在所述微生物群系内检测到的基因的总拷贝数的比率％。在优选的实施方式中，n-乙酰基-胞壁质酶选自由以下组成的组：(a)多肽，所述多肽与seq id no:1至seq id no:71中的任一者具有至少80％序列同一性；(b)具有seq id no:1至seq id no:71中的任一者的多肽变体，所述多肽变体在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置中包含一个或多个氨基酸取代(优选地保守性取代)、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或它们的任意组合；(c)多肽，所述多肽包含(a)或(b)的多肽以及在1个氨基酸与10个氨基酸之间的n末端和/或c末端延伸；和(d)(a)或(b)的多肽的片段，所述片段具有胞壁质酶活性并具有成熟多肽的长度的至少90％；所述蛋白酶选自由以下组成的组：(a')多肽，所述多肽与seq id no:72至seq id no:76中的任一者具有至少70％的序列同一性；(b')seq id no:72至seq id no:76中的任一者的变体，其中所述变体具有蛋白酶活性并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或它们的任意组合；(c')多肽，所述多肽包含(a')或(b')的多肽以及n末端和/或c末端his标签和/或hq标签；(d')多肽，所述多肽包含(a')或(b')的多肽以及至多10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的n末端和/或c末端延伸；以及(e')(a')或(b')的多肽的片段，所述片段具有蛋白酶活性并具有成熟多肽的长度的至少90％；并且所述超氧化物歧化酶选自由以下组成的组：(a”)多肽，所述多肽与seq id no:77具有至少75％的序列同一性；(b”)多肽，所述多肽与seq id no:78具有至少75％的序列同一性；(c”)多肽，所述多肽与seq id no:79具有至少75％的序列同一性；(d”)多肽，所述多肽与seq id no:80具有至少75％的序列同一性；(e”)多肽，所述多肽与seq id no:77的氨基酸残基52至170具有至少85％的序列同一性；(f”)多肽，所述多肽与seq id no:78的氨基酸残基55至136具有至少85％的序列同一性；(g”)多肽，所述多肽与seq id no:79的氨基酸残基12至149具有至少85％的序列同一性；(h”)多肽，所述多肽与seq id no:80的氨基酸残基47至179具有至少85％的序列同一性；(i”)多肽，所述多肽与seq id no:81的序列具有至少80％的序列同一性；(j”)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在中高严格条件下与seq id no:81的编码序列或其全长互补序列杂交；(k”)为seq id no:77、或seq id no:78、或seq id no:79、或seq id no:80、或seq id no:77的氨基酸残基52至170、或seq id no:78的氨基酸残基55至136、或seq idno:79的氨基酸残基12至149、或seq id no:80的氨基酸残基47至179的多肽的变体，所述变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入并且具有超氧化物歧化酶活性；以及(l”)(a”)、(b”)、(c”)、(d”)、(e”)、(f”)、(g”')、(h”)、(i”)、(j”)或(k”)的多肽的片段，所述片段具有超氧化物歧化酶活性。

4、在上述发明的一些实施方式中，所述微生物群系是从动物的粪便样品或从动物的git内收集的样品收集的。在一些实施方式中，基因拷贝数测量通过rt-pcr计数、全长16srna测序或宏基因组dna测序执行。在一个实施方式中，lee基因包括：tir、map、espb、espf、espg、esph和espz，并且非lee致病基因包括：espg2、espj、espm1/2、espt、espw、cif、nlea、nleb、nlec、nled、nlee、nlef和nleh。在一个实施方式中，本发明的方法适用于生产动物。