编码神经营养因子的腺相关病毒病毒颗粒和其用途的制作方法

背景技术：

1、影响眼表面的眼部病状，例如神经营养角膜病变；化学烧伤；角膜创伤；持续性上皮缺损；干眼病；三叉神经和/或眼睛的单纯疱疹病毒感染；三叉神经和/或眼睛的水痘带状疱疹病毒感染；和角膜神经的糖尿病并发症的医学治疗为已知的。另外，青光眼、老花眼、近视和其它前房病症的医学治疗为已知的。此些医学治疗包括局部滴眼剂、口服医药品和其它。

2、尽管有可用的治疗，但此些眼部病状仍为眼科医师的挑战，且治疗策略聚焦于疾病的严重程度。对于较不严重的病例的治疗可包括绷带隐形眼镜和润滑滴眼剂。对于更严重的病例，已广泛使用羊膜移植、血清泪液中指定浓度的血液衍生物、睑缘缝合术和局部施用自身血清滴眼剂(迪扎佐(di zazzo)等人《眼表(ocul surf.)》17(4):619-623(2019))。新出现的治疗策略来源于自身血清滴眼剂的功效。自身血清滴眼剂是通过用生理食盐水溶液稀释自患者血液收集的血清来制备的(布拉德利(bradley)等人《临床与实验眼科(clinexp ophthalmol.)》36(8):717-20(2008))。制备在个体基础上进行，且由于存在生长因子，包括神经营养因子(例如ngf和神经胶细胞系衍生的神经营养因子(gdnf))而被认为可有效治疗眼部病状。

3、用于治疗眼表面的神经营养因子的递送目前依赖于重复施用自身血清滴眼剂或含有纯化重组神经营养因子的滴眼剂。自身血清滴眼剂可因患者之间血清组成的差异、滴剂制备期间的污染可能性和使神经营养因子的降解降至最低所需的特殊存储条件而变化。同样地，含有重组神经营养因子的滴眼剂需要产生活性神经营养因子的表达和纯化条件，且具有有限稳定性且需要特殊存储条件。另外，重组人类神经营养因子(例如ngf)必须由患者每天以2小时间隔施用6次持续八周以提供益处。因此，需要将神经营养因子递送至眼表面而无需对于一些患者来说可能具有挑战性或不可能的重复局部施用的方法。

4、对眼表面病症的医学治疗的改进将为合乎需要的。

技术实现思路

1、本公开大体上涉及使用腺相关病毒(aav)载体在眼睛中表达神经营养因子。举例来说，本公开提供用于表达神经生长因子(ngf)或神经胶质衍生的神经营养因子(gdnf)的载体和其医学用途。

2、在一个方面中，本公开提供一种治疗有需要受试者的眼部病状的方法，所述方法包含向受试者眼睛或受试者眼睛的泪腺施用raav病毒颗粒，所述raav病毒颗粒包含aav衣壳和表达盒，所述表达盒包含以可操作方式连接至启动子的编码神经营养因子的多核苷酸。在一些实施例中，raav病毒颗粒向受试者的至少一只眼睛和/或泪腺施用，且转导受试者的至少一只眼睛和/或泪腺的细胞。至少一只眼睛和/或泪腺内的经转导细胞表达神经营养因子。由至少一只眼睛和/或泪腺的经转导细胞表达的神经营养因子将神经营养因子表达至泪膜中和/或受试者的眼表面上。所表达的神经营养因子可为例如人类神经生长因子(ngf)蛋白或神经胶质衍生的神经营养因子(gdnf)蛋白。基因产物的表达使得受试者与眼部病状相关的症状减轻。

3、在一些实施例中，本公开提供一种治疗有需要受试者的眼部病状的方法，所述方法包含施用重组腺相关病毒(raav)病毒颗粒，所述raav病毒颗粒包含aav衣壳和表达盒，所述表达盒包含以可操作方式连接至启动子的编码神经营养因子的多核苷酸，其中所述raav病毒颗粒是向受试者的至少一只眼睛或受试者眼睛的至少一个泪腺施用，借此治疗有需要受试者的眼部病状。

4、在一些实施例中，raav病毒颗粒是向受试者的至少一个泪腺施用。在一些实施例中，泪腺为主泪腺。在一些实施例中，至少一个泪腺为受试者的主泪腺，或瓦氏腺(wolfring's gland)或高氏腺(krause's gland)中的任一个。在一些实施例中，至少一个泪腺内的细胞经raav病毒颗粒转导。在一些实施例中，至少一个泪腺内的经转导细胞将治疗有效量的神经营养因子表达至泪膜中且任选地表达至受试者的眼表面上。在一些实施例中，至少一个泪腺内的经转导细胞将有效量的神经营养因子表达至泪膜中且任选地表达至受试者的眼表面上。

5、在一些实施例中，神经营养因子为神经生长因子(ngf)蛋白。在一些实施例中，编码ngf蛋白的多核苷酸包含与(seq id no.2)共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，ngf蛋白包含与(seq id no:1)共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，ngf蛋白包含seq id no:1。在一些实施例中，编码ngf蛋白的多核苷酸包含seq id no:2。

6、在一些实施例中，神经营养因子为神经胶质衍生的神经营养因子(gdnf)蛋白。在一些实施例中，编码gdnf蛋白的多核苷酸包含与(seq id no:4)共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，gdnf蛋白包含与(seq id no:3)共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，gdnf蛋白包含seq id no:3。在一些实施例中，编码gdnf蛋白的多核苷酸包含seqid no:4。

7、在一些实施例中，aav衣壳包含与aav2 vp1、aav2 vp3、aav5、aav8或aav9的衣壳共有至少95％、98％或100％一致性的衣壳。

8、在一些实施例中，启动子为cmv增强子、鸡β-肌动蛋白(cag)启动子(seq id no:5)。

9、在一些实施例中，眼部病状为眼表面化学烧伤、角膜创伤、持续性上皮缺损、干眼病、神经营养角膜炎、三叉神经和/或眼睛的单纯疱疹病毒感染、三叉神经和/或眼睛的水痘带状疱疹病毒感染，以及角膜神经的糖尿病并发症。

10、在一些实施例中，眼部病状为眼表面化学烧伤、角膜创伤、角膜溃疡、持续性上皮缺损、干眼病、神经营养角膜炎、三叉神经和/或眼睛的单纯疱疹病毒感染、三叉神经和/或眼睛的水痘带状疱疹病毒感染，以及角膜神经的糖尿病并发症。

11、在一些实施例中，眼部病状的特征在于根据麦基氏分类(mackie'sclassification)定义的临床病征。

12、在一些实施例中，眼部病状的一或多种症状与施用raav病毒颗粒之前的眼部病状的症状相比有所减轻。在一些实施例中，眼部病状的一或多种症状与未经治疗的对照受试者的眼部病状的症状相比有所减轻。在一些实施例中，眼部病状的一或多种症状与对侧眼睛中眼部病状的症状相比有所减轻。

13、在另一方面中，本公开提供raav病毒颗粒，其包含aav衣壳和表达盒，所述表达盒包含以可操作方式连接至启动子的编码神经营养因子的多核苷酸。

14、在一些实施例中，神经营养因子为神经生长因子(ngf)蛋白。在一些实施例中，编码ngf蛋白的多核苷酸包含与(seq id no:2)共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，ngf蛋白包含与(seq id no:1)共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，ngf蛋白包含seq id no:1。在一些实施例中，编码ngf蛋白的多核苷酸包含seq id no:2。

15、在一些实施例中，神经营养因子为神经胶质衍生的神经营养因子(gdnf)蛋白。在一些实施例中，编码gdnf蛋白的多核苷酸包含与(seq id no:4)共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，gdnf蛋白包含与(seq id no:3)共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，gdnf蛋白包含seq id no:3。在一些实施例中，编码gdnf蛋白的多核苷酸包含seqid no:4。

16、在一些实施例中，aav衣壳包含与aav2 vp1、aav2 vp3、aav5、aav8或aav9的衣壳共有至少95％、98％或100％一致性的衣壳。

17、在一些实施例中，启动子为cag启动子(seq id no:5)。

18、在一个方面中，本公开涉及包含如本文所公开的raav病毒颗粒和药学上可接受的载剂的药学组合物。在一些实施例中，药学组合物包含约1×109至约1×1014个基因组拷贝/毫升raav病毒颗粒。在一些实施例中，药学组合物包含约1×107至约1×1014个基因组拷贝/毫升raav病毒颗粒。在一些实施例中，药学组合物包含约1×1012至约6.2×1012个基因组拷贝/毫升raav病毒颗粒。

19、在一个方面中，本公开涉及一种治疗有需要受试者的眼部病状的方法，所述方法包含向受试者眼睛至受试者眼部分泌腺施用治疗有效量的如本文所公开的药学组合物。在一个方面中，本公开涉及一种治疗有需要受试者的眼部病状的方法，所述方法包含向受试者眼睛至受试者眼部分泌腺施用有效量的如本文所公开的药学组合物。

20、在一些实施例中，raav病毒颗粒是向受试者的至少一只眼睛和/或泪腺施用。在一些实施例中，至少一只眼睛和/或泪腺内的细胞经raav病毒颗粒转导。在一些实施例中，至少一只眼睛和/或泪腺内的经转导细胞将治疗有效量的神经营养因子表达至泪膜中且任选地表达至受试者的眼表面上。在一些实施例中，至少一只眼睛和/或泪腺内的经转导细胞将有效量的神经营养因子表达至泪膜中且任选地表达至受试者的眼表面上。

21、在一些实施例中，raav病毒颗粒可重复施用至受试者的至少一只眼睛和/或泪腺以确保腺体将适量目标(蛋白质、肽、酶等)分泌至泪膜中。在一些实施例中，至少一只眼睛和/或泪腺内的细胞经raav病毒颗粒转导。在一些实施例中，至少一只眼睛和/或泪腺内的经转导细胞将治疗有效量的神经营养因子表达至泪膜中且任选地表达至受试者的眼表面上。在一些实施例中，至少一只眼睛和/或泪腺内的经转导细胞将有效量的神经营养因子表达至泪膜中且任选地表达至受试者的眼表面上。

22、在一些实施例中，眼部病状为神经营养角膜炎。在一些实施例中，眼部病状的一或多种症状与施用raav病毒颗粒之前的眼部病状的症状相比有所减轻。在一些实施例中，眼部病状的一或多种症状与未经治疗的对照受试者的眼部病状的症状相比有所减轻。在一些实施例中，眼部病状的一或多种症状与对侧眼睛中眼部病状的症状相比有所减轻。

23、还提供本文所描述的raav病毒颗粒和药学组合物，其用于制备用于治疗眼部病状的药剂。

24、在一些方面中，本公开提供一种治疗有需要受试者的眼部病状的方法，所述方法包含向受试者的至少一只眼睛或受试者眼睛的至少一个泪腺施用重组腺相关病毒(raav)病毒颗粒，所述raav病毒颗粒包含aav衣壳和表达盒，所述表达盒包含以可操作方式连接至启动子的编码神经营养因子的多核苷酸。

25、在本文所描述的实施例中，raav病毒颗粒是向受试者泪腺施用。在一些实施例中，泪腺为受试者的主泪腺，或瓦氏腺或高氏腺中的任一个。在一些实施例中，泪腺为主泪腺。

26、在本文所描述的实施例中，泪腺内的细胞经raav病毒颗粒转导。在一些实施例中，泪腺内的经转导细胞将有效量的神经营养因子表达至泪膜中且任选地表达至受试者的眼表面上。在一些实施例中，神经营养因子为神经生长因子(ngf)蛋白。在一些实施例中，编码ngf蛋白的多核苷酸包含与seq id no:2共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，ngf蛋白包含与seq id no:1共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，ngf蛋白包含seqid no:1。在一些实施例中，编码ngf蛋白的多核苷酸包含seq id no:2。

27、在本文所描述的实施例中，神经营养因子为神经胶质衍生的神经营养因子(gdnf)蛋白。在一些实施例中，编码gdnf蛋白的多核苷酸包含与seq id no:4共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，gdnf蛋白包含与seq id no:3共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，gdnf蛋白包含seq id no:3。在一些实施例中，编码gdnf蛋白的多核苷酸包含seq id no:4。

28、在本文所描述的实施例中，aav衣壳与aav2 vp1(seq id no:6)、aav2 vp3(seq idno:8)、aav5(seq id no:10)、aav8(seq id no:12)或aav9(seq id no:14)共有至少95％、98％或100％一致性。

29、在本文所描述的实施例中，启动子为cag启动子(seq id no:5)。

30、在本文所描述的实施例中，眼部病状为眼表面化学烧伤、角膜创伤、角膜溃疡、持续性上皮缺损、干眼病、神经营养角膜炎、三叉神经和/或眼睛的单纯疱疹病毒感染、三叉神经和/或眼睛的水痘带状疱疹病毒感染，或角膜神经的糖尿病并发症。

31、在本文所描述的实施例中，眼部病状的一或多种症状与施用raav病毒颗粒之前的眼部病状的症状相比有所减轻。在一些实施例中，眼部病状的一或多种症状与未经治疗的对照受试者的眼部病状的症状相比有所减轻。在一些实施例中，眼部病状的一或多种症状与对侧眼睛中眼部病状的症状相比有所减轻。

32、在一些实施例中，本公开提供重组腺相关病毒(raav)病毒颗粒，其包含aav衣壳和表达盒，其中表达盒包含以可操作方式连接至启动子的编码神经营养因子的多核苷酸。

33、在本文所描述的实施例中，神经营养因子为神经生长因子(ngf)蛋白。在一些实施例中，编码ngf蛋白的多核苷酸包含与seq id no:2或seq id no:17共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，ngf蛋白包含与seq id no:1共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，ngf蛋白包含seq id no:1。在一些实施例中，编码ngf蛋白的多核苷酸包含seq idno:2或seq id no:17。

34、在本文所描述的实施例中，神经营养因子为神经胶质衍生的神经营养因子(gdnf)蛋白。在一些实施例中，编码gdnf蛋白的多核苷酸包含与seq id no:4或seq id no:18共有至少95％一致性的序列。

35、在一些实施例中，gdnf蛋白包含与seq id no:3共有至少95％一致性的序列。在一些实施例中，gdnf蛋白包含seq id no:3。在一些实施例中，编码gdnf蛋白的多核苷酸包含seq id no:4或seq id no:18。

36、在本文所描述的实施例中，aav衣壳包含与aav2 vp1(seq id no:6)、aav2 vp3(seq id no:8)、aav5(seq id no:10)、aav8(seq id no:12)或aav9(seq id no:14)共有至少95％、98％或100％一致性的vp3。

37、在本文所描述的实施例中，启动子为cag启动子(seq id no:5)或cmv启动子(seqid no:16)。

38、在本文所描述的实施例中，表达盒包含与seq id no:23共有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列。

39、在本文所描述的实施例中，表达盒包含与seq id no:24共有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列。

40、在本文所描述的实施例中，表达盒包含与seq id no:25共有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列。

41、在一些实施例中，本公开提供重组腺相关病毒(raav)病毒颗粒，其含有包含seqid no:25的多核苷酸的表达盒。

42、在本文所描述的实施例中，raav包含aav衣壳。

43、在本文所描述的实施例中，aav衣壳与aav2 vp1(seq id no:6)、aav2 vp3(seq idno:8)、aav5(seq id no:10)、aav8(seq id no:12)或aav9(seq id no:14)共有至少95％、98％或100％一致性。

44、在一些实施例中，本公开提供包含raav病毒颗粒的组合物，其中raav病毒颗粒包含：

45、(a)aav衣壳，以及

46、(b)表达盒，其中所述表达盒包含与seq id no:2或seq id no:17共有至少95％一致性的多核苷酸，且其中所述多核苷酸连接至启动子。

47、在一些实施例中，本公开提供包含raav病毒颗粒的组合物，其中raav病毒颗粒包含：

48、(a)aav衣壳，以及

49、(b)表达盒，其中所述表达盒包含与seq id no:4或seq id no:18共有至少95％一致性的多核苷酸，且其中所述多核苷酸连接至启动子。

50、在一些实施例中，本公开提供包含raav病毒颗粒的组合物，其中raav病毒颗粒包含：

51、(a)aav2、aav5、aav8或aav9衣壳，以及

52、(b)表达盒，其中所述表达盒包含与seq id no:2或seq id no:17共有至少95％一致性的多核苷酸，且其中所述多核苷酸连接至启动子。

53、在一些实施例中，本公开提供包含raav病毒颗粒的组合物，其中raav病毒颗粒包含：

54、(a)aav2、aav5、aav8或aav9衣壳，以及

55、(b)表达盒，其中所述表达盒包含与seq id no:4或seq id no:18共有至少95％一致性的多核苷酸，且其中所述多核苷酸连接至启动子。

56、在本文所描述的实施例中，aav衣壳与aav2 vp1(seq id no:6)、aav2 vp3(seq idno:8)、aav5(seq id no:10)、aav8(seq id no:12)或aav9(seq id no:14)共有至少95％、98％或100％一致性。在一些实施例中，aav衣壳为aav2。在一些实施例中，aav衣壳为aav5。在一些实施例中，aav衣壳为aav9。

57、在一些实施例中，本公开提供包含raav病毒颗粒的组合物，其中raav病毒颗粒包含：

58、(a)aav2衣壳，以及

59、(b)表达盒，其中所述表达盒包含与seq id no:25共有至少95％一致性的多核苷酸。

60、在一些实施例中，本公开提供包含raav病毒颗粒的组合物，其中raav病毒颗粒包含：

61、(a)aav5衣壳，以及

62、(b)表达盒，其中所述表达盒包含与seq id no:25共有至少95％一致性的多核苷酸。

63、在一些实施例中，本公开提供包含raav病毒颗粒的组合物，其中raav病毒颗粒包含：

64、(a)aav9衣壳，以及

65、(b)表达盒，其中所述表达盒包含与seq id no:25共有至少95％一致性的多核苷酸。

66、在一些实施例中，本公开提供一种药学组合物，其包含本文所描述的raav病毒颗粒或组合物和药学上可接受的载剂。

67、在本文所描述的实施例中，组合物包含约1×107至约1×1014个基因组拷贝/毫升raav病毒颗粒。

68、在本文所描述的实施例中，组合物包含约1×1012至约6.2×1012个基因组拷贝/毫升raav病毒颗粒。

69、在本文所描述的实施例中，组合物经配制用于施用至泪腺中。在一些实施例中，组合物经配制用于施用至眼表面上。

70、在本文所描述的实施例中，组合物经配制用于或可调适用于治疗眼部疾病、病症或病状。

71、在一些实施例中，本公开提供一种治疗有需要受试者的眼部病状的方法，所述方法包含向受试者眼睛至受试者眼部分泌腺施用有效量的本文所描述的药学组合物。

72、在本文所描述的实施例中，raav病毒颗粒是向受试者泪腺施用。在一些实施例中，泪腺内的细胞经raav病毒颗粒转导。在一些实施例中，泪腺内的经转导细胞将有效量的神经营养因子表达至泪膜中且任选地表达至受试者的眼表面上。

73、在本文所描述的实施例中，眼部病状为神经营养角膜炎。

74、在本文所描述的实施例中，眼部病状的一或多种症状与施用raav病毒颗粒之前的眼部病状的症状相比有所减轻。

75、在一些实施例中，眼部病状的一或多种症状与未经治疗的对照受试者的眼部病状的症状相比有所减轻。

76、在本文所描述的实施例中，眼部病状的一或多种症状与对侧眼睛中眼部病状的症状相比有所减轻。

77、在一些实施例中，本公开提供前述或相关方面中的任一个的raav病毒颗粒、组合物或药学组合物的用途，其用于前述或相关方面中的任一个的方法。

78、在一些实施例中，本公开提供前述或相关方面中的任一个的raav或组合物的用途，其用于制造用于前述或相关方面中的任一个的方法的药剂。

79、在一些实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含前述或相关方面中的任一个的raav病毒颗粒、组合物或药学组合物，以及关于在前述或相关方面中的任一个的方法中使用的说明书。

80、在一些实施例中，本公开提供一种重组腺相关病毒(raav)病毒颗粒，其用于治疗有需要受试者的眼部病状的方法，所述方法包含向受试者的至少一只眼睛或受试者眼睛的至少一个泪腺施用重组腺相关病毒(raav)病毒颗粒，所述raav病毒颗粒包含aav衣壳和表达盒，所述表达盒包含以可操作方式连接至启动子的编码神经营养因子的多核苷酸。

81、在本文所描述的实施例中，raav病毒颗粒是向受试者泪腺施用。

82、在本文所描述的实施例中，泪腺内的细胞经raav病毒颗粒转导。

83、在本文所描述的实施例中，神经营养因子为神经生长因子(ngf)蛋白。在一些实施例中，神经营养因子为神经胶质衍生的神经营养因子(gdnf)蛋白。

84、在本文所描述的实施例中，眼部病状为眼表面化学烧伤、角膜创伤、持续性上皮缺损、干眼病、神经营养角膜炎、三叉神经和/或眼睛的单纯疱疹病毒感染、三叉神经和/或眼睛的水痘带状疱疹病毒感染，或角膜神经的糖尿病并发症。