脂质纳米颗粒组合物的制作方法

背景技术：

1、用可电离脂质配制的脂质纳米颗粒可充当用于将生物活性剂，特别是多核苷酸，诸如rna，包括mrna和引导rna，递送至细胞中的载荷媒介物。含有可电离脂质的lnp组合物可有助于将寡核苷酸药剂递送跨过细胞膜，并且可用于将用于基因编辑的组分和组合物引入到活细胞中。尤其难以递送至细胞的生物活性剂包括蛋白质、基于核酸的药物及其衍生物，尤其包括诸如mrna的相对较大的寡核苷酸的药物。用于将有前景的基因编辑技术递送至细胞中，诸如用于递送crispr/cas9系统组分(例如编码核酸酶的mrna和相关引导rna(grna))的组合物尤其引人关注。

2、需要用于改善诸如rna的核酸的体内和体外递送的组合物。举例而言，需要用于将crispr/cas组分递送至诸如人细胞的真核细胞的组合物。具体地说，用于递送编码crispr蛋白质组分的mrna和用于递送crispr grna的组合物尤其引人关注。具有可稳定和递送rna组分的适用于体外和体内递送的特性的组合物也尤其引人关注。

技术实现思路

1、本公开提供了脂质组合物(例如脂质纳米颗粒(lnp)组合物)。此类脂质组合物可具有有利于将生物药剂，包括例如核酸载荷，诸如crispr/cas基因编辑组分递送至细胞的特性。

2、在一些实施方案中，lnp组合物包含：

3、核酸组分；和

4、脂质组分，其中所述脂质组分包含：

5、a)可电离脂质，其量为所述脂质组分的约25-45mol％；

6、b)中性脂质，其量为所述脂质组分的约10-30mol％；

7、c)辅助脂质，其量为所述脂质组分的约25-65mol％；和

8、d)peg脂质，其量为所述脂质组分的约1.5-3.5mol％；

9、其中所述可电离脂质是式(i)化合物

10、

11、x1为o、nh或直接键；

12、x2为c2-3亚烷基；

13、r3为c1-3烷基；

14、r2为c1-3烷基，或

15、r2与其所连接的氮原子和x2的2-3个碳原子一起形成5元或6元环，或

16、r2与r3及其所连接的氮原子一起形成5元环；

17、y1为c6-10亚烷基；

18、y2选自

19、r4为c4-11烷基；

20、z1为c2-5亚烷基；

21、z2为或不存在；

22、r5为c6-8烷基、c5-10烷氧基(例如-oc5-10卤烷基)、-o(c2-3烷基)oc6-10烷基、-oc6-10烯基(例如-oc6-10支链烯基)或-oc6-10炔基，并且

23、r6为c6-8烷基、c5-10烷氧基(例如-oc5-10卤烷基)、-o(c2-3烷基)oc6-10烷基、-oc6-10烯基(例如-oc6-10支链烯基)或-oc6-10炔基，或

24、r5与r6一起形成被孪位c6-8烷基取代的6元环状缩醛；

25、或式(i)化合物的盐。

26、在一些实施方案中，lnp组合物包含：

27、生物活性剂；和

28、脂质组分，其中所述脂质组分包含：

29、a)可电离脂质，其量为所述脂质组分的约25-45mol％；

30、b)中性脂质，其量为所述脂质组分的约10-30mol％；

31、c)辅助脂质，其量为所述脂质组分的约25-65mol％；和

32、d)peg脂质，其量为所述脂质组分的约1.5-3.5mol％；

33、其中所述可电离脂质是式(i)化合物

34、

35、其中

36、x1为o、nh或直接键；

37、x2为c2-3亚烷基；

38、r3为c1-3烷基；

39、r2为c1-3烷基，或

40、r2与其所连接的氮原子和x2的2-3个碳原子一起形成5元或6元环，或

41、r2与r3及其所连接的氮原子一起形成5元环；

42、y1为c6-10亚烷基；

43、y2选自

44、r4为c4-11烷基；

45、z1为c2-5亚烷基；

46、z2为或不存在；

47、r5为c6-8烷基或c6-8烷氧基；并且

48、r6为c6-8烷基或c6-8烷氧基

49、或式(i)化合物的盐。

50、在某些实施方案中，可电离脂质的量为脂质组分的约29-44mol％；中性脂质的量为脂质组分的约11-28mol％；辅助脂质的量为脂质组分的约28-55mol％；并且peg脂质的量为脂质组分的约2.3-3.5mol％。

51、在一些实施方案中，可电离脂质的量为脂质组分的约33mol％；中性脂质的量为脂质组分的约15mol％；辅助脂质的量为脂质组分的约49mol％；并且peg脂质的量为脂质组分的约3mol％。

52、在某些实施方案中，可电离脂质是

53、

54、或其盐，中性脂质是dspc；辅助脂质是胆固醇；并且peg脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。

55、在某些实施方案中，lnp的z平均直径小于约145nm，例如小于约120nm、小于约115nm或小于约100nm。在某些实施方案中，lnp的数量平均直径大于约50nm，例如大于约60nm。

56、在某些实施方案中，lnp的多分散性指数为约0.005至约0.75，例如约0.005至约0.1。

57、在一些实施方案中，lnp组合物的n/p比为约5至约7，较佳约6。

58、在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何lnp组合物，其中核酸组分是rna组分。在一些实施方案中，rna组分包含mrna。在优选的实施方案中，本公开涉及本文所述的任何lnp组合物，其中rna组分包含rna引导的dna结合剂，例如cas核酸酶mrna，诸如2类cas核酸酶mrna，或cas9核酸酶mrna。

59、在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何lnp组合物，其中mrna是修饰的mrna。在一些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何lnp组合物，其中rna组分包含grna核酸。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何lnp组合物，其中grna核酸是grna。

60、在某些优选的实施方案中，本公开涉及本文所述的lnp组合物，其中rna组分包含2类cas核酸酶mrna和grna。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何lnp组合物，其中grna核酸是或编码双引导rna(dgrna)。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何lnp组合物，其中grna核酸是或编码单引导rna(sgrna)。

61、在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的lnp组合物，其包含引导rna核酸和2类cas核酸酶mrna，其中mrna与引导rna核酸的比率为按重量计约2:1至1:4，优选按重量计约1:1。

62、在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何lnp组合物，其中grna是修饰的grna，例如所述修饰的grna在5'端处包含前五个核苷酸中的一个或多个处的修饰，或所述修饰的grna在3'端处包含最后五个核苷酸中的一个或多个处的修饰，或两者。

63、在某些实施方案中，本公开涉及一种将生物活性剂递送至细胞的方法，其包括使细胞与本文所述的lnp组合物接触。

64、在某些实施方案中，本公开涉及一种裂解dna的方法，其包括使细胞与本文所述的lnp组合物接触。在某些实施方案中，裂解步骤包括引入单链dna切口。在其他实施方案中，裂解步骤包括引入双链dna断裂。在某些实施方案中，lnp组合物包含2类cas mrna和grna核酸。在某些实施方案中，所述方法还包括将至少一种模板核酸引入到细胞中。

65、在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其包括向动物，例如人施用lnp组合物。在某些实施方案中，所述方法包括向细胞，诸如真核细胞，并且尤其是人细胞施用lnp组合物。在一些实施方案中，细胞是适用于疗法(例如过继细胞疗法(act))的细胞类型。act的实例包括自体和同种异体细胞疗法。在一些实施方案中，细胞是干细胞，诸如造血干细胞、诱导性多能干细胞或另一种专能或多能细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞，例如可发育成骨胳、软骨、肌肉或脂肪细胞的间充质干细胞。在一些实施方案中，干细胞包含眼部干细胞。在某些实施方案中，细胞选自间充质干细胞、造血干细胞(hsc)、单核细胞、内皮祖细胞(epc)、神经干细胞(nsc)、角膜缘干细胞(lsc)、组织特异性原代细胞或由其衍生的细胞(tsc)、诱导性多能干细胞(ipsc)、眼部干细胞、多能干细胞(psc)、胚胎干细胞(esc)和用于器官或组织移植的细胞。

66、在某些实施方案中，细胞是肝细胞。在其他实施方案中，细胞是免疫细胞，例如白细胞或淋巴细胞，优选是淋巴细胞，甚至优选是t细胞、b细胞或nk细胞，最优选是活化t细胞或非活化t细胞。

67、在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其包括施用以包含mrna、grna和grna核酸中的一种或多种的第一lnp组合物和第二lnp组合物形式配制的mrna。在一些实施方案中，第一lnp组合物和第二lnp组合物同时施用。在其他实施方案中，第一lnp组合物和第二lnp组合物依序施用。在某些实施方案中，mrna和grna核酸以单一lnp组合物形式配制。在一些实施方案中，第一lnp组合物包含第一grna并且第二lnp组合物包含第二grna，其中第一grna和第二grna包含与不同靶标互补的不同引导序列。

68、在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其中细胞与lnp组合物体外接触。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其中细胞与lnp组合物离体接触。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其包括使动物的组织与lnp接触。

69、在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其中基因编辑引起基因敲除。

70、在一些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其中基因编辑引起基因校正。

71、在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其中基因编辑引起插入。在一些实施方案中，插入是基因插入。

72、本文提供了用于体外基因工程化t细胞的方法，其克服先前方法的障碍。在一些实施方案中，初始t细胞与至少一种脂质组合物体外接触并且被遗传修饰。在一些实施方案中，非活化t细胞与两种或更多种脂质组合物体外接触并且被遗传修饰。在一些实施方案中，活化t细胞与两种或更多种脂质组合物体外接触并且被遗传修饰。在一些实施方案中，t细胞在活化前步骤中被修饰，包括使(非活化)t细胞与一种或多种脂质组合物接触，之后活化所述t细胞，之后在活化后步骤中进一步修饰所述t细胞，包括使所述活化t细胞与一种或多种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使非活化t细胞与一种、两种或三种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使活化t细胞与一种至十二种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使活化t细胞与一种至八种脂质组合物、任选地一种至四种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使所述活化t细胞与一种至六种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使t细胞与两种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使t细胞与三种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使t细胞与四种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使t细胞与五种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使t细胞与六种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使t细胞与七种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使t细胞与八种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使t细胞与九种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使t细胞与十种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使t细胞与十一种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使t细胞与十二种脂质组合物接触。脂质组合物的此类示例性依序施用(任选地在活化前步骤和活化后步骤中进一步依序或同时施用)利用t细胞的活化状态并且在编辑后提供独特优点和更健康的细胞。在一些实施方案中，基因工程化的t细胞具有以下有利特性：每个靶位点处的高编辑效率、增加的编辑后存活率、低毒性(不管转染复数)、低易位(例如无可测量靶标-靶标易位)、增加的细胞因子(例如il-2、ifnγ、tnfα)产生、在重复刺激下(例如在重复抗原刺激下)的持续增殖、增加的扩增和/或记忆细胞表型标志物的表达，包括例如早期干细胞。