上转换纳米颗粒肽缀合物的制作方法

本公开内容涉及ebna1和lmp1双靶向肽和双靶向肽上转换纳米颗粒(ucnp)缀合物，其包含能够靶向epstein-barr病毒(ebv)感染的细胞(例如癌症)中存在的ebna1和lmp1蛋白的相同的有用的治疗剂和/或诊断剂。

背景技术：

1、近年来，纳米材料作为肿瘤生物成像和体内癌症治疗的有前途的药剂而受到研究和探讨，部分原因是其增强的渗透性和保留(epr)效应。基于镧系元素的上转换(uc)纳米材料因其低毒性、高光化学稳定性、窄而尖锐的发射带、最小的自发荧光、深光穿透和均匀的尺寸分布而成为优于分子化合物的杰出候选材料。质量、形态和合成再现性均一的表面官能化ucnp已成为近期纳米生物安全性研究的绝佳选择。虽然有许多值得称赞的uc纳米材料应用于生物用途的实例，但是具有响应性uc发射的ph响应性肽官能化稳定纳米探针用于抑制和监测正常细胞上的特定癌症类型的生物医学应用仍然很少。

2、全球每年报告大约200,000例新的ebv相关癌症病例。值得注意的是，ebv与多种淋巴癌和上皮癌有关。此外，ebv会导致宿主终身潜伏感染。epstein-barr核抗原1(ebna1)通常以二聚体形式存在，在ebv基因组的维持、复制和转录中发挥着重要作用，并且是在所有ebv相关癌症中表达的唯一病毒潜伏蛋白。所有ebv感染的细胞均为ebna1阳性的。

3、ebv编码的潜伏感染膜蛋白1(lmp1)被认为是ebv的主要原癌基因之一。lmp1在由ebv诱导的b细胞转化、增殖和存活，上皮-间充质转化的诱导和癌症干细胞样特性的获得(其随后参与ebv相关肿瘤的发展和进展)中起重要作用。在一些ebv相关癌症(例如免疫抑制患者的ebv淋巴瘤)中，所有肿瘤细胞都表达lmp1，但只有约40％的鼻咽癌(npc)患者患有lmp1阳性的ebv相关肿瘤。只有一部分npc肿瘤具有lmp1的原因是，在那些npc肿瘤中，激活的b细胞的体核因子κ-轻链增强子(nf-κb)信号通路异常已经取代了lmp1在激活肿瘤生长的nf-κb通路中的作用，并且这种lmp1表达的缺失为肿瘤细胞提供了有助于逃避免疫细胞识别的优势。

4、lmp1是一种细胞膜蛋白，与核蛋白ebna1不同。因此，lmp1更有可能成为可接近的药物靶标，从而允许选择性药物作用于lmp1阳性肿瘤细胞。细胞表面或细胞质膜分子代表了有利的癌细胞追踪机会，并且还可以减少脱靶效应，因为不需要将药物摄取到细胞核中。因此，理论上，掺入定制肽可以为肿瘤细胞提供选择性细胞毒性，同时对正常组织产生较少的副作用。因此，lmp1被认为是提高治疗选择性的新的潜在靶蛋白。

5、因此，需要开发能够选择性靶向表达lmp1和/或ebna1肽的细胞的改进的治疗诊断剂和治疗剂。

技术实现思路

1、本公开内容提供了双靶向多肽和包含其的上转换纳米颗粒缀合物。

2、在第一方面，本文提供了包含三个肽序列或其药学上可接受的盐或两性离子的多肽，其中所述三个肽序列是seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3。

3、在某些实施方案中，多肽进一步包含两个接头，其中两个接头中的每一个共价键合于三个肽序列中的两个肽序列之间。

4、在某些实施方案中，两个接头中的每一个独立地为由1至4个氨基酸残基组成的多肽接头。

5、在某些实施方案中，多肽由15至21个氨基酸残基和共价键合至多肽n末端的任选接头组成。

6、在某些实施方案中，多肽包含以下结构：l1-a-l2-b-l3-c，其中a、b和c各自独立地选自由以下组成的组：seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3；l1是具有下式的接头：nh2(ch2)m(c＝o)-，其中m为选自1至10的整数；并且l2和l3各自独立地为由1至4个氨基酸残基组成的多肽接头。

7、在某些实施方案中，其中多肽接头中的每一个独立地由1至3个氨基酸残基组成，该1至3个氨基酸残基选自由以下组成的组：丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丝氨酸及其组合。

8、在某些实施方案中，l2和l3各自独立地是由1至3个甘氨酸残基组成的多肽接头。

9、在某些实施方案中，a是seq id no:2，b是seq id no:3且c是seq id no:1；a是seqid no:3，b是seq id no:2且c是seq id no:1；或者a是seq id no:1，b是seq id no:3且c是seq id no:2。

10、在某些实施方案中，多肽包含以下结构：l1-a-l2-b-l3-c，其中a是seq id no:2，b是seq id no:3且c是seq id no:1；a是seq id no:3，b是seq id no:2且c是seq id no:1；或者a是seq id no:1，b是seq id no:3且c是seq id no:2；l1是具有下式的接头：nh2(ch2)m(c＝o)-，其中m为选自2至8的整数；并且l2和l3各自独立地为由1至3个甘氨酸残基组成的多肽接头。

11、在某些实施方案中，该多肽包含选自由以下组成的组的肽序列：seq id no:5、seqid no:6和seq id no:7。

12、在第二方面，本文提供了上转换纳米颗粒(ucnp)缀合物，其包含经由任选的接头缀合至ucnp的表面的多个本文所述的多肽。

13、在某些实施方案中，ucnp是镧系元素掺杂的纳米颗粒。

14、在某些实施方案中，ucnp包含nagdf4:yb3+,er3+@nagdf4。

15、在某些实施方案中，多个多肽中的每一个包含以下结构：l4-a-l2-b-l3-c，其中a、b和c各自独立地选自由以下组成的组：seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3；l4是具有下式的接头：*-s-a(ch＝n)(ch2)m(c＝o)-，其中m是选自1至10的整数；a是聚乙二醇；并且*代表与ucnp缀合的位点；并且l2和l3各自独立地为由1至4个氨基酸残基组成的多肽接头。

16、在某些实施方案中，a是seq id no:2，b是seq id no:3且c是seq id no:1；a是seqid no:3，b是seq id no:2且c是seq id no:1；或者a是seq id no:1，b是seq id no:3且c是seq id no:2；并且l2和l3各自独立地为由1至3个甘氨酸残基组成的多肽接头。

17、在某些实施方案中，多个多肽中的每一个包含以下结构：l4-a-l2-b-l3-c，其中a是seq id no:2，b是seq id no:3且c是seq id no:1；a是seq id no:3，b是seq id no:2且c是seq id no:1；或者a是seq id no:1，b是seq id no:3且c是seq id no:2；l4是*-s-a(ch＝n)(ch2)m(c＝o)-，其中m是选自2至8的整数；a是聚乙二醇；并且*代表与ucnp缀合的位点；并且l2和l3各自是由2个甘氨酸残基组成的多肽接头。

18、在某些实施方案中，ucnp包含nagdf4:yb3+,er3+@nagdf4。

19、在某些实施方案中，a是seq id no:2；b是seq id no:3；并且c是seq id no:1。

20、在第三方面，本文提供了药物组合物，其包含本文所述的多肽和至少一种药学上可接受的赋形剂或载剂。

21、在第四方面，本文提供了药物组合物，其包含本文所述的ucnp缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载剂。

22、在第五方面，本文提供对epstein-barr病毒(ebv)感染的细胞进行成像的方法，该方法包括：将ebv感染的细胞与本文所述的ucnp缀合物接触；用光照射ebv感染的细胞；以及检测缀合物的发光。

23、在第六方面，本文提供了治疗有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括：向该受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽，其中该癌症是ebv阳性的。

24、在第七方面，本文提供了治疗有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括：向该受试者施用治疗有效量的本文所述的ucnp缀合物，其中该癌症是ebv阳性的。

25、fwly(seq id no：1)基序对于介导lmp1跨膜结构域内的分子间相互作用至关重要。设计了并入该基序的ebna1/lmp1双靶向蛋白特异性肽[n＝5、6和7(seq id no：5、6、7)]。ebna1靶向肽序列p4[yfmvf-gg-rrrk(seq id no：4)；yfmvf(seq id no：2)，ebna1结合基序；rrrk(seq id no：3)，核可渗透基序]与fwly(seq id no：1)基序组合以靶向膜lmp1；然后fwly(seq id no：1)基序被设计并放置在不同的位点：c末端侧[p5：-ahx-yfmvfggrrrkggfwly(seq id no：5)]，[p6：-ahx-rrrkggyfmvfggfwly(seq id no：6)]，或n末端位点[p7：-ahx-fwlyggrrrkggyfmvf(seq id no：7)]以评估杀伤ebv感染的癌细胞的效果。在nagdf4：yb3+，er3+@nagdf4(ucnp)和双靶向肽之间引入包含具有ph敏感行为的亚胺接头的双靶向肽ucnp缀合物，这允许双靶向肽在ebv感染的癌细胞中释放到细胞内。这种肽指导的双靶向纳米系统被工程改造为以响应性上转换发射特性特异性运输并递送肽至ebv相关癌细胞中。对肿瘤细胞表面蛋白进行靶向加上在酸性肿瘤微环境中差异释放抗ebv肽pn[n＝5、6和7(seq id no：5、6、7)]有助于最小化对正常细胞的不良和意外损伤。

26、为了评估这种提供精确监测和癌症治疗的策略，用多种ebv或lmp1阳性和阴性癌细胞模型对新的双靶向肽进行了测试。发现位于ebv靶向肽c末端(p5)的fwly基序的存在似乎能更好地促进双靶向肽进入ebv感染的细胞，并且在后续的治疗应用中表现出对核蛋白更强的亲和力。图56说明了本文所述的双靶向肽缀合物如何从肿瘤微环境递送、通过细胞表面lmp1蛋白进入ebv阳性细胞、穿透入细胞核并靶向ebna1的示例性体内情况。理论上，整个过程可以通过响应性uc发射来监测，并且ebv阳性细胞将通过破坏ebna1二聚化而被杀伤。此处，对新构建的纳米探针ucnp-pn[n＝5、6和7(seq id no:5、6、7)]进行表征以表明ucnp-p5是具有响应性上转换发射的最有效的ph响应性抗ebv纳米平台，有望实现体外和体内抗肿瘤活性，并增强细胞和肿瘤摄取。这可以为此类双靶标药剂转化为ebv相关癌症患者及其他癌症患者的疗法提供蓝图。

27、以ebv诱导的肿瘤细胞和hela细胞为比较研究模型，介绍了一种新颖安全的ebv-癌蛋白双靶向ph响应性肽工程改造、包被和引导方法，以实现针对ebv相关肿瘤的精确靶向和治疗策略。特异性结合两种过表达的ebv特异性癌蛋白ebna1(一种潜伏细胞蛋白)和lmp1(一种跨膜蛋白)的单个功能肽序列以三种不同的方式进行工程设计，并与ph敏感的肿瘤微环境(tme)-可裂解接头一起并入至上转换纳米颗粒(ucnp)nagdf4:yb3+,er3+@nagdf4[ucnp–pn，n＝5、6和7(seq id no:5、6、7)]。发现跨膜lmp1靶向能力和ucnp–pn的ph响应性的协同组合给出了特异性的癌症分化，在ebv感染的细胞中具有更高的细胞摄取和积累，因此仅需要较低的剂量，并且治疗的副作用和健康风险将大大降低。它还在靶向双蛋白结合后提供响应性uc信号增强，并显示出有效的体外和体内ebv癌症抑制。这是同时成像并抑制两种ebv潜伏蛋白的第一个实例，并作为下一代肽引导的精确递送纳米系统的蓝图，用于针对一种特定癌症的安全监测和治疗。