用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗及其制备方法

本发明涉及核酸疫苗领域，具体而言涉及一种用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mrna疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、猫病毒性鼻气管炎(fvrs)，又称猫传染性鼻气管炎，是由猫疱疹病毒(felineherpesvirus，fhv)感染引起猫的一种急性、高度接触性传染病。fhv感染的典型临床症状是体温升高、打喷嚏、咳嗽、角膜结膜炎、鼻眼浆液性或脓性分泌物和眼周皮肤溃疡。在幼猫和成年猫中均可发生，主要感染2-4个月龄，发病率高达100％，成年猫不引起死亡，幼猫死亡率可达50％，是目前已知最严重的猫呼吸道疾病之一。fhv的gb蛋白是由ul27基因编码的949个氨基酸组成的囊膜糖蛋白，是fhv囊膜表面的重要组成部分，同时gb糖蛋白也是最主要的免疫抗原性蛋白，对于病毒入侵细胞、病毒复制、细胞融合以及在细胞间传播起着决定性作用。fhv的gd蛋白是病毒囊膜的主要成分，存在于感染的细胞膜上，具有高度的保守性和抗原性，能够与细胞表面的分子特异性结合。诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，在病毒穿入易感细胞中起重要作用，是宿主细胞免疫和体液免疫反应的主要靶细胞之一。gb蛋白和gd蛋白也是极为保守的免疫原性蛋白，作为研究疱疹病毒亚单位疫苗常选择的靶蛋白，具有较好的免疫原性。

2、猫杯状病毒病(felinecaliciviral disease，fcvd)是由猫杯状病毒(felinecalicivirus，fcv)引起的一种以上呼吸道感染为主要症状的疾病，该病主要侵害7-84日龄幼猫，常发于56-84日龄，1岁以下的猫最易感，日龄越小的猫感染后死亡率越高，潜伏期2-3日，自然病程7-10日。其主要临床症状表现为口腔溃疡、肺炎、慢性胃炎、关节炎及跛行等。fcv的vp1蛋白是一种结构蛋白，在病毒粒子的形成、抗原决定以及病毒-宿主细胞的相互作用中起到关键作用。vp1拥有大部分中和抗体表位，是重点研究对象。

3、猫泛白细胞减少症(feline panleukopenia，fp)是由猫细小病毒(felineparvovirus，fpv)引起的猫的一种急性、高度接触性传染病。fpv感染的典型临床症状是双相热、呕吐、腹泻、脱水，循环障碍及白细胞严重减少和出血性肠炎。主要感染1岁以内的幼猫，通常情况下，对1岁以下的猫的致死率为50％～60％，对5月龄以下的幼猫的死亡率高达80％～90％。fpv的vp2蛋白约占所有结构蛋白的90％，vp1蛋白占所有结构蛋白的10％，因此vp2蛋白是fpv编码的主要的抗原蛋白，在免疫应答、识别受体及感染组织的过程中发挥着重要作用。vp2蛋白上有多个抗原识别位点，能够刺激机体产生中和抗体，起到自我保护作用。

4、研究并开发用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的mrna疫苗，对于猫主要疫病的防控具有积极的意义。相比传统疫苗，mrna疫苗作为新型疫苗的形式，具有生产工艺简单、开发速度快、无需细胞培养、成本低。相较与dna疫苗，mrna疫苗无需进入细胞核，没有整合至宿主基因组的风险，半衰期可以通过修饰进行调整。mrna疫苗可提供对适应性和先天免疫力的综合刺激，即原位抗原表达和危险信号传递；可以诱导“平衡”免疫反应，包括体液和细胞效应因子以及免疫记忆。临床上，猫的上述三种疾病交叉混合感染较多，通常还继发细菌感染，症状更加复杂。相关技术中，尚缺乏针对上述三种病毒的三联mrna疫苗，一旦感染发病，常采用对症治疗或施用抗生素的方式进行治疗，但治疗效果和治疗特异性较差，而且普遍存在耐药性和毒副作用。

技术实现思路

1、本发明提供了一种用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mrna疫苗及其制备方法。

2、本发明提供的用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mrna疫苗能够针对三种猫主要流行性传染病提供有效的免疫保护，并且本发明提供的三联mrna疫苗只需免疫一次，就可以能达到一次免疫接种可同时预防和控制上述三种猫流行性传染病的目的，对于猫流行性传染病的防控具有积极的意义。

3、本发明的技术方案：

4、一种用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病和猫泛白细胞减少症的三联mrna疫苗，所述的三联mrna疫苗包含有表达抗原蛋白的mrna，其中表达抗原蛋白的mrna包含有表达猫疱疹病毒gb蛋白的mrna、表达猫疱疹病毒gd蛋白的mrna、表达猫杯状病毒vp1蛋白的mrna和表达猫细小病毒vp2蛋白的mrna。

5、编码猫疱疹病毒gb蛋白的基因为缺失3’端第2440-2847位核苷酸序列，编码猫疱疹病毒gd蛋白的基因为缺失3’端第988-1125位核苷酸序列，编码猫杯状病毒vp1蛋白的基因为缺失5’端第4-372位核苷酸序列。

6、编码猫疱疹病毒gb蛋白的基因是密码子优化后的基因，核苷酸序列如seq idno.1所示；编码猫疱疹病毒gd蛋白的基因是密码子优化后的基因，核苷酸序列如seq idno.2所示；编码猫杯状病毒vp1蛋白的基因是密码子优化后的基因，核苷酸序列如seq idno.3所示；编码猫细小病毒vp2蛋白的基因是密码子优化后的基因，核苷酸序列如seq idno.4所示。

7、优选的，表达猫疱疹病毒gb蛋白的mrna序列如seq id no.5或seq id no.9所示，表达猫疱疹病毒gd蛋白的mrna序列如seq id no.6或seq id no.10所示，表达猫杯状病毒vp1蛋白的mrna序列如seq id no.7或seq id no.11所示，表达猫细小病毒vp2蛋白的mrna序列如seq id no.8或seq id no.12所示。

8、表达猫疱疹病毒gb蛋白的mrna、表达猫疱疹病毒gd蛋白的mrna、表达猫杯状病毒vp1蛋白的mrna和表达猫细小病毒vp2蛋白的mrna的质量比为2∶2∶3∶3。

9、所述的三联mrna疫苗还含有佐剂，所述的佐剂包括脂质纳米颗粒佐剂、水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂或维生素e佐剂。所述的佐剂为阳离子脂质、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、聚乙二醇脂质和胆固醇，摩尔比为50∶10∶38.5∶1.5。

10、具体的，所述的三联mrna疫苗为肌内、皮内或皮下给药的剂型。

11、本发明还提供了一种制备所述的三联mrna疫苗的方法，包括以下步骤：

12、(1)构建表达抗原蛋白mrna的合成质粒，使用限制性内切酶进行线性化处理，得到线性化的抗原蛋白mrna的合成质粒；

13、(2)对线性化的抗原蛋白mrna的合成质粒利用t7启动子序列进行体外转录反应，提纯获得表达抗原蛋白的mrna；

14、(3)对步骤(2)中获得的表达抗原蛋白的mrna使用牛痘病毒加帽酶和2′-o-甲基转移酶通过酶法进行cap加帽修饰反应，提纯获得加帽修饰的表达抗原蛋白mrna；

15、(4)将步骤(3)中加帽修饰的表达抗原蛋白mrna与阳离子脂质、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质混合，获得所述的三联mrna疫苗。

16、所述的抗原蛋白mrna的合成质粒包括t7启动子序列、5’utr区、编码猫疱疹病毒gb蛋白或猫疱疹病毒gd蛋白或猫杯状病毒vp1蛋白或猫细小病毒vp2蛋白的mrna序列、3’utr区和3’末端poly a尾。

17、所述的mrna的合成质粒可构建于任意克隆载体，poly a尾末端保留一个限制性内切酶位点，用于质粒线性化制备。优选的，所述限制性内切酶位点为bspq i、bsa i或mlu i。

18、目前，mrna疫苗主要以两种序列结构存在，传统的非复制型mrna序列和自扩增型(复制型)的mrna疫苗序列。非复制型的mrna疫苗结构简单，在体内无法自我复制，需要成熟的优化工艺才能在较低的剂量诱发免疫应答。自扩增型mrna序列含有复制酶基因，可在细胞内扩增mrna，从而以较少的mrna剂量生产较多的抗原。

19、所述的表达猫疱疹病毒gb蛋白的mrna、表达猫疱疹病毒gd蛋白的mrna、表达猫杯状病毒vp1蛋白的mrna和表达猫细小病毒vp2蛋白的mrna还包括甲病毒非结构蛋白基因编码区。所述甲病毒非结构蛋白基因编码区为非结构蛋白1-4基因编码区。优选地，所述甲病毒为委内瑞拉马脑炎病毒(vee)。vee复制酶基因nsp 1-4区，包含vee病毒复制酶基因序列，表达的vee病毒复制酶能够在体内合成mrna，起到复制mrna的功能。

20、本发明还提供了所述的三联mrna疫苗在制备同时预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病和猫泛白细胞减少症药物中的应用。

21、使用lnp-mrna疫苗免疫后的动物体内存在针对猫疱疹病毒，猫杯状病毒和猫细小病毒的特异性抗体，具有预防猫疱疹病毒，猫杯状病毒和猫细小病毒感染的作用。

22、本发明的有益效果：

23、本发明制备了一种猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mrna疫苗，制备包含表达猫疱疹病毒gb蛋白的mrna、表达猫疱疹病毒gd蛋白的mrna、表达猫杯状病毒vp1蛋白的mrna和表达猫细小病毒vp2蛋白的mrna，结合脂质体包裹方案制备mrna疫苗，并应用于猫疱疹病毒，猫杯状病毒和猫细小病毒的免疫。该方法在猫主要流行性传染病的研究和疫苗创制上具有应用价值，能够大力推进疫苗的转化应用。