细胞内递送组合物的制作方法

本发明属于蛋白质细胞内递送领域。

背景技术：

1、在寻找新且强效的治疗目标(靶点，targets)时，尤其是在肿瘤学领域，很难靶向细胞内目标，特别是被认为“不可成药的(无法制药的，undruggable)”目标。小分子药物不能靶向此类目标，主要是因为所需的治疗干预涉及干扰蛋白质-蛋白质相互作用，这种情况下小分子药物无法表现出功效和/或足够的选择性。虽然此类目标和生物过程通常由生物剂(例如，单克隆抗体、受体、白细胞介素及其衍生物和组合)来有效解决，但此类剂不能容易地进入活细胞，尤其是临床上相关的细胞隔室，如细胞质、细胞核、er等。这是因为细胞外膜对蛋白质基分子是不可透过的。

2、在蛋白质基分子通过基于天然内吞的机制内化至活细胞的情况下，此蛋白质基分子将进入内体途径，这会导致其溶酶体降解。因此，此路径天然仅与溶酶体障碍或抗体-药物缀合物(adc)的治疗相关。在前者中，治疗性蛋白质基剂旨在在内体或溶酶体中发挥其活性，并且通常被设计成或天然适于耐受内体/溶酶体的条件。在后者中，抗体仅用于将小分子药物靶向/递送至特定细胞，并且抗体运载体的溶酶体降解会释放小分子药物，通常是细胞毒素。

3、然而，如果蛋白质本身是治疗性的，而不仅仅是靶向部分，发明技术应该进一步实现所谓的“内体逃逸”。这一关键步骤将治疗性生物制剂(biologic)从内体途径不同阶段的囊泡(即早期或晚期内体和溶酶体)中释放出来，以避免治疗剂被这种细胞机制分解代谢。

4、在成功从内体逃逸后，治疗剂被释放到细胞的细胞质。然而，细胞质是一种拥挤的环境并且不适宜目前使用的大多数生物治疗剂，例如单克隆抗体及其衍生物。治疗性生物制剂必须有效地分散在细胞质中以定位和接合其治疗目标，或者可选地，到达目标细胞内细胞器，如细胞核、内质网(er)、线粒体等。

5、设计并在临床上用于阻断蛋白质-蛋白质相互作用或可用作激动剂的最强效的生物制剂基于抗体，主要是单克隆抗体或其衍生物，如fab、scfv及其组合。所有这些剂在结构上和功能上都依赖于二硫键，无论是链内还是链间二硫键。这些二硫键在细胞质的还原环境中不稳定。这种还原环境——高浓度还原剂所致，其中最突出的是谷胱甘肽——导致此类治疗剂中二硫键的还原，从而导致它们失去结构，并因此失去其与其目标接合的能力。因此，有效的细胞内递送技术应利用细胞质稳定的剂，或提供某种保护递送的剂免受这种还原环境影响的方法。

6、除此之外，细胞内递送技术必须具有足够的药代动力学和药效学行为，从而能够将其治疗有效负载有效递送至整个活体的各种器官和组织。

7、经典且研究最多的细胞内递送技术之一涉及利用有效负载的增强的正电荷。最经典的方法是从对病毒所采用的细胞内摄取机制的理解演变而来的。后者采用带正电荷的肽，富含精氨酸和赖氨酸氨基酸，如著名的hiv衍生tat肽(rkkrrqrrr(seq id no:16))。这种方法产生了许多具有不同电荷、氨基酸序列、另外的修饰和结构(线性、环状等)的细胞穿透肽(cpp)，其与各种有效负载融合或化学缀合或用于修饰各种纳米粒子。尽管cpp表现出内化到细胞中的能力，但其内体逃逸效率仍有争议，并且其总体效率似乎不足以用于实际的药物应用中。

8、亟需比标准cpp更有效的方法将基于蛋白质的治疗剂递送到细胞胞质中并改善生物分布和药效。

技术实现思路

1、本发明提供了蛋白质缀合物，其包括包含聚乙烯亚胺的蛋白质运载体、与细胞内目标相互作用的有效负载和连接它们的接头(linker，连接体)。还提供了包括蛋白质缀合物的药物组合物以及使用和生产蛋白质缀合物的方法。

2、根据第一方面，提供了蛋白质缀合物，其包括：

3、a.蛋白质运载体，与多个聚乙烯亚胺(pei)部分共价结合；

4、b.有效负载，与细胞内目标相互作用；和

5、c.接头，通过共价键与所述蛋白质运载体和所述有效负载结合；

6、其中所述有效负载不含二硫键，所述二硫键在被切割(裂解，cleaved)时减弱与所述细胞内目标的相互作用，并且其中所述蛋白质缀合物不是融合蛋白。

7、根据另一方面，提供了蛋白质缀合物，其包括：

8、a.hsa，与多个聚乙烯亚胺(pei)部分共价结合并且特征在于至少8mv的正ζ电势；

9、b.单结构域抗体(单域抗体，a single domain antibody)；和

10、c.接头，通过共价键与所述hsa和所述单结构域抗体结合；

11、并且其中所述蛋白质缀合物不是融合蛋白。

12、根据另一方面，提供了生产能够结合细胞内目标的蛋白质缀合物的方法，所述方法包括：

13、a.提供有效负载，所述有效负载结合所述细胞内目标并且不含在被切割时减弱与所述细胞内目标结合的二硫键；

14、b.提供与多个pei部分共价结合的蛋白质运载体；

15、c.通过接头将所选择的有效负载与所选择的蛋白质运载体共价连接以生产蛋白质缀合物；

16、d.测定所述接头在人血液、血浆或血清中的稳定性；和

17、e.选择包含在所述人血液、血浆或血清中稳定的接头的蛋白质缀合物；

18、从而生产能够结合细胞内目标的蛋白质缀合物。

19、根据另一方面，提供了蛋白质缀合物，其通过本发明的方法生产。

20、根据另一方面，提供了药物组合物，其包括本发明的蛋白质缀合物和药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。

21、根据另一方面，提供了结合细胞内目标的方法，所述方法包括使表达所述细胞内目标的细胞与本发明的蛋白质缀合物或本发明的药物组合物接触，其中生物有效负载结合所述细胞内目标，从而结合所述细胞内目标。

22、根据另一方面，提供了结合细胞内目标的方法，所述方法包括：

23、a.通过本发明的方法生产能够结合所述细胞内目标的蛋白质缀合物；和

24、b.使表达所述细胞内目标的细胞与所生产的蛋白质缀合物接触；

25、从而结合所述细胞内目标。

26、根据一些实施方式，所述pei是分子量小于2000道尔顿的线性pei或支化pei。

27、根据一些实施方式，所述多个pei部分包括3至90个分子。

28、根据一些实施方式，所述有效负载是结合所述细胞内目标的抗原结合分子。

29、根据一些实施方式，所述抗原结合分子选自单链抗体、单结构域抗体、可变重同型二聚体(variable heavy homodimer,vhh)、纳米抗体(nanobody)、免疫球蛋白新抗原受体(immunoglobulin novel antigen receptor,ignar)、设计的锚蛋白重复蛋白(designedankyrin repeat protein,darpin)和抗体模拟蛋白(antibody mimetic protein)。

30、根据一些实施方式，所述抗原结合分子选自vhh和darpin。

31、根据一些实施方式，所述蛋白质运载体是血浆内源性蛋白质。

32、根据一些实施方式，所述蛋白质运载体的大小为至少60kda。

33、根据一些实施方式，所述蛋白质运载体选自人血清白蛋白(hsa)、纤维蛋白原、igg、绿色荧光蛋白(gfp)和设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)。

34、根据一些实施方式，所述蛋白质运载体是hsa。

35、根据一些实施方式，所述蛋白质运载体是hsa，并且其中所述蛋白质运载体包括3至10个pei分子。

36、根据一些实施方式，所述接头包括生物相容性聚合物。

37、根据一些实施方式，所述生物相容性聚合物包括聚乙二醇(peg)。

38、根据一些实施方式，所述接头包括生物可切割键。

39、根据一些实施方式，所述生物可切割键包括二硫键。

40、根据一些实施方式，所述接头在血液中基本上稳定至少24小时。

41、根据一些实施方式，稳定包括24小时后血液中少于25％的切割。

42、根据一些实施方式，所述生物可切割键是空间位阻的。

43、根据一些实施方式，所述hsa包含seq id no:1的氨基酸序列，或其包含半胱氨酸34(c34)的片段或同系物。

44、根据一些实施方式，所述接头通过二硫键与所述hsa结合。

45、根据一些实施方式，所述接头与hsa的c34结合。

46、根据一些实施方式，所述二硫键靠近所述c34。

47、根据一些实施方式，所述靠近在距所述c34范围在5至15埃的距离处。

48、根据一些实施方式，所述接头是肽接头。

49、根据一些实施方式，所述接头选自seq id no:4-15。

50、根据一些实施方式，所述蛋白质运载体不含dna。

51、根据一些实施方式，所述生物有效负载不结合细胞表面蛋白。

52、根据一些实施方式，与多个pei部分共价结合的所述蛋白质运载体的特征在于至少8mv的正ζ电势。

53、根据一些实施方式，所述hsa包括3至10个pei分子。

54、根据一些实施方式，所述蛋白质缀合物还包括可检测标签，任选地其中所述标签与所述生物有效负载缀合。

55、根据一些实施方式，所述蛋白质缀合物是血液稳定的缀合物。

56、根据一些实施方式，所述蛋白质缀合物是细胞穿透缀合物。

57、根据一些实施方式，所述测定在形成所述蛋白质缀合物之前或在形成所述蛋白质缀合物之后进行。

58、根据一些实施方式，所述方法包括确认所述生物有效负载与所述细胞内目标的结合。

59、根据一些实施方式，与多个pei部分结合的所述蛋白质运载体的特征在于至少8mv的正ζ电势。

60、根据一些实施方式，所述蛋白质运载体包括hsa。

61、根据一些实施方式，所述蛋白质运载体与至少3个分子的pei共价结合。

62、根据一些实施方式，所述方法还包括将所选择的蛋白质缀合物与细胞接触和确认所述生物有效负载进入所述细胞的细胞质。

63、根据一些实施方式，稳定包括24小时后血液中少于25％的切割，而不稳定包括24小时后细胞质条件下至少50％的切割。

64、根据一些实施方式，所述接头包括生物相容性聚合物。

65、根据一些实施方式，所述共价连接是通过点击反应(click reaction)进行的。

66、根据一些实施方式，所述有效负载与包括第一反应性基团的接头共价结合；并且其中所述蛋白质运载体与包括与所述第一反应性基团具有反应性的第二反应性基团的接头共价结合。

67、根据一些实施方式，所述共价连接是通过使所述第一反应性基团与所述第二反应性基团反应，从而将所述有效负载与所述蛋白质运载体共价连接进行的。

68、根据一些实施方式，所述接头包括生物可切割键。

69、根据一些实施方式，共价连接包括二硫键形成。

70、根据一些实施方式，(i)所述有效负载与能够与所述蛋白质运载体的半胱氨酸生成二硫键的接头共价结合；或(ii)所述蛋白质运载体与能够与所述有效负载的半胱氨酸生成二硫键的接头共价结合，并且其中结合任选地是通过二硫键进行的。

71、根据一些实施方式，所述方法还包括测定所述接头在细胞质条件下的稳定性和选择包含在所述细胞质条件下不稳定的接头的蛋白质缀合物。

72、根据一些实施方式，所述药物组合物被配制用于全身施用。

73、根据一些实施方式，所述方法是检测细胞内目标的方法并且所述蛋白质缀合物包括可检测标签，并且其中所述方法还包括检测所述可检测标签。

74、根据一些实施方式，所述方法是调节所述细胞内目标的方法，并且其中所述有效负载是所述细胞内目标的激动剂或拮抗剂。

75、根据一些实施方式，所述细胞在对象中，并且其中所述接触包括向所述对象施用所述蛋白质缀合物。

76、根据一些实施方式，所述方法是治疗对其有需要的对象的状况的方法，其中所述状况能够通过调节所述细胞内目标来治疗。

77、根据一些实施方式，所述状况是癌症，所述细胞内目标是致癌的，并且所述生物有效负载是拮抗剂。

78、根据一些实施方式，所述接触不是在除经设计用于诱导所述蛋白质缀合物穿透所述细胞的运载体蛋白质之外的剂的存在下。

79、通过下文给出的详细描述，本发明的其它实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应当理解的是，详细描述和具体实例虽然指示了本发明的优选实施方式，但其只是通过说明给出的，因为通过此详细描述，处于本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说都将变得显而易见。