新型功能障碍P2X7结合物的制作方法

本发明涉及用于结合至功能障碍p2x7受体的抗原结合蛋白及其相关片段、涉及产生所述抗原结合蛋白和片段、并且涉及所述抗体和片段用于各种病况的检测和疗法的用途。相关申请本技术要求保护澳大利亚临时申请au2021902832的优先权，其全部内容在此通过引用并入本文。

背景技术：

0、发明背景

1、嘌呤能(p2x)受体是atp门控阳离子选择性通道。每个受体由三个蛋白质亚基或单体构成。迄今为止，已经鉴定出七个编码p2x单体的单独的基因：p2x1、p2x2、p2x3、p2x4、p2x5、p2x6、p2x7。

2、p2x7受体特别令人感兴趣，因为这些受体的表达被理解为受限于具有经历程序性细胞死亡潜力的细胞，例如胸腺细胞、树突状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和单核细胞。在正常内稳态中，诸如在红细胞上，有一些p2x7受体的表达。

3、有趣的是，在被认为不能够经历程序性细胞死亡的细胞(诸如肿瘤前细胞和肿瘤细胞)上发现了p2x7受体，该p2x7受体含有在pro210处具有顺式异构化的一种或多种单体，并且缺乏atp结合功能。已经将受体的这种构象异构体称为“无功能”或“功能障碍”受体。

4、将使用包含顺式pro210的肽免疫生成的抗体结合至功能障碍p2x7受体。然而，它们不结合能够在存在atp的正常生理条件下形成凋亡孔的p2x7受体。因此，这些抗体可用于选择性检测多种形式的癌和造血系统癌症以及用于治疗一些这些病况。

5、由于功能障碍p2x7受体上存在的构象表位的性质，鉴定并生成以足够的亲和力与这种形式的受体结合的蛋白质并不是简单的任务。在癌症检测和治疗的应用中，较高亲和力的试剂通常是期望的。

6、需要改进的试剂来结合功能障碍p2x7受体。

7、本说明书中对任何现有技术的引用并不承认或表明，在任何管辖区中，该现有技术构成公知常识的一部分，或本领域技术人员可以合理地预期该现有技术被理解为、被视为与其他现有技术相关、和/或与其他现有技术进行组合。

8、发明概述

9、本发明涉及包含结合至p2x7受体的抗原结合域的抗原结合蛋白，该p2x7受体具有对atp的受损应答，使得在生理条件下，其不能形成凋亡孔(即功能障碍p2x7受体)。优选地，本发明的抗原结合蛋白不结合至在对atp的应答中正常发挥功能的p2x7受体。

10、本发明提供了用于结合至功能障碍p2x7受体的抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白包含：

11、fr1-cdr1–fr2–cdr2–fr3–cdr3–fr4，和

12、fr1a-cdr1a–fr2a–cdr2a–fr3a–cdr3a–fr4a，

13、其中：

14、fr1、fr2、fr3和fr4各自为框架区；

15、cdr1、cdr2和cdr3各自为互补决定区；

16、fr1a、fr2a、fr3a和fr4a各自为框架区；

17、cdr1a、cdr2a和cdr3a各自为互补决定区；

18、其中任何所述框架区或互补决定区的序列如本文所述。

19、本发明提供了用于结合至nfp2x7受体的抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白包含：

20、fr1-cdr1–fr2–cdr2–fr3–cdr3–fr4，和

21、fr1a-cdr1a–fr2a–cdr2a–fr3a–cdr3a–fr4a，

22、其中：

23、fr1、fr2、fr3和fr4各自为框架区；

24、cdr1、cdr2和cdr3各自为互补决定区；

25、fr1a、fr2a、fr3a和fr4a各自为框架区；

26、cdr1a、cdr2a和cdr3a各自为互补决定区；

27、其中任何互补决定区的序列具有如下表1中所述的氨基酸序列。优选地，框架区也具有如下表中所述的氨基酸序列，包括特定残基处的氨基酸变异，其可以通过比对衍生自每种抗体的各种框架区来确定。本发明还包括，其中cdr1、cdr2和cdr3是来自抗体的可变重链(vh)的序列，cdr1a、cdr2a和cdr3a是来自抗体的可变轻链(vl)的序列，或其中cdr1、cdr2和cdr3是来自vl的序列，cdr1a、cdr2a和cdr3a是来自vh的序列。

28、在任何实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白包含：

29、fr1-cdr1–fr2–cdr2–fr3–cdr3–fr4–接头-fr1a-cdr1a–fr2a–cdr2a–fr3a–cdr3a–fr4a。

30、如本文所定义，接头可以是化学品、一个或多个氨基酸、或两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键。

31、在某些优选的实施方案中，本发明提供了抗原结合蛋白，其(按n末端至c末端或c末端至n末端的顺序)包含seq id no:4和12的氨基酸序列、基本上由seq id no:4和12的氨基酸序列组成或由seq id no:4和12的氨基酸序列组成。

32、在特别优选的实施方案中，按n末端至c末端的顺序，抗原结合蛋白包含seq idno:12和seq id no:4、基本上由seq id no:12和seq id no:4组成或由seq id no:12和seqid no:4组成(即vl至vh)。任选地，抗原结合蛋白包含seq id no:12(vl)-接头-seq id no:4(vh)。

33、在任何实施方案中，本发明提供了结合至或特异性结合至nfp2x7受体的抗原结合蛋白，并且其中抗原结合蛋白竞争性抑制包含vh和vl的抗体的结合，该vh包含如seq idno:4中所示的序列，该vl包含seq id no:12中所示的序列。

34、本发明还提供了抗原结合蛋白，其包含抗体的抗原结合域，其中所述抗原结合域结合至或特异性结合至nfp2x7受体，其中该抗原结合域包含以下的至少一种：

35、(i)包含互补决定区(cdr)1、cdr2和cdr3的vh，所述cdr1包含与seq id no:1、29、36或43中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列，所述cdr2包含与seq id no:2、30、37或44中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列，所述cdr3包含与seq id no:3、31、38或45中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列；

36、(ii)vh，其包含与seq id no:4中所示的序列至少约95％或96％或97％或98％或99％相同的序列；

37、(iii)包含cdr1、cdr2和cdr3的vl，所述cdr1包含与seq id no:9、50、57或64中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列，所述cdr2包含与seq id no:10、51、58或65中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列，所述cdr3包含与seq id no:11、52、59或66中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列；

38、(iv)vl，其包含与seq id no:12中所示的序列至少约95％相同的序列；

39、(v)包含cdr1、cdr2和cdr3的vh，所述cdr1包含seq id no:1、29、36或43中所示的序列，所述cdr2包含seq id no:2、30、37或44中所示的序列，所述cdr3包含seq id no:3、31、38或45中所示的序列；

40、(vi)vh，其包含seq id no:4中所示的序列；

41、(vii)包含cdr1、cdr2和cdr3的vl，所述cdr1包含seq id no:9、50、57或64中所示的序列，所述cdr2包含seq id no:10、51、58或65中所示的序列，所述cdr3包含seq id no:11、52、59或66中所示的序列；

42、(viii)vl，其包含seq id no:12中所示的序列；

43、(ix)包含cdr1、cdr2和cdr3的vh，所述cdr1包含seq id no:1、29、36或43中所示的序列，所述cdr2包含seq id no:2、30、37或44中所示的序列，所述cdr3包含seq id no:3、31、38或45中所示的序列；以及包含cdr1、cdr2和cdr3的vl，所述cdr1包含seq id no:9、50、57或64中所示的序列，所述cdr2包含seq id no:10、51、58或65中所示的序列，所述cdr3包含seq id no:11、52、59或66中所示的序列；或

44、(x)vl，其包含seq id no:4中所示的序列，以及vh，其包含seq id no:12中所示的序列。

45、在本发明的任何方面，抗原结合域进一步包含以下中至少一种：

46、(i)包含框架区(fr)1、fr2、fr3和fr4的vh，所述fr1包含与seq id no:5、32、39或46中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列，所述fr2包含与seq id no:6、33、40或47中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列，所述fr3包含与seqid no:7、34、41或48中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列，所述fr4包含与seq id no:8、35、42或49中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列；

47、(ii)包含fr1、fr2、fr3和fr4的vl，所述fr1包含与seq id no:13、53、60或67中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列，所述fr2包含与seq id no:14、54、61或68中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列，所述fr3包含与seq id no:15、55、62或69中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列，所述fr4包含与seq id no:16、56、63或70中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列；

48、(iii)包含fr1、fr2、fr3和fr4的vh，所述fr1包含seq id no:5、32、39或46中所示的序列，所述fr2包含seq id no:6、33、40或47中所示的序列，所述fr3包含seq id no:7、34、41或48中所示的序列，所述fr4包含seq id no:8、35、42或49中所示的序列；

49、(iv)包含fr1、fr2、fr3和fr4的vl，所述fr1包含seq id no:13、53、60或67中所示的序列，所述fr2包含seq id no:14、54、61或68中所示的序列，所述fr3包含seq id no:15、55、62或69中所示的序列，所述fr4包含seq id no:16、56、63或70中所示的序列；或

50、(v)包含fr1、fr2、fr3和fr4的vh，所述fr1包含seq id no:5、32、39或46中所示的序列，所述fr2包含seq id no:6、33、40或47中所示的序列，所述fr3包含seq id no:7、34、41或48中所示的序列，所述fr4包含seq id no:8、35、42或49中所示的序列；以及包含fr1、fr2、fr3和fr4的vl，所述fr1包含seq id no:13、53、60或67中所示的序列，所述fr2包含seqid no:14、54、61或68中所示的序列，所述fr3包含seq id no:15、55、62或69中所示的序列，所述fr4包含seq id no:16、56、63或70中所示的序列

51、如本文所述，抗原结合蛋白可以是以下的形式：

52、(i)单链fv片段(scfv)；

53、(ii)二聚体scfv(di-scfv)；或

54、(iii)(i)或(ii)之一，其连接至抗体的恒定区、fc或重链恒定结构域(ch)2和/或ch3。

55、进一步，如本文所述，抗原结合蛋白可以是以下的形式：

56、(i)双抗体；

57、(ii)三抗体；

58、(iii)四抗体；

59、(iv)fab；

60、(v)f(ab’)2；

61、(vi)fv；

62、(vii)双特异性抗体或其他形式的多特异性抗体(包括bite)；或

63、(viii)(i)至(vii)之一，其与抗体的恒定区、fc或重链恒定结构域(ch)2和/或ch3连接。

64、在特别优选的实施方案中，本发明的抗原结合蛋白是不包含来自免疫球蛋白的恒定区的蛋白。例如，优选地，抗原结合蛋白是scfv、二聚体scfv、fv片段、单结构域抗体(dab)、双抗体、或融合蛋白或包含相同蛋白的缀合物。

65、上述抗原结合蛋白还可以称为抗体的抗原结合结构域。

66、在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的互补决定区序列(cdr)可以根据imgt编号系统、kabat或chothia系统来定义。

67、本文提及“结合至”功能障碍p2x7受体(nfp2x7受体)的蛋白质或抗体为“特异性结合至(bind specifically to或specifically bind to)”nfp2x7受体的蛋白质或抗体提供文字支持。

68、优选地，如本文所述的抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段。通常，抗原结合蛋白是抗体，例如单克隆抗体。抗原结合蛋白可以是以重组抗体或经修饰的抗体的形式(例如，嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、cdr移植抗体、灵长类化抗体、去免疫化(de-immunised)抗体、同人源化(synhumanised)抗体、半抗体、双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体)。抗体可以进一步包含化学修饰，诸如与活性剂或放射性标记，或用于改进溶解度的药剂或本文描述的其他修饰物缀合。

69、如本文所用，抗原结合蛋白可以是可变结构域。

70、本发明还提供了抗nfp2x7受体抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区和重链可变区，

71、其中所述重链可变区包含：

72、如seq id no:1、29、36或43中所示的cdr h1，如seq id no:2、30、37或44中所示的cdr h2，和如seq id no:3、31、38或45中所示的cdrh3；以及

73、其中所述轻链可变区包含：

74、如seq id no:9、50、57或64中所示的cdr ll，如seq id no:10、51、58或65中所示的cdr l2，和如seq id no:11、52、59或66中所示的cdr l3。

75、在任何实施方案中，抗nfp2x7受体抗体或其抗原结合片段，包含含有seq id no:12的序列的轻链可变区。

76、在任何实施方案中，抗nfp2x7受体抗体或其抗原结合片段，包含含有seq id no:4的序列的重链可变区。

77、在任何实施方案中，抗nfp2x7受体抗体或其抗原结合片段，包含含有seq id no:12的序列的轻链可变区和含有seq id no:4的序列的重链可变区。

78、在任何实施方案中，抗nfp2x7抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含如seq id no:13、53、60或67中所示的fr l1，如seq id no:14、54、61或68中所示的fr l2，如seq id no:15、55、62或69中所示的fr l3，和如seq id no:16、56、63或70中所示的fr l4。

79、在本发明的任何实施方案中，抗nfp2x7抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含如seq id no:5、32、39或46中所示的fr h1，如seq id no:6、33、40或47中所示的fr h2，如seq id no:7、34、41或48中所示的fr h3，和如seq id no:8、35、42或49中所示的fr h4。

80、在本发明的任何方面和本文所述的任何抗原结合蛋白中，进一步包括经工程化以具有降低的诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的能力的fc区。优选地，通过与fc受体相互作用的fc区中的氨基酸的突变、缺失或修饰来赋予所述降低的诱导adcc的能力。

81、本发明提供了如本文所述的抗原结合蛋白，其中形成fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4中一种或多种的氨基酸序列是人序列。

82、本发明提供了抗nfp2x7抗原结合蛋白、免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab、scfv、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、双抗体、三抗体、线性抗体、单链抗体分子、或多特异性抗体，其包含具有如本文所述的序列的抗原结合蛋白，或包含如本文所述的cdr和/或fr序列。

83、如本文所述的抗原结合蛋白可以包含人恒定区，例如igg恒定区，诸如igg1、igg2、igg3或igg4恒定区或其混合物。在抗体或蛋白质包含vh和vl的情况下，该vh可以连接至重链恒定区并且该vl可以连接至轻链恒定区。

84、在一个实例中，如本文所述的抗原结合蛋白包含igg4抗体的恒定区或igg4抗体的稳定化的恒定区。在一个实例中，该蛋白质或抗体包含在位置241处(根据kabat的编号系统(kabat等人,sequences of proteins of immunological interest washington dcunited states department of health and human services,1987和/或1991))具有脯氨酸的igg4恒定区。

85、在一个实例中，如本文所述的抗原结合蛋白或如本文所述的抗原结合蛋白的组合物，包含重链恒定区，包含稳定化的重链恒定区，包含完全或部分具有或不具有c末端赖氨酸残基的序列的混合物。

86、在一个实例中，抗原结合蛋白包含与igg4恒定区或稳定化的igg4恒定区(例如，如上所述)连接或融合的本文公开的vh，并且vl与κ轻链恒定区连接或融合。

87、在本发明的任何方面，抗体是裸抗体。具体来说，抗体是非缀合形式并且不适合于形成缀合物。

88、本发明还提供了以以下的形式的缀合物：与标记或细胞毒剂缀合的如本文所述的抗原结合蛋白、免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab、scfv、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、双抗体、三抗体、线性抗体、单链抗体分子、或多特异性抗体或融合蛋白。

89、在针对形成抗原结合蛋白的多条多肽链的本发明的方面，表达构建体包含：可操作地连接至启动子的编码包含例如vh的多肽的核酸；和可操作地连接至启动子的编码包含例如vl的多肽的核酸。

90、在另一个实例中，表达构建体是双顺反子表达构建体，例如包含以下以5’至3’顺序可操作地连接的组分：

91、(i)启动子

92、(ii)编码第一多肽的核酸；

93、(iii)内部核糖体进入位点；和

94、(iv)编码第二多肽的核酸，

95、其中第一多肽包含vh并且第二多肽包含vl，或反之亦然。

96、本发明还考虑了单独的表达构建体，其中一个编码包含vh的第一多肽，并且其中另一个编码包含vl的第二多肽。例如，本发明还提供了组合物，其包含：

97、(i)第一表达构建体，其包含可操作地连接至启动子的编码包含vh的多肽的核酸；和

98、(ii)第二表达构建体，其包含可操作地连接至启动子的编码包含vl的多肽的核酸。

99、本发明提供了细胞，其包含本文所述的载体或核酸。优选地，细胞是分离的、基本上纯化的或重组的。在一个实例中，细胞包含本发明的表达构建体或：

100、(i)第一表达构建体，其包含可操作地连接至启动子的编码包含vh的多肽的核酸；和

101、(ii)第二表达构建体，其包含可操作地连接至启动子的编码包含vl的多肽的核酸，

102、其中第一多肽和第二多肽缔合而形成本发明的抗原结合蛋白。

103、本发明的细胞的实例包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

104、本发明提供了核酸，其编码如本文所述的抗原结合蛋白、免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab、scfv、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、双抗体、三抗体、线性抗体、单链抗体分子，或多特异性抗体、融合蛋白或缀合物。

105、本发明提供了载体，其包含本文所述的核酸。

106、本发明提供了细胞，其包含本文所述的载体或核酸。

107、在任何实施方案中，核酸可以包含如seq id no:71至86中任一个、优选地seq idno:74和/或82中所示的核苷酸序列，或与其至少80％相同的序列。

108、本发明提供了药物组合物，其包含抗原结合蛋白，或包含如本文所述的cdr和/或fr序列，或如本文所述的免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab、scfv、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、双抗体、三抗体、线性抗体、单链抗体分子，或多特异性抗体、融合蛋白或缀合物，以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。

109、本发明提供了诊断组合物，其包含抗原结合蛋白，或包含如本文所述的cdr和/或fr序列，或如本文所述的抗原结合蛋白、免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab、scfv、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、双抗体、三抗体、线性抗体、单链抗体分子，或多特异性抗体、融合蛋白或缀合物，稀释剂以及任选的标记。

110、本发明提供了试剂盒或制品，其包含抗原结合蛋白，或包含如本文所述的cdr和/或fr序列，或如本文所述的免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab、scfv、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、双抗体、三抗体、线性抗体、单链抗体分子，或多特异性抗体、融合蛋白或缀合物。

111、本发明提供了根据如本文所述的cdr1、cdr2、fr1、fr2、fr3和fr4中一种或多种的序列，在产生用于结合至nfp2x7受体的抗原结合蛋白中的用途。

112、本发明提供了如本文所述的抗原结合蛋白或cdr和/或fr序列，在产生对nfp2x7受体具有增加的亲和力的抗nfp2x7受体抗原结合蛋白中的用途。

113、本发明提供了从如本文所述的抗原结合蛋白或cdr和/或fr序列的突变产生的核酸分子的文库，其中所述文库中的至少一种核酸分子编码用于结合至nfp2x7受体的抗原结合蛋白。

114、本发明提供了用于产生用于结合至如本文所述的nfp2x7受体的抗原结合蛋白的方法，其包括在如本文所述的细胞或动物中表达如本文所述的核酸。

115、本发明的抗原结合蛋白的功能特征将用于对本发明的抗体进行必要的修改。

116、如本文所述的抗原结合蛋白可以是纯化的、基本上纯化的、分离的和/或重组的。

117、本发明的抗原结合蛋白可以是取自表达本发明的抗原结合蛋白的杂交瘤已在其中生长的培养基的上清液的一部分。

118、本发明提供了用于预防或治疗个体中与nfp2x7的表达相关联的病况或疾病的方法，其包括以下步骤：将如本文所述的抗原结合蛋白、免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab、scfv、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、双抗体、三抗体、线性抗体、单链抗体分子、或多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物提供给需要对所述病况或疾病进行治疗的个体。与nfp2x7的表达相关联的疾病或病况优选是癌症。

119、在另一个方面，本发明还提供了治疗或预防受试者中的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本发明的抗原结合蛋白，从而治疗或预防受试者中的癌症。如本文所用，治疗癌症的方法包括抑制、预防或最小化癌症的扩散或进展的方法，包括抑制或预防癌症的转移。

120、在另一个方面，本发明还提供了本发明的抗原结合蛋白在制备用于治疗或预防受试者中的癌症的药物中的用途。

121、在另一个方面，本发明提供了抗原结合蛋白或包含本发明的抗原结合蛋白的药物组合物，其用于治疗或预防受试者中的癌症。

122、如本文所用，除上下文另有要求之处之外，术语“包含”和该术语的变体，例如“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”，并不旨在排除进一步的添加剂、组分、整数或步骤。术语“包含(comprising)”和“包括(including)”可互换地使用。

123、本发明的进一步的方面以及前面的段落中所描述的方面的进一步的实施方案将从通过实施例并提及附图的方式给出的以下说明而变得显而易见。

124、序列信息

125、表1：序列信息

126、

127、

128、

129、

130、

131、

132、

133、

技术实现思路

0、概述和定义

1、在整个本说明书中，除非另有具体说明或上下文另有要求，应将提及单个步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组应理解为涵盖一个和复数个(即一个或多个)这些步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组。因此，如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该、所述(the)”包括复数方面，反之亦然。例如，提及“一个(a)”包括单个以及两个或更多个；提及“一个(an)”包括单个以及两个或更多个；提及“该、所述(the)”包括单个以及两个或更多个等等。

2、本领域技术人员将理解，本发明易于进行除了具体描述的那些之外的变化和修改。将理解，本发明包括所有此类变化和修改。本发明还包括本说明书中单独地或集体地提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或多个所述步骤或特征的所有组合。

3、本领域技术人员将认识到，与本文所述的那些相似或等同的许多方法和材料可以用于本发明的实践中。本发明决不限于所描述的方法和材料。

4、本文提及的所有专利和出版物均通过引用以其整体并入。

5、本发明不限于本文所述的具体实例的范围，这些具体实例仅旨在出于例证的目的。功能等同的产品、组合物和方法显然在本发明的范围之内。

6、出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且只要适当，以单数使用的术语都还将包括复数，反之亦然。如果所示的任何定义与通过引用并入本文的任何文件相冲突，那么应当使用下面所示的定义。

7、除非另有明确定义，否则应当将本文所用的所有技术和科学术语理解为具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中的)。

8、除非另有指示，否则本公开中所用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员众所周知的标准程序。此类技术在以下来源中的整个文献中进行了描述和解释，这些来源诸如：j.perbal,apractical guide to molecular cloning,john wiley andsons(1984),j.sambrook等人molecular cloning:alaboratory manual,cold springharbour laboratory出版社(1989),t.a.brown(编辑),essential molecular biology:apractical approach,volumes 1and 2,irl出版社(1991),d.m.glover和b.d.hames(编辑),dna cloning:apractical approach,volumes 1-4,irl出版社(1995和1996),以及f.m.ausubel等人(编辑),current protocols in molecular biology,greenepub.associates and wiley-interscience(1988,包括至今的所有更新),ed harlow和david lane(编辑)antibodies:alaboratory manual,cold spring harbour laboratory,(1988),以及j.e.coligan等人(编辑)current protocols in immunology,john wileyand sons(包括至今的所有更新)。

9、本文的可变区及其部分、免疫球蛋白、抗体及其片段的描述和定义可通过以下文献中的讨论进一步阐明：kabat sequences of proteins of immunological interest,national institutes of health,bethesda,md.,1987和1991,bork等人,jmol.biol.242,309-320,1994,chothia和lesk j.mol biol.196:901 -917,1987,chothia等人nature342,877-883,1989,martin(“enhanced chothia”；mol immunol.(2008)45:3832–9；和/或al-lazikani等人,j mol biol 273,927-948,1997。

10、术语“和/或”，例如应当将“x和/或y”理解为意指“x和y”或“x或y”，并且应将其理解为两种含义或任一含义提供了明确支持。

11、如本文所用，应当将术语“衍生自”理解为指示可以从特定源获得的指定的整体，尽管不必直接从该源获得。

12、“嘌呤能受体”通常指将嘌呤(例如atp)作为配体的受体。

13、“p2x7受体”通常是指从三个蛋白质亚基或单体形成的嘌呤能受体，其中至少一个单体具有基本上如seq id no:17中所示的氨基酸序列：

14、mpaccscsdvfqyetnkvtriqsmnygtikwffhviifsyvcfalvsdklyqrkepvissvhtkvkgiaevkeeivengvkklvhsvfdtadytfplqgnsffvmtnflktegqeqrlcpeyptrrtlcssdrgckkgwmdpqskgiqtgrcvvyegnqktcevsawcpieaveeaprpallnsaenftvliknnidfpghnyttrnilpglnitctfhktqnpqcpifrlgdifretgdnfsdvaiqggimgieiywdcnldrwfhhcrpkysfrrlddkttnvslypgynfryakyykennvekrtlikvfgirfdilvfgtggkfdiiqlvvyigstlsyfglaavfidflidtyssnccrshiypwckccqpcvvneyyyrkkcesivepkptlkyvsfvdeshirmvnqqllgrslqdvkgqevprpamdftdlsrlplalhdtppipgqpeeiqllrkeatprsrdspvwcqcgsclpsqlpeshrcleelccrkkpgacittselfrklvlsrhvlqflllyqepllaldvdstnsrlrhcayrcyatwrfgsqdmadfailpsccrwrirkefpksegqysgfkspy

15、“p2x7受体”可以是如下所述的功能性或非功能性受体。“p2x7受体”涵盖p2x7受体的天然存在的变体，例如，其中p2x7单体是剪接变体、等位基因变体和同工型，其包括形成p2x7受体的单体的天然存在的截短形式或分泌形式(例如，由胞外域序列或其截短形式组成的形式)、天然存在的变体形式(例如，可变剪接形式)和天然存在的等位基因变体。在本发明的某些实施方案中，本文公开的天然序列p2x7单体多肽是包含seq id no:17中所示的全长氨基酸序列的成熟或全长天然序列多肽。在某些实施方案中，p2x7受体可以具有经修饰的氨基酸序列，例如可以取代、缺失seq id no:17中所示的序列中的各个氨基酸，或可以插入残基。

16、“功能性p2x7受体”通常是指具有用于与atp结合的结合位点或裂口的p2x7受体的形式。当与atp结合时，受体形成孔样结构，这使钙离子能够进入细胞质中，其后果之一可以是程序性细胞死亡。在正常内稳态中，功能性p2x7受体的表达通常仅限于经历程序性细胞死亡的细胞，诸如胸腺细胞、树突状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和单核细胞。红细胞上也可以有一些功能性p2x7受体的表达。

17、“功能障碍p2x7受体”(也称为“非功能性”或(nf)p2x7)是具有受损的对atp的反应，使得在生理条件下不能够形成凋亡孔的p2x7受体。功能障碍p2x7受体或(nfp2x7受体)通常指其中一个或多个单体在pro210(根据seq id no:17)处具有顺式异构化的p2x7受体形式。异构化可以源于导致单体的错误折叠的任何分子事件，包括例如单体一级序列的突变或异常的翻译后加工。异构化的后果之一是受体不能够与atp结合，或者以其他方式以比atp和在pro210处不包含异构化的受体之间观察到的亲和力更低的亲和力与atp结合。在这种情况下，受体不能够形成孔，并且这限制了钙离子可以进入胞质溶胶的程度。功能障碍p2x7受体在广泛范围的上皮癌、间充质癌、神经癌、生发癌(germinal cancer)和造血癌上表达。如本文所用，优选地将功能障碍p2x7理解为是具有受损的对atp的响应使得其在正常生理条件下不能够形成凋亡孔的p2x7受体。如本文所用，术语“功能障碍p2x7受体”可以与术语“非功能性的p2x7受体”或“nfp2x7受体”可互换地使用。

18、“癌症相关联的p2x7受体”通常是在癌细胞(包括肿瘤前期细胞、肿瘤细胞、恶性细胞、良性细胞或转移性细胞)上发现，但不在非癌症或正常细胞上发现的p2x7受体。

19、术语“e200”、“e300”和“复合”表位指存在于功能障碍p2x7受体上的特定表位，其中一个或多个表位被本发明的抗原结合蛋白结合。“e200表位”通常指具有序列ghnyttnilpglnitc(seq id no:18)的表位。“e300表位”通常指具有序列kyykennvekrtlik(seq id no:19)的表位。“复合表位”通常指从e200表位和e300表位或这些表位的部分并置而形成的表位。包含e200表位和e300表位的复合表位的实例是ghnyttrnilpgagakyykennvek(seq id no:20)。

20、术语“抗p2x7受体抗体”或“结合至p2x7受体的抗体”是指能够以足够的亲和力结合p2x7受体的抗体，使得该抗体可用作靶向p2x7受体(通常是非功能性的p2x7受体或癌症相关联的p2x7受体)中的诊断剂和/或治疗剂。优选地，p2x7受体抗体与不相关蛋白质的结合的程度小于如通过例如放射免疫测定(ria)、酶联免疫吸附测定(elisa)、biacore或流式细胞术所测得的抗体与p2x7受体的结合的约10％。在某些实施方案中，结合至p2x7受体的抗体具有<1μm、<100nm、<10nm、<1nm或<0.1nm的解离常数(kd)。抗nfp2x7受体抗体通常是具有一些或全部这些血清学特征并且结合至功能障碍p2x7受体但不结合至功能性p2x7受体的抗体。

21、术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是由于其起源或衍生来源而与在其天然状态下伴随其的天然相关联的组分不相关联的蛋白质或多肽；其基本上不含同一来源的其他蛋白质。可以使用本领域已知的蛋白质纯化技术通过分离使蛋白质基本上不含天然相关联的组分或基本上纯化。“基本上纯化的”意指蛋白质基本上不含污染剂，例如至少约70％或75％或80％或85％或90％或95％或96％或97％或98％或99％不含污染剂。

22、术语“重组”应理解为意指人工遗传重组的产物。相应地，在包含抗体抗原结合结构域的重组蛋白的情况下，该术语不涵盖受试者体内天然存在的抗体，其是b细胞成熟期间发生的天然重组的产物。然而，如果此类抗体是分离的，则其被考虑是包含抗体抗原结合结构域的分离的蛋白质。相似地，如果使用重组方式分离并表达编码蛋白质的核酸，那么所得蛋白质是包含抗体抗原结合结构域的重组蛋白。重组蛋白还涵盖当其在(例如表达其的)细胞、组织或受试者内时通过人工重组方式表达的蛋白。

23、术语“蛋白质”应理解为包括单个多肽链(即通过肽键连接的一系列连续氨基酸)或彼此共价或非共价连接的一系列多肽链(即，多肽复合物)。例如，一系列多肽链可以使用合适的化学键或二硫键共价连接。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德华力和疏水相互作用。蛋白质可包含一种或多种非天然氨基酸。

24、术语“多肽”或“多肽链”将从前述段落理解为意指通过肽键连接的一系列连续氨基酸。

25、如本文所用，术语“抗原结合结构域”应理解为意指能够特异性结合至抗原的抗体区，即vh或vl或包含vh和vl两者的fv。抗原结合结构域不需要是在整个抗体的背景下，例如，其可以是分离的(例如，结构域抗体)或以另一种形式，例如，如本文所述，诸如scfv。

26、出于本公开的目的，术语“抗体”包括能够凭借fv之内含有的抗原结合结构域特异性结合至一种或几种紧密相关的抗原的蛋白质。该术语包括四链抗体(例如，两条轻链和两条重链)、重组或修饰的抗体(例如，嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、cdr移植抗体、灵长类化抗体、去免疫化抗体、同人源化抗体、半抗体、双特异性抗体)。

27、抗体通常包含恒定结构域，其可排列成恒定区或恒定片段或可结晶片段(fc)。抗体的示例性形式包含四链结构作为其基本单位。全长抗体包含共价连接的两条重链(约50至70kd)和两条轻链(每条约23kda)。轻链通常包含可变区(如果存在)和恒定结构域，并且在哺乳动物中是κ轻链或者λ轻链。重链通常包含可变区和通过铰链区与额外的恒定结构域连接的一个或两个恒定结构域。哺乳动物的重链是以下类型之一：α、δ、ε、γ或μ。每条轻链还与重链之一共价连接。例如，两条重链以及重链和轻链通过链间二硫键以及通过非共价相互作用保持在一起。不同类型的抗体的链间二硫键的数量可以不同。每条链具有n端可变区(vh或vl，其中每个长度为约110个氨基酸)和c末端处的一个或多个恒定结构域。轻链的恒定结构域(cl，长度为约110个氨基酸)与重链的第一个恒定域(ch1，长度为330至440个氨基酸)对齐并通过二硫键键合。轻链可变区与重链的可变区对齐。抗体重链可以包含2个或更多个额外的ch结构域(诸如ch2、ch3等等)并且可以包含ch1和ch2恒定结构域之间的铰链区。抗体可以是任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚型。在一个实例中，抗体是鼠(小鼠或大鼠)抗体或灵长类(诸如人)抗体。在一个实例中，抗体重链缺少c末端赖氨酸残基。在一个实例中，抗体是人源化的、同人源化的、嵌合的、cdr移植的或去免疫化的。

28、术语“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”可互换地使用，以指以其基本上完整的形式的抗体，这与抗体的抗原结合片段相反。具体来说，整个抗体包括具有重链和轻链的那些抗体，其包括fc区。恒定结构域可以是野生型序列恒定结构域(例如，人野生型序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。

29、如本文所用，“可变区”是指如本文所定义的抗体的轻链和/或重链的部分，其能够特异性结合至抗原，并且包括互补决定区(cdr)的氨基酸序列；即cdr1、cdr2和cdr3以及框架区(fr)。例如，可变区包含三个或四个fr(例如，fr1、fr2、fr3和任选的fr4)连同三个cdr。vh指重链的可变区。vl指轻链的可变区。

30、如本文所用，术语“互补决定区”(同cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)指抗体可变区的氨基酸残基，其存在对特异性抗原结合有主要贡献。每个可变区(vh或vl)通常具有标识为cdr1、cdr2和cdr3的三个cdr。vh的cdr在本文中还分别称为cdr h1、cdr h2和cdr h3，其中cdr h1对应于vh的cdr1，cdr h2对应于vh的cdr2并且cdr h3对应于vh的cdr3。同样的，vl的cdr在本文中也分别称为cdr l1、cdr l2和cdr l3，其中cdr l1对应于vl的cdr1，cdr l2对应于vl的cdr2并且cdr l3对应于vl的cdr3。在一个实例中，根据kabat sequences of proteins ofimmunological interest，美国国立卫生研究院，bethesda，md.，1987和1991(本文也称为“kabat编号系统”)来定义分配给cdr和fr的氨基酸位置。在另一个实例中，根据增强型chothia编号方案(http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html)来定义分配给cdr和fr的氨基酸位置。本发明不限于如由kabat编号系统所定义的fr和cdr，而是包括所有编号系统，这包括规范编号系统或chothia和lesk j.mol.biol.196:901-917,1987；chothia等人,nature342:877-883,1989；和/或al-lazikani等人,j.mol.biol.273:927-948,1997；thonnegher和plükthun j.mol.biol.309:657-670,2001的编号系统；或giudicelli等人,nucleicacids res.25:206-211 1997中讨论的imgt系统。

31、在一个实例中，根据kabat编号系统定义cdr。任选地，根据kabat编号系统的重链cdr2不包含本文列出的五个c末端氨基酸，或者这些氨基酸中的任何一个或多个用另一个天然存在的氨基酸替代。在这方面，padlan等人,faseb j.,9:133-139,1995证实了重链cdr2的五个c末端氨基酸通常不涉及抗原结合。

32、“框架区”(fr)是除了cdr残基以外的那些可变区残基。vh的fr在本文中还分别称为fr h1、fr h2、fr h3和frh4，其中fr h1对应于vh的fr1，fr h2对应于vh的fr2，fr h3对应于vh的fr3，并且fr h4对应于vh的fr4。同样，vl的fr在本文中分别称为fr l1、fr l2、fr l3和frl4，其中fr l1对应于vl的fr1，frl2对应于vl的fr2，fr l3对应于vl的fr3，并且fr l4对应于vl的fr4。

33、如本文所用，术语“fv”应理解为意指任何蛋白质，无论是由多个多肽还是单个多肽组成，其中vl和vh缔合并形成具有抗原结合结构域(即，能够特异性地结合与抗原结合)的复合物。形成抗原结合结构域的vh和vl可以在单个多肽链中或在不同的多肽链中。此外，本发明的fv(以及本发明的任何蛋白质)可以具有可以结合或可以不结合相同的抗原的多个抗原结合结构域。该术语应当理解为涵盖直接衍生自抗体的片段以及对应于使用重组方法产生的此类片段的蛋白质。在一些实例中，vh不连接至重链恒定结构域(ch)1和/或vl不连接至轻链恒定域(cl)。示例性的含有fv的多肽或蛋白质包括fab片段、fab’片段、f(ab’)、scfv、双抗体、三抗体、四抗体或更高级复合物，或与恒定区或其结构域(例如ch2或ch3结构域)连接的任何上述物，例如微型抗体(minibody)。

34、“fab片段”由免疫球蛋白的单价抗原结合片段组成，并且可以通过以下步骤产生：用酶木瓜蛋白酶消化整个抗体，以产生由完整轻链和重链的一部分组成的片段，或者可以使用重组方法产生。抗体的“fab’片段”可以通过以下步骤获得：用胃蛋白酶处理整个抗体然后还原，以产生由完整轻链和包含vh和单个恒定结构域的重链的一部分组成的分子。每个以此方式处理的抗体获得两个fab’片段。fab’片段还可以通过重组方式产生。抗体的“f(ab’)2片段”由通过两个二硫键保持在一起的两个fab’片段的二聚体组成，并且通过用酶胃蛋白酶处理整个抗体分子而不进行后续的还原来获得。“fab2”片段是包含使用例如亮氨酸拉链或ch3结构域连接的两个fab片段的重组片段。“单链fv”或“scfv”是含有抗体的可变区片段(fv)的重组分子，其中轻链的可变区和重链的可变区通过合适的、柔性的多肽接头共价键连接。

35、如本文所用，关于抗原结合蛋白或其抗原结合结构域与抗原的相互作用的术语“结合”意指该相互作用取决于该抗原上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。例如，抗体识别并结合至特异性的蛋白质结构，而不是通常地结合至蛋白质。如果抗体结合至表位“a”，则在含有标记的“a”和蛋白质的反应中，含有表位“a”(或游离的、未标记的“a”)的分子的存在将减少结合至抗体的标记的“a”的量。

36、如本文所用，术语“特异性结合(specifically bind)”或“特异性结合(bindspecifically)”应理解为意指相比本发明的抗原结合蛋白与替代性的抗原或细胞反应或缔合，其更频繁地、更迅速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力与特定抗原或表达该特定抗原的细胞进行反应或缔合。例如，相比抗原结合蛋白结合其他相关分子诸如其他嘌呤能受体，特别是相比其结合功能性p2x7受体，其以实质上更大的亲和力(例如1.5倍或2倍或5倍或10倍或20倍或40倍或60倍或80倍至100倍或150倍或200倍)结合功能障碍p2x7受体。在本发明的实例中，“特异性结合”至功能障碍p2x7受体的抗原结合蛋白相较于其结合至功能性p2x7受体的亲和力具有至少1.5倍或2倍或更大(例如5倍或10倍或20倍、50倍或100倍或200倍)的亲和力。通常，但不必然，提及结合意指特异性结合，并且每个术语应理解为为其他术语提供明确的支持。

37、如本文所用，术语“不可检测地结合”应理解为意指抗原结合蛋白例如抗体以低于背景10％、或8％或6％或5％的水平与候选抗原结合。背景可以是在不存在蛋白质的条件下和/或存在阴性对照蛋白(例如同种型对照抗体)的条件下检测到的结合信号的水平和/或在存在阴性对照抗原的条件下检测到的结合水平。使用生物传感器分析(例如biacore)检测结合的水平，其中将抗原结合蛋白固定并与抗原接触。

38、如本文所用，术语“不显著结合”应理解为意指本发明的抗原结合蛋白与多肽的结合水平在统计上不显著高于背景，例如，在不存在抗原结合蛋白的条件下和/或存在阴性对照蛋白(例如同种型对照抗体)的条件下检测到的结合信号的水平和/或在存在阴性对照多肽的条件下检测到的结合水平。使用生物传感器分析(例如biacore或blitz)检测结合的水平，其中将抗原结合蛋白固定并与抗原接触。

39、如本文所用，术语“表位”(同“抗原决定簇”)应理解为意指包含抗体的抗原结合结构域的抗原结合蛋白所结合的功能障碍p2x7受体的区。除非另外定义，否则该术语不必然限于抗原结合蛋白进行接触的特异性残基或结构。例如，该术语包括跨越抗原结合蛋白所接触的氨基酸的区和该区之外的5-10个(或更多)或2-5个或1-3个氨基酸。在一些实例中，表位包含一系列不连续的氨基酸，当抗原结合蛋白折叠时，这些氨基酸处于彼此靠近的位置，即“构象表位”。技术人员还将意识到术语“表位”不限于肽或多肽。例如，术语“表位”包含分子的化学活性表面基团，诸如糖侧链、磷酰基侧链或磺酰基侧链，并且在某些实例中，可以具有特异性的三维结构特征和/或特异性的电荷特征。

40、如本文所用，术语“预防(preventing)”、“预防(prevent)”或“预防(prevention)”包括施用本发明的抗原结合蛋白，从而停止或阻碍病况的至少一种症状的发展。该术语还涵盖治疗缓解中的受试者以预防或阻碍复发。

41、如本文所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括施用本文所述的抗原结合蛋白，从而减少或消除特定疾病或病况的至少一种症状。

42、如本文所用，术语“受试者”应理解为意指包括人类的任何动物，例如哺乳动物。示例性的受试者包括但不限于人和非人灵长类。例如，受试者是人。

43、如本文所用，术语“工程化细胞”和“遗传修饰的细胞”可以可互换地使用。该术语意指含有和/或表达外来基因或核酸序列，其反过来修饰细胞或其后代的基因型或表型。

44、抗体

45、在一个实例中，根据任一实例的本文所述的抗原结合蛋白是抗体。

46、用于生成抗体的方法是本领域已知的和/或描述于harlow和lane(编辑)antibodies:alaboratory manual,cold spring harbor laboratory,(1988)中。通常，在此类方法中，将功能障碍p2x7受体或其区(例如，胞外区)或其免疫原性片段或表位或表达和展示其(即，免疫原)的细胞施用于非人动物，例如小鼠、鸡、大鼠、兔、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪，该功能障碍p2x7受体任选地与任何合适的或期望的载剂、佐剂、或药学上可接受的赋形剂进行配制。免疫原可以鼻内、肌内、皮下、静脉内、皮内、腹膜内或通过其他已知途径施用。

47、多克隆抗体的产生可以通过在免疫后在各个点处对所免疫的动物的血液取样来监测。如果需要达到期望的抗体滴度，可以给予一次或多次进一步的免疫。重复增强和滴定的过程，直到达到合适的滴度。当获得期望水平的免疫原性，对所免疫的动物进行放血并分离和储存血清，和/或将该动物用于生成单克隆抗体(mab)。

48、单克隆抗体是本发明所考虑的抗体的一种示例性形式。术语“单克隆抗体”或“mab”指能够结合相同抗原(例如结合抗原之内的相同表位)的同质抗体群体。就抗体的来源或其制备方式而言，该术语并不旨在是限制的。

49、对于mab的生产，可以使用多种已知技术中的任何一种，例如us4196265或上述harlow和lane(1988)中示例的程序。

50、例如，在足以刺激产生抗体的细胞的条件下，用免疫原免疫合适的动物。啮齿类例如兔、小鼠和大鼠是示例性动物。经基因工程化以表达人抗体(例如，不表达鼠抗体)的小鼠也可用于生成本发明的抗体(例如，如wo2002/066630中所述)。

51、免疫之后，选择具有产生抗体的潜力的体细胞，具体来说是b淋巴细胞(b细胞)用于mab生成方案。这些细胞可以从脾、扁桃体或淋巴结的活检中获得，或从外周血样品中获得。然后，来自所免疫的动物的b细胞与永生骨髓瘤细胞的细胞融合，该细胞通常衍生自与用免疫原进行免疫的动物相同的种。

52、通过在包含阻断组织培养基中的核苷酸从头合成的药剂的选择性培养基中进行培养来扩增杂交体。示例性药剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。

53、对扩增的杂交瘤进行针对抗体特异性和/或滴度的功能性选择，诸如通过流式细胞术和/或免疫组织化学和/或免疫测定(例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬斑测定、斑点免疫测定等等)。

54、或者，使用abl-myc技术(neoclone，madisonwi53713，usa)来产生分泌mab的细胞系(例如，如largaespada等人,j.immunol.methods.197:85-95,1996中所述)。

55、还可以通过筛选展示文库，例如噬菌体展示文库来产生或分离抗体，例如如us6300064和/或us5885793中所述。例如，本发明人已从噬菌体展示文库完整地分离出人抗体。

56、本发明的抗体可以是合成抗体。例如，抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、同人源化抗体、灵长类化抗体或去免疫化抗体。

57、含有抗体结合结构域的蛋白质

58、单结构域抗体

59、在一些实例中，本发明的蛋白质是或包含单结构域抗体(其与术语“结构域抗体”或“sdab”可互换地使用)。单结构域抗体是包含抗体的重链可变区的全部或一部分的单个多肽链。在某些实例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(domantis，inc.，waltham，ma；参见例如us6248516)。

60、双抗体、三抗体、四抗体

61、在一些实例中，本发明的蛋白质是或包含双抗体、三抗体、四抗体或更高级的蛋白质复合物，诸如wo98/044001和/或wo94/007921中所述的那些。

62、例如，双抗体是包含两条缔合的多肽链的蛋白质，每条多肽链包含结构vl-x-vh或vh-x-vl，其中vl是抗体轻链可变区，vh是抗体重链可变区，x是包含不足以允许单个多肽链中的vh和vl缔合(或形成fv)的残基的接头或不存在，并且其中一条多肽链的vh与另一多肽链的vl结合以形成抗原结合结构域，即形成能够特异性结合一个或多个抗原的fv分子。在每条多肽链中，vl和vh可以相同，或者在每条多肽链中，vl和vh可以不同，从而形成双特异性双抗体(即，包含具有不同特异性的两个fv)。

63、单链fc(scfv)

64、技术人员将意识到，scfv包含单条多肽链中的vh和vl区以及vh和vl之间的多肽接头，其使scfv能够形成用于抗原结合(即，用于单条多肽链的vh和vl多肽链彼此缔合以形成fv)的期望结构。例如，接头包含超过12个氨基酸残基，其中(gly4ser)3是对scfv更有利的接头之一。

65、本发明还考虑了二硫化物稳定化的fv(或difv或dsfv)，其中将单个半胱氨酸残基引入到vh的fr和vl的fr中，并且半胱氨酸残基通过二硫键连接以产生稳定的fv。

66、替代性地或额外地，本发明涵盖二聚体scfv，即包含通过非共价连接或共价连接例如，通过亮氨酸拉链结构域连接的两个scfv分子(例如衍生自fos或jun)的蛋白质。替代性地，两个scfv通过具有足够长度的肽接头连接以允许两个scfv形成并结合抗原，例如，如us20060263367中所述。

67、重链抗体

68、重链抗体在结构上与许多其他形式的抗体不同，因为它们包含重链，但不包含轻链。因此，这些抗体也称为“仅重链抗体”。重链抗体在例如骆驼科和软骨鱼(也称为ignar)中找到。

69、天然存在的重链抗体中存在的可变区通常在骆驼科抗体中称为“vhh结构域”，并且在ignar中称为v-nar，以将它们与常规4链抗体中存在的重链可变区(其称为“vh结构域”)和与常规4链抗体中存在的轻链可变区(其称为“vl结构域”)进行区分。

70、来自骆驼科的重链抗体及其可变区以及用于它们的产生和/或分离和/或使用的方法的一般描述尤其在以下参考文献wo94/04678、wo97/49805和wo97/49805中找到。

71、来自软骨鱼的重链抗体及其可变区以及用于它们的产生和/或分离和/或使用的方法的一般描述尤其在wo2005/118629中找到。

72、其他抗体和包含其抗原结合结构域的蛋白质

73、本发明还涵盖其他抗体和包含其抗原结合结构域的蛋白质，诸如：

74、(i)“钥匙和孔”双特异性蛋白，如us5731168中所述的；

75、(ii)复共轭对配合物(heteroconjugate)蛋白，例如，如us4676980中所述的；

76、(iii)使用化学交联接头产生的复共轭对配合物蛋白，例如，如us4676980中所述的；

77、(iv)fab3(例如，如ep19930302894中所述的)。

78、在任何上述抗体结构中，蛋白质的结合结构域可以经由接头连接。例如，在scfv的情况下，vh和vl之间的接头可以是一个或多个氨基酸残基的组合，从而提供柔性接头。技术人员将熟悉要使用的合适的接头序列。在典型的实例中，接头由一个或多个甘氨酸残基和丝氨酸残基组成。在一个实例中，接头可包含序列g4s(即ggggs)等。接头还可以包含甘氨酸和丝氨酸残基的重复，诸如(g4s)3，但应当理解其上的任何变体也可以是合适的，诸如(g4s)3t。

79、蛋白质的突变

80、本发明还提供与本文公开的序列具有至少80％同一性的抗原结合蛋白或编码其的核酸。在一个实例中，本发明的抗原结合蛋白或核酸包含与本文公开的序列至少约85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的序列。

81、替代性地或额外地，抗原结合蛋白包含与根据任何实例的如本文所述的vh或vl的cdr至少约80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的cdr(例如，三个cdr)。

82、在另一实例中，本发明的核酸包含与以下序列至少约80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的序列：编码根据任何实例的如本文所述的具有功能的抗原结合蛋白的序列。本发明还涵盖编码本发明的抗原结合蛋白的核酸，其由于遗传密码的简并性而不同于本文例示的序列。

83、核酸或多肽的％同一性通过gap(needleman和wunsch.mol.biol.48,443-453,1970)分析(gcg程序)，其中空位创建罚分＝5，并且空位延长罚分＝0.3。查询序列的长度至少为50个残基，并且gap分析在至少50个残基的区上比对两个序列。例如，查询序列的长度至少为100个残基并且gap分析在至少100个残基的区上比对两个序列。例如，两个序列在其整个长度上进行比对。

84、本发明还考虑了在严格杂交条件下与编码本文所述的抗原结合位点的核酸杂交的核酸。“中等严格”在本文中定义为在2x ssc缓冲液、0.1％(w/v)sds中，在45℃至65℃范围内的温度或等同条件下进行的杂交和/或洗涤。“高严格”在本文中定义为在0.1x ssc缓冲液、0.1％(w/v)sds或较低的盐浓度中，并且在至少65℃的温度下或等同条件下进行的杂交和/或洗涤。本文对严格的特定水平的提及涵盖使用本领域技术人员已知的除ssc之外的洗涤/杂交溶液的等同条件。例如，用于计算其中双链的核酸的链将解离的温度(也称为熔解温度或tm)的方法是本领域已知的。与核酸的tm相似(例如，5℃以内或10℃以内)或等于核酸的tm的温度被考虑为高严格。中等严格将被考虑为在计算的核酸tm的10℃至20℃或10℃至15℃之内。

85、本发明还考虑了本发明的抗原结合蛋白的突变体形式，其包含与本文所示的序列相比的一个或多个保守氨基酸取代。在一些实例中，抗原结合蛋白包含10个或更少，例如9或8或7或6或5或4或3或2或1个保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基用具有相似侧链和/或亲水性(hydropathicity)和/或亲水性(hydrophilicity)的氨基酸残基进行替换的取代。

86、本领域已经鉴定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族，其包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支化侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。水亲性指数(hydropathic index)描述于例如kyte和doolittle j.mol.biol.,157:105-132,1982中，并且亲水性指数(hydrophylic index)描述于例如us4554101中。

87、本发明还考虑了非保守氨基酸变化。例如，特别感兴趣的是用另一种带电荷的氨基酸和中性或带正电荷的氨基酸取代带电荷的氨基酸。在一些实例中，抗原结合蛋白包含10个或更少个，例如9或8或7或6或5或4或3或2或1个非保守氨基酸取代。

88、在一个实例中，突变发生在本发明的抗原结合蛋白的抗原结合结构域的fr之内。在另一个实例中，突变发生在本发明的抗原结合蛋白的cdr之内。

89、用于产生抗原结合蛋白的突变形式的示例性方法包括：

90、dna的诱变(thie等人,methods mol.biol.525:309-322,2009)或rna的诱变(kopsidas等人,immunol.lett.107:163-168,2006；kopsidas等人bmc biotechnology,7:18,2007；和wo1999/058661)；

91、将编码多肽的核酸引入突变子细胞，例如xl-1red、xl-muts和xl-muts-kanr细菌细胞(stratagene)；

92、dna改组，例如，如stemmer,nature 370:389-91,1994中所公开的；和

93、定点诱变，例如，如dieffenbach(编)和dveksler(编)(in:pcr primer:alaboratory manual,cold spring harbor laboratories,ny,1995)中所述的。

94、用于确定本发明的突变体抗原结合蛋白的生物活性的示例性方法对于技术人员来说是显而易见的和/或在本文中描述，例如抗原结合。例如，本文描述了用于确定抗原结合、结合的竞争性抑制、亲和力、缔合、解离和治疗疗效的方法。

95、恒定区

96、本发明涵盖本文所述的包含抗体的恒定区的抗原结合蛋白和/或抗体。这包括与fc融合的抗体的抗原结合片段。

97、可用于产生本发明的蛋白质的恒定区的序列可以从许多不同来源获得。在一些实例中，蛋白质的恒定区或其部分衍生自人抗体。恒定区或其部分可以衍生自任何抗体类别，包括igm、igg、igd、iga和ige，以及任何抗体同种型，包括igg1、igg2、igg3和igg4。在一个实例中，恒定区是人同种型igg4或稳定化的igg4恒定区。

98、在一个实例中，例如与天然或野生型人igg1或igg3 fc区相比，恒定区的fc区具有降低的诱导效应功能的能力。在一个实例中，效应功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和/或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)。用于评估含有fc区的蛋白质的效应功能水平的方法是本领域已知的和/或本文描述的。

99、在一个实例中，fc区是igg4 fc区(即，来自igg4恒定区)，例如人igg4fc区。合适的igg4 fc区的序列对于技术人员来说将是显而易见的和/或可从公开可获得的数据库(例如，可从美国国家生物技术信息中心获得)中获得。

100、在一个实例中，恒定区是稳定化的igg4恒定区。术语“稳定化的igg4恒定区”应理解为意指已经经过修饰以减少以下的igg4恒定区：fab臂交换或进行fab臂交换的倾向或半抗体的形成或形成半抗体的倾向。“fab臂交换”指人igg4的一种蛋白质修饰，其中igg4重链和附着的轻链(半分子)调换为来自另一个igg4分子的重链-轻链对。因此，igg4分子可以获得识别两种不同抗原的两个不同的fab臂(产生双特异性分子)。fab臂交换在体内天然发生，并且可以通过纯化的血细胞或还原剂，诸如还原型谷胱甘肽进行体外诱导。当igg4抗体解离形成两个分子(每个分子含有单条重链和单条轻链)时，“半抗体”就形成。

101、在一个实例中，根据kabat的系统(kabat等人,sequences of proteins ofimmunological interest washington dc united states department of health andhuman services,1987和/或1991)，稳定化的igg4恒定区包含在铰链区的位置241处的脯氨酸。该位置对应于根据eu编号系统(kabat等人,sequences of proteins ofimmunological interest washington dc united states department of health andhuman services,2001和edelman等人,proc.natl.acad.usa,63,78-85,1969)的铰链区的位置228。在人igg4中，该残基通常是丝氨酸。用丝氨酸取代脯氨酸后，igg4铰链区包含序列cppc。在这点上，技术人员将意识到“铰链区”是抗体重链恒定区的脯氨酸富集部分，其连接赋予抗体的两个fab臂上的流动性的fc和fab区。铰链区包括涉及重链间二硫键的半胱氨酸残基。通常将其定义为根据kabat的编号系统从人igg1的glu226到pro243的延伸。其他igg同种型的铰链区可以通过将形成重链间二硫(ss)键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在相同位置来与igg1序列进行比对(参见例如wo2010/080538)。

102、稳定化的igg4抗体的额外的实例是其中人igg4的重链恒定区中位置409处(根据eu编号系统)的精氨酸用赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸取代的抗体(例如，如wo2006/033386中所述)。恒定区的fc区可以额外地或替代性地在对应于位置405处(根据eu编号系统)包含选自由以下组成的组的残基：丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。任选地，铰链区在位置241处包含脯氨酸(即，cppc序列)(如上所述)。

103、在另一个实例中，fc区是经修饰以具有降低的效应功能的区，即“非免疫刺激性fc区”。例如，fc区是在选自由268、309、330和331组成的组的一个或多个位置处包含取代的igg1 fc区。在另一个实例中，fc区是包含以下变化e233p、l234v、l235a和g236的缺失中的一个或多个和/或以下变化a327g、a330s和p331s中的一个或多个的igg1 fc区(armour等人,eur jimmunol.29:2613-2624,1999；shields等人,j biol chem.276(9):6591-604,2001)。非免疫刺激性fc区的额外的实例描述于例如dall’acqua等人,j immunol.177:1129-1138 2006；和/或hezareh j virol；75:12161-12168,2001)。

104、在另一个实例中，fc区是嵌合fc区，例如包含来自igg4抗体的至少一个ch2结构域和来自igg1抗体的至少一个ch3结构域，其中fc区在选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸位置处包含取代：240、262、264、266、297、299、307、309、323、399、409和427(eu编号)(例如，如wo2010/085682中所述)。示例性取代包括240f、262l、264t、266f、297q、299a、299k、307p、309k、309m、309p、323f、399s和427f。

105、额外的修饰

106、本发明还考虑了对包含fc区或恒定区的抗体或抗原结合蛋白的额外的修饰。

107、例如，抗体包含一个或多个增加蛋白质的半衰期的氨基酸取代。例如，抗体包含fc区，该fc区包含增加fc区对新生儿fc区(fcrn)的亲和力的一或多个氨基酸取代。例如，fc区在较低ph(例如约ph 6.0)下对fcrn具有增加的亲和力，以促进在内体中的fc/fcrn结合。在一个实例中，与其在约ph7.4下的亲和力相比，fc区在约ph 6下具有增加的对fcrn的亲和力，这促进了细胞再循环后fc重新释放到血液中。这些氨基酸取代可通过减少血液的清除来延长蛋白质的半衰期。

108、示例性氨基酸取代包括根据eu编号系统的t250q和/或m428l或者t252a、t254s和t266f或者m252y、s254t和t256e或者h433k和n434f。额外的或替代性的氨基酸取代描述于例如us20070135620或us7083784中。

109、蛋白质产生

110、在一个实例中，根据任何实例的本文所述的抗原结合蛋白通过在足以产生该蛋白的条件下培养杂交瘤来产生，例如，如本文所述和/或如本领域已知的。

111、重组表达

112、在另一个实例中，根据任何实例的本文所述的抗原结合蛋白是重组的。

113、在重组蛋白的情况下，可以将编码该重组蛋白的核酸克隆到表达构建体或载体中，然后将其转染到宿主细胞中，宿主细胞例如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，诸如除此以外不产生该蛋白的猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人胚肾(hek)细胞或骨髓瘤细胞。用于表达蛋白质的示例性细胞是cho细胞、骨髓瘤细胞或hek细胞。实现这些结局的分子克隆技术是本领域已知的并且描述于例如以下文献中：ausubel等人,(编辑),current protocols in molecular biology,greene pub.associates andwiley-interscience(1988,包括至今的所有更新)或sambrook等人,molecular cloning:alaboratory manual,cold spring harbor laboratory press(1989)。多种克隆和体外扩增方法适合于构建重组核酸。产生重组抗体的方法也是本领域已知的，参见例如us4816567或us5530101。

114、分离后，将核酸可操作地插入连接至表达构建体或表达载体中的启动子，以进一步克隆(dna的扩增)或用于在无细胞系统中或在细胞中进行表达。

115、如本文所用，术语“启动子”应在其最广泛的背景中理解，并且包括基因组基因的转录调控序列，其包括精确转录起始所需的tata盒或起始元件，具有或不具有改变(例如响应于发育和/或外部刺激，或以组织特异性方式)核酸的表达的额外的调控元件(例如，上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)。在本文语境中，术语“启动子”还用于描述重组的、合成的或融合的核酸，或赋予、激活或增强与其可操作地连接的核酸的表达的衍生物。示例性启动子可以含有一个或多个特异性的调控元件的额外的拷贝，以进一步增强所述核酸的表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。

116、如本文所用，术语“可操作地连接至”意指将启动子相对于核酸定位，使得核酸的表达受该启动子控制。

117、许多用于在细胞中表达的载体是可获得的。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、编码蛋白质的序列(例如，衍生自本文提供的信息)、增强子元件、启动子和转录终止子序列。技术人员将意识到用于蛋白质的表达的合适的序列。示例性信号序列包括原核分泌信号(例如，pelb、碱性磷酸酶、青霉素酶、ipp或耐热肠毒素ii)、酵母分泌信号(例如，转化酶前导物、α因子前导物或酸性磷酸酶前导物)或哺乳动物分泌信号(例如，单纯疱疹病毒gd信号)。

118、在哺乳动物细胞中是活性的示例性启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(cmv-ie)、人延伸因子1-α启动子(ef1)、小核rna启动子(u1a和u1b)、α-肌球蛋白重链启动子、猿猴病毒40启动子(sv40)、劳斯肉瘤病毒启动子(rsv)、腺病毒主要晚期启动子、β-肌动蛋白启动子；杂合调节元件，其包含cmv增强子/β-肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子或其活性片段。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由sv40(cos-7，atcc crl 1651)转化的猴肾cv1系；人胚胎肾系(亚克隆用于在悬浮培养物生长中的293或293细胞)；乳仓鼠肾细胞(bhk、atcc ccl 10)；或中国仓鼠卵巢细胞(cho)。

119、适合于在酵母细胞(诸如例如选自包含毕赤酵母(pichia pastoris)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(s.pombe)的组的酵母细胞)中表达的典型启动子包括但不限于adh1启动子、gal1启动子、gal4启动子、cup1启动子、pho5启动子、nmt启动子、rpr1启动子或tef1启动子。

120、用于将分离的核酸或包含其的表达构建体引入到细胞中进行表达的方法是本领域技术人员已知的。用于给定细胞的技术取决于已知的成功技术。将重组dna引入到细胞中的方法包括显微注射、由deae-右旋糖酐介导的转染、由脂质体介导的转染(诸如通过使用lipofectamine(gibco,md,usa)和/或cellfectin(gibco,md,usa)、peg介导的dna摄取)、电穿孔和微粒轰击(诸如通过使用dna包被的钨或金颗粒(agracetusinc.，wi，usa)等。

121、用于产生蛋白质的宿主细胞可以在多种培养基中培养，这取决于所使用的细胞类型。商业上可获得的培养基诸如ham’s f10(sigma)、最低必需培养基((mem)，(sigma))、rpml-1640(sigma)和dulbecco’s modified eagle’s培养基((dmem),sigma))适合于培养哺乳动物细胞。用于培养本文所讨论的其他细胞类型的培养基是本领域已知的。

122、蛋白质的分离

123、用于分离蛋白质的方法是本领域已知的和/或本文描述的。

124、当抗原结合蛋白分泌到培养基中时，可以首先使用商业上可获得的蛋白质浓缩过滤器，例如amicon或millipore pellicon超滤单元来浓缩来自此类表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂诸如pmsf可以包括在任何前述步骤中以抑制蛋白酶解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。替代性地或额外地，可以将上清液从表达蛋白质的细胞中过滤和/或分离(例如使用连续离心)。

125、可以使用例如离子交换、羟基磷灰石层析、疏水相互作用层析、凝胶电泳、透析、亲和层析(例如蛋白a亲和层析或蛋白g层析)或上述方法的任何组合来纯化从细胞制备的抗原结合蛋白。这些方法是本领域已知的并且描述于例如wo99/57134或ed harlow和davidlane(编辑)antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,(1988)中。

126、技术人员还将意识到，可以修饰蛋白质以包括标签以促进纯化或检测，例如多组氨酸标签(例如六组氨酸标签)、或流感病毒血凝素(ha)标签、或猿病毒5(v5)标签、flag标签或谷胱甘肽s-转移酶(gst)标签。然后使用本领域已知的方法诸如亲和纯化来纯化所得蛋白质。例如，包含六组氨酸标签的蛋白质通过以下来纯化：将包含该蛋白质的样品与特异性结合固定在固体或半固体支撑物上的六组氨酸标签的镍-氨三乙酸(ni-nta)接触、洗涤样品以去除未结合的蛋白质，然后洗脱结合的蛋白质。替代性地或额外地，结合标签的配体或抗体用于亲和纯化方法。

127、测定抗原结合蛋白的结合

128、对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明的抗原结合蛋白结合功能障碍p2x7受体。用于评估与蛋白质的结合的方法是本领域已知的，例如，如scopes(在proteinpurification:principles and practice,第三版,springer verlag,1994中)中所述。此类方法通常涉及固定抗原结合蛋白并将其与标记的抗原(功能障碍p2x7受体)接触。洗涤以去除非特异性结合蛋白后，检测标记以及因此结合的抗原的量。当然，可以标记抗原结合蛋白并固定化抗原。也可以使用淘选型测定。替代性地或额外地，可以使用表面等离子体共振测定。

129、任选地，确定功能障碍p2x7受体或其表位的固定化抗原结合蛋白的解离常数(kd)、缔合常数(ka)和/或亲和常数(kd)。在一个实例中，功能障碍p2x7受体结合蛋白的“kd”或“ka”或“kd”通过放射性标记或荧光标记的功能障碍p2x7受体配体结合测定来测量。在“kd”的情况下，在存在未标记的功能障碍p2x7受体的滴定系列的条件下，该测定用最小浓度的标记的功能障碍p2x7受体或其表位平衡抗原结合蛋白。洗涤以除去未结合的功能障碍p2x7受体或其表位后，确定指示蛋白质的kd的标记的量。

130、根据另一个实例，kd、ka或kd通过使用表面等离子共振测定来测量，例如使用biacore表面等离子共振(biacore，inc.，piscataway，nj)与固定化功能障碍p2x7受体或其区或固定化抗原结合蛋白。

131、在一些实施方案中，p2x7受体的功能在被本发明的抗原结合蛋白、经修饰的受体或包含其的免疫物结合后可降低至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于99％。

132、待治疗的病况

133、本发明的抗原结合蛋白在制备用于治疗癌症的药物(例如抗体、抗体-药物缀合物)中特别有用，所述癌症具有在其细胞表面的功能障碍p2x7受体。

134、根据本发明的方法可以治疗的癌症的实例包括肿瘤前疾病和肿瘤疾病。广泛的实例包括乳腺肿瘤、结直肠肿瘤、腺癌、间皮瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、生殖细胞肿瘤、肝癌/胆管癌、癌、神经内分泌肿瘤、垂体肿瘤、小圆细胞肿瘤、鳞状细胞癌、黑色素瘤、非典型纤维黄色瘤、精原细胞瘤、非精原细胞瘤、基质(stromal)间质细胞肿瘤、支持细胞肿瘤、皮肤肿瘤、肾肿瘤、睾丸肿瘤、脑肿瘤、卵巢肿瘤、胃肿瘤、口腔肿瘤、膀胱肿瘤、骨肿瘤、宫颈肿瘤、食道肿瘤、喉肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、阴道肿瘤和wilm’s瘤。

135、特定的癌症的实例包括但不限于腺癌、腺瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、牙瘤(adontoma)、aids相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、囊性腺样癌、肾上腺皮质癌、不明原因性骨髓化生、脱发、肺泡软部分肉瘤、成釉细胞瘤、血管角化瘤、血管淋巴样增生伴嗜酸性粒细胞增多、血管瘤硬化、血管瘤病、aupd瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调毛细血管扩张症、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干胶质瘤、脑和中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、鳃原瘤(branchioma)、中枢神经系统肿瘤、类癌肿瘤、宫颈癌、儿童脑肿瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结直肠癌、皮肤t细胞淋巴瘤、癌(例如walker癌、基底细胞癌、基底鳞状癌、布朗-皮西二氏(brown-pearce)癌、导管癌、艾利希氏(ehrlich)癌、krebs 2癌、默克尔(merkel)细胞癌、粘液性癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳头状癌、硬质癌、细支气管癌、支气管癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)、癌肉瘤、宫颈发育不良、叶状囊肉瘤、牙骨质瘤、脊索瘤、迷芽瘤、软骨肉瘤、软骨母细胞瘤、颅咽管瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、导管癌、无性细胞瘤、内分泌癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼部：黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范可尼贫血、纤维瘤、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠道类癌、泌尿生殖系统癌症、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、妇科癌症、巨细胞肿瘤、神经节神经瘤、神经胶质瘤、血管球瘤、颗粒细胞瘤、性腺母细胞瘤、血液恶性肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增多症、霍奇金病、人乳头瘤病毒、葡萄胎、高钙血症、下咽癌、错构瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血管肉瘤、组织细胞病症、恶性组织细胞增多症、组织细胞瘤、肝癌、汗腺瘤、软骨肉瘤、免疫增殖性小肠病(immunoproliferative small)、opoma、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉氏细胞组织细胞增生症、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、li-fraumeni综合征、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、平滑肌肉瘤、白血病(例如b细胞白血病、混合细胞白血病、裸细胞白血病、t细胞白血病、t细胞慢性白血病、htlv-ii相关联的白血病、淋巴管肉瘤白血病、淋巴细胞急性白血病、淋巴细胞慢性白血病、肥大细胞和髓性白血病)、白血病肉瘤、间质细胞瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、淋巴管瘤(lymphangioma)、淋巴管细胞瘤(lymphangiocytoma)、淋巴管瘤(lymphagioma)、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、男性乳腺癌、肾恶性横纹肌瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、转移性癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤、蕈样霉菌病、骨髓增殖性综合征、骨髓瘤、骨髓增殖性病症、恶性类癌综合征类癌心脏病、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、间质瘤、中肾瘤、间皮瘤、肌母细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、鼻癌、鼻咽癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤病、nijmegen断裂综合征、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(nsclc)、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经上皮瘤、神经纤维瘤病、神经纤维瘤、神经瘤、赘生物(例如骨赘生物、乳腺赘生物、消化系统赘生物、结直肠赘生物、肝赘生物)、眼癌、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、周围神经外胚层肿瘤、垂体癌、真性红细胞增多症、前列腺癌、骨瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状瘤、副神经节瘤、非嗜铬副神经节瘤、松果体瘤、浆细胞瘤、原癌基因、罕见癌症及相关病症、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、rothmund-thomson综合征、网状内皮细胞增生症(reticuloendotheliosis)、横纹肌瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、sezary综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(sclc)、小肠癌、软组织肉瘤、脊柱脊髓肿瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、肉瘤(例如尤文氏实验性肉瘤、卡波西肉瘤和肥大细胞肉瘤)、支持细胞肿瘤、滑膜瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌-(膀胱)、移行细胞癌-(肾盂/输尿管)、滋养层癌、畸胎瘤、卵泡膜细胞瘤、胸腺瘤、滋养层肿瘤、尿道癌、泌尿系统癌症、尿空斑蛋白(uroplakin)、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(waldenstrom’s-macroglobulinemia)和wilms’瘤。

136、其他疾病和病况包括各种炎症病况。实例可以包含增殖性组分。特定的实例包括痤疮、心绞痛、关节炎、吸入性肺炎、疾病、脓胸、胃肠炎、炎症、肠道流感、nee、坏死性小肠结肠炎、盆腔炎、咽炎、pid、胸膜炎、喉咙痛(raw throat)、红肿、发红、喉咙痛(sore throat)、胃流感和尿路感染、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病或慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经病。

137、组合物

138、在一些实例中，本文所述的抗原结合蛋白可以经口、经肠胃外、通过吸入喷雾、吸附、吸收、经外敷、经直肠、经鼻、经颊侧、经阴道、经心室内、经由含有常规无毒的药学上可接受的载剂的剂量配制剂中的植入的储库、或通过任何其他方便的剂型进行施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输注技术。

139、用于将抗原结合蛋白制备成适合施用至受试者的形式(例如药物组合物)的方法是本领域已知的并且包括例如remington’s pharmaceutical sciences(第18版，mackpublishing co.，easton,pa.,1990)和u.s.pharmacopeia:national formulary(mackpublishing company,easton,pa.,1984)中所述的方法。

140、本发明的药物组合物特别可用于肠胃外施用，例如静脉内施用或施用到器官或关节的体腔或内腔中。用于施用的组合物通常将包含溶解在药学上可接受的载剂例如水性载剂中的抗原结合蛋白的溶液。可以使用多种水性载剂，例如缓冲盐水等等。组合物可含有近似生理条件下所需的药学上可接受的辅助物质，诸如ph调整和缓冲剂、毒性调整剂等等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等。在这些配制剂中，本发明的抗原结合蛋白的浓度可以广泛地变化，并且将主要根据所选择的特定的施用模式和患者的需要基于流体体积、黏度、体重等等来选择。示例性载剂包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。还可以使用非水性媒介物，诸如混合油和油酸乙酯。还可以将脂质体用作载剂。媒介物可以含有少量增强等渗性和化学稳定性的添加剂，例如缓冲剂和防腐剂。

141、本发明的抗原结合蛋白可配制以用于局部施用或外敷施用，诸如外敷施用于需要治疗的皮肤或组织。用于外敷施用的配制剂通常包含与活性剂组合的外敷媒介物，其具有或不具有额外的任选组分。本发明的药物组合物可以是以用于外敷施用的喷雾、霜、凝胶、洗剂等等的形式。

142、合适的外敷媒介物和额外的组分是本领域众所周知的，并且显然媒介物的选择将取决于特定的物理形式和递送的模式。外敷媒介物包括有机溶剂，诸如醇(例如乙醇、异丙醇或甘油)、二醇类诸如丁烯、异戊二烯或丙二醇、脂肪醇类诸如羊毛脂、水和有机溶剂的混合物以及有机溶剂的混合物诸如乙醇和甘油、基于脂质的材料诸如脂肪酸类、酰基甘油类(包括油类，诸如矿物油以及天然或合成来源的脂肪类)、磷酸甘油酯类、鞘脂类和蜡类、基于蛋白质的材料(诸如胶原和明胶)、基于硅酮的材料(非挥发性和挥发性两者)以及基于碳氢化合物的材料诸如微海绵和聚合物基质。

143、组合物可以进一步包含一种或多种适合于改进所应用的配制剂的稳定性或有效性的组分，诸如稳定剂、悬浮剂、乳化剂、黏度调节剂、胶凝剂、防腐剂、抗氧化剂、皮肤渗透增强剂、保湿剂和缓释材料。此类组分的实例描述于martindale–the extrapharmacopoeia(pharmaceutical press,london 1993)和martin(编),remington’spharmaceutical sciences中。配制剂可包含微胶囊诸如羟甲基纤维素或明胶微胶囊、脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒或纳米胶囊。

144、外敷配制剂可以制备成多种物理形式，包括例如固体、糊剂、乳膏、泡沫、洗剂、凝胶、粉末、水性液体、乳状液、喷雾和皮肤贴剂。此类形式的物理外观和黏度可以通过配制剂中存在的乳化剂和黏度调节剂的存在和量来控制。固体通常是坚硬且不可倾倒的，并且通常配制为条状或棒状，或以颗粒形式。固体可以是不透明或透明的，并且任选地可以含有溶剂、乳化剂、保湿剂、润肤剂、芳香剂、染料/着色剂、防腐剂和增加或增强最终产品的功效的其他活性成分。乳膏和洗剂通常彼此相似，主要区别在于黏度。洗剂和乳膏两者可以是不透明的、半透明的或透明的，并且通常含有乳化剂、溶剂和黏度调整剂，以及保湿剂、润肤剂、芳香剂、染料/着色剂、防腐剂和增加或增强最终产品的功效的其他活性成分。

145、可以用一系列黏度制备凝胶，从浓稠或高黏度到稀薄或低黏度。类似洗剂和乳膏的配制剂，这些配制剂还可能含有溶剂、乳化剂、保湿剂、润肤剂、芳香剂、染料/着色剂、防腐剂和增加或增强最终产品的功效的其他活性成分。液体比乳膏、洗剂或凝胶更稀薄，并且通常不含有乳化剂。液体表面产品通常含有溶剂、乳化剂、保湿剂、润肤剂、芳香剂、染料/着色剂、防腐剂和增加或增强最终产品的功效的其他活性成分。

146、用于外敷配制剂的乳化剂包括但不限于离子乳化剂、鲸蜡硬脂醇、类似聚氧乙烯油基醚的非离子乳化剂、peg-40硬脂酸酯、鲸蜡硬脂醇聚醚(ceteareth)-12、鲸蜡硬脂醇聚醚-20、鲸蜡硬脂醇聚醚-30、鲸蜡硬脂醇聚醚醇、peg-100硬脂酸酯和硬脂酸甘油酯。合适的黏度调整剂包括但不限于保护胶体或非离子树胶，诸如羟乙基纤维素、黄原胶、硅酸镁铝、二氧化硅、微晶蜡、蜂蜡、石蜡和棕榈酸鲸蜡酯。凝胶组合物可以通过添加胶凝剂诸如壳聚糖、甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚季铵盐、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、卡波姆或氨化甘草酸盐来形成。合适的表面活性剂包括但不限于非离子表面活性剂、两性表面活性剂、离子表面活性剂和阴离子表面活性剂。例如，可以在表面配制剂之内使用以下的一种或多种：聚二甲基硅氧烷共聚醇、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、月桂酰胺dea、椰油酰胺dea和椰油酰胺mea、油基甜菜碱、椰油酰胺丙基磷脂酰pg-二氯化铵和月桂醇聚醚硫酸铵。

147、防腐剂包括但不限于抗微生物剂，诸如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸、苯甲酸和甲醛，以及物理稳定剂和抗氧化剂，诸如维生素e、抗坏血酸钠/抗坏血酸和没食子酸丙酯。合适的保湿剂包括但不限于乳酸和其他羟基酸及其盐、甘油、丙二醇和丁二醇。合适的润肤剂包括羊毛脂醇、羊毛脂、羊毛脂衍生物、胆固醇、凡士林、异硬脂醇新戊酸酯和矿物油。合适的芳香剂和色素包括但不限于fd&c红40和fd&c黄5。可以包含在外敷配制剂中的其他合适的额外的成分包括但不限于研磨剂、吸收剂、抗结剂、消泡剂、抗静电剂、收敛剂(诸如金缕梅)、乙醇和草药提取物诸如洋甘菊提取物、黏合剂/赋形剂、缓冲剂、螯合剂、成膜剂、调理剂、喷射剂、乳浊剂(opacifying agent)、ph调整剂和保护剂。

148、用于外敷组合物的递送的典型模式包括使用手指的施用、使用物理施用器诸如布、纸巾、拭子、棒或刷子的施用、喷雾(包括薄雾、气雾剂或泡沫喷雾)、滴管施用、喷洒、浸泡和冲洗。还可以使用受控的释放媒介物，并且可以配制组合物用于透皮施用(例如，作为透皮贴剂)。

149、配制后，本发明的抗原结合蛋白将以与剂量配制剂相容的方式并以治疗/预防有效的量进行施用。配制剂容易以多种剂型进行施用，诸如上述可注射溶液的类型，但也考虑了其他的药学上可接受的形式，例如片剂、丸剂、胶囊或用于口服施用的其他硬粒(solid)、栓剂、阴道栓、鼻溶液或喷雾、气雾剂、吸入剂、脂质体形式等等。还可以使用药物“缓释”胶囊或组合物。缓释配制剂通常经设计以在延长的时段内提供恒定的药物水平并且可以用于递送本发明的抗原结合蛋白。

150、wo2002/080967描述了用于施用包含用于治疗例如哮喘的抗体的气雾化组合物的组合物和方法，其也适合于施用本发明的抗原结合蛋白。

151、施用的剂量和时间

152、本发明的抗原结合蛋白的合适剂量将依赖于具体的抗原结合蛋白、待治疗的病况和/或正在接受治疗的受试者而变化。确定合适的剂量在熟练医师的能力之内，例如通过从次优剂量开始并递增地修改剂量以确定最优或有用的剂量。或者，为了确定用于治疗/预防的合适的剂量，使用来自细胞培养测定或动物研究的数据，其中合适的剂量在包括几乎不具毒性或无毒性的活性化合物的ed50的循环浓度范围之内。剂量可以在此范围内变化，这取决于所采用的剂型和所利用的施用的途径。治疗/预防有效剂量可以最初从细胞培养测定中估计。剂可以在动物模型中进行配制以达到循环血浆浓度范围，该范围包括如在细胞培养物中所测定的ic50(即，达到症状的半最大抑制的化合物的浓度或量)。此类信息可以用于更准确地确定在人中的有用剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱来测量。

153、在一些实例中，本发明的方法包括施用预防或治疗有效量的本文所述的蛋白质。

154、术语“治疗有效量”是当施用至有此治疗需要的受试者时改善受试者的预后和/或状态和/或将本文所述临床病况的一个或多个症状减少或抑制到低于观察为或接受为该病况的临床诊断或临床特征的水平的数量。待施用至受试者的量将取决于待治疗病况的具体特征、正在接受治疗的病况的类型和阶段、施用的模式以及受试者的特征，诸如总体健康、其他疾病、年龄、性别、基因型和体重。本领域技术人员将能够依赖于这些和其他因素确定适当的剂量。因此，该术语不应解释为将本发明限制于具体的数量，例如蛋白质的重量或量，而是本发明涵盖足以在受试者中实现所述结果的任何量的抗原结合蛋白。

155、如本文所用，术语“预防有效量”应理解为意指足够量的蛋白质以预防或抑制或延迟临床病况的一个或多个可检测症状的发作。技术人员将意识到，此类量将取决于例如所施用的特异性抗原结合蛋白和/或特定受试者和/或病况的类型或严重性或水平和/或对病况的易感性(predisposition)(遗传的或除此以外的)。因此，该术语不应解释为将本发明限制于具体的数量，例如抗原结合蛋白的重量或量，而是本发明涵盖足以在受试者中实现所述结果的任何量的抗原结合蛋白。

156、试剂盒

157、本发明额外地包含试剂盒，其包含以下一项或多项：

158、(i)本发明的抗原结合蛋白或编码其的表达构建体；

159、(ii)本发明的细胞；

160、(iii)本发明的复合物；或

161、(iii)本发明的药物组合物。

162、在用于检测功能障碍p2x7受体的试剂盒的情况下，该试剂盒可以额外地包含例如与本发明的抗原结合蛋白连接的检测手段。

163、在用于治疗/预防用途的试剂盒的情况下，该试剂盒可以额外地包含药学上可接受的载剂。

164、任选地，本发明的试剂盒与用于根据任何实例的本文所述的方法中的说明书进行包装。

165、实施例

166、实施例1：bil03重链的轻链配对的鉴定

167、单链人可变重区通常表达不良并在表达后聚集，这使得难以用临床相关量起作用并难以以临床相关量产生。

168、发明人试图鉴定出单结构域重链蛋白bil03(如本文表1中所定义)的合适的轻链配对。

169、测试了超过10种不同的轻链配对，包括本文表1中定义为gb1的可变轻链。

170、发明人发现与wt b1(在表1中定义)配对的特异性轻链提供了稳定的表达和减少的聚集。令人惊讶的是，这种轻链-重链配对还显著提高了与靶抗原的结合亲和力，如下表中所证明。

171、表2：与与各种轻链可变结构域配对时相比，bil03重链的结合亲和力

172、

173、评估了与衍生自功能障碍p2x7受体的两种不同抗原的结合亲和力:e200肽(ghnyttrnilpglnitc)和ext肽17(ghnyttrnilpglnitstfhktsgsgk)。

174、应当理解，本说明书中公开和定义的本发明延伸至从文本或附图中提到的或明显的单个的特征中的两个或更多个的所有替代性组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各个替代方面。