一种协同促修复热稳定重组Ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶及其制备方法与流程

一种协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶及其制备方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及人源化胶原蛋白凝胶，具体涉及一种协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.人胶原蛋白主要存于人体皮肤中，可在皮肤角质层形成胶原膜，防止内在水分向外界蒸发，起到保湿的作用，改善角质层含水量，维持角质细胞正常功能，从而保护皮肤免受损伤。近年来，胶原蛋白越来越多地被应用于伤口敷料，其作为细胞外基质重要组成成分可促进多种细胞如成纤维细胞、内皮细胞的迁移和增殖，促进生长因子等细胞因子的产生，从而促进伤口愈合。
3.动物源胶原蛋白提取成本高，且因异源性的原因，安全风险相对较高，故重组人源化胶原蛋白成为胶原蛋白类产品的首选。重组ⅲ型人源化胶原蛋白，具有很高的生物学活性、良好的组织相容性，能促进真皮层纤维母细胞增生，提高细胞活性，并被成纤维细胞作为合成胶原蛋白的原料吸收，刺激细胞更多的合成胶原蛋白，使受损的皮肤得到填充和修复。然而，用于皮肤损伤创面修复敷料需保证无菌，敷料的灭菌方式通常为湿热灭菌和辐照灭菌，辐照灭菌常用的60co-γ射线对高分子材料和包装材料有一定的破坏性，对人和环境也存在潜在污染和伤害，且辐照灭菌成本较高，所需辐照剂量很大，耗时很长。湿热灭菌无任何化学和物理残留，相对而言较其它灭菌方式更为安全。但是，重组ⅲ型人源化胶原蛋白是属于蛋白质类，湿热灭菌会使其失去活性。
4.海藻糖是一种以两分子葡萄糖通过α-1,1糖苷键连接起来的非还原性双糖。早期研究表明，海藻糖能显著提高小鼠的耐热和抗脱水能力，可以增加热环境下蛋白的稳定性，抑制热应激所致的蛋白凝集；海藻糖在高温环境中能对细胞膜起到一定的维护作用，能够在细胞表面形成保护膜从而有效地保护生物分子结构，这种独特的生物学功能使海藻糖被广泛用作蛋白质、酶和组织的稳定剂。海藻糖对蛋白高温保护机理目前以优先排阻学说为主，即蛋白不直接与海藻糖发生作用，而是优先与水结合，从而使海藻糖分子被蛋白溶剂化层所排阻，使得蛋白周围的海藻糖浓度比较低，因此可以优先水化，表面张力增加，化学势升高，最终使蛋白在海藻糖溶液中更稳定。此外，海藻糖排斥分布于蛋白的周围，这使得蛋白的疏水基团不被暴露，抑制了蛋白的变性。然而，实验发现海藻糖直接与胶原蛋白混合进行湿热灭菌后其生物学活性明显降低，通过凝胶电泳分别对胶原蛋白溶液和胶原蛋白海藻糖混合溶液灭菌前后进行分析，得出胶原蛋白溶液湿热灭菌后胶原蛋白的分子量显著降低，而胶原蛋白与海藻糖混合溶液中胶原蛋白的分子量未发生明显的变化，推测海藻糖可以保护胶原蛋白湿热灭菌后不发生断裂，但其三螺旋结构遭到了破坏，从而导致其生物活性丧失。因此，如何保证重组ⅲ型人源化胶原蛋白湿热灭菌而不丧失活性成为亟待解决的问题。
5.此外，皮肤损伤的愈合是皮肤组织再生的过程，在损伤后数小时内会出现炎症反
应，表现为红肿、组织液渗出等；因此，良好的促修复产品不仅需要能促进皮肤细胞增生，也需要能抑制炎症的发生和发展。而目前应用于非慢性伤口（慢性伤口为伤口超过一个月未愈合或没有愈合倾向的难治性伤口）的医用敷料的研究相对较少，而能防止炎症发生（即防止感染）和抑制炎症发展从而协同促进伤口快速修复的重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶更是少见报道。因此，开发一种能进行湿热灭菌的热稳定的胶原蛋白敷料有着广大的应用前景。


技术实现要素：

6.针对上述存在的问题及为了达到上述的目的，本发明提供一种协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶及其制备方法，将一定比例的卡波姆、羟乙基纤维素和海藻糖与重组ⅲ型人源化胶原蛋白混合均匀，使胶原蛋白溶剂化结构更加稳定，提高重组ⅲ型人源化胶原蛋白在高温下的稳定性；通过加入β-葡聚糖使该凝胶具有一定的抗炎活性。具体技术方案如下：首先，本发明提供一种协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶，按质量百分比计，该凝胶由以下成分组成：重组ⅲ型人源化胶原蛋白0.1%；海藻糖0.5%～5%；卡波姆0.05%～0.5%；羟乙基纤维素0.05%～0.3%；甘油1%～5%；己二醇0.05%～1%；β-葡聚糖0.05%～2%；三乙醇胺0.05%～0.5%；余量为水。
7.前述的协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶，所述重组ⅲ型人源化胶原蛋白的分子量为4万道尔～10万道尔。
8.前述的协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶，所述卡波姆、羟乙基纤维素和海藻糖的质量比为1～50:1～30:100～200；优选为8:15:100。
9.前述的协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶，所述己二醇、甘油和β-葡聚糖的质量百分比为1～20:20～100:1～40；优选为5:40:1。
10.前述的协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶，按质量百分比计，该凝胶优选由以下成分组成：重组ⅲ型人源化胶原蛋白0.1%；海藻糖1%；卡波姆0.08%；羟乙基纤维素0.15%；甘油4%；己二醇0.5%；β-葡聚糖0.1%；三乙醇胺0.08%；
余量为水。
11.其次，本发明提供一种协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶的制备方法，包括以下制备步骤：s1：将重组ⅲ型人源化胶原蛋白、海藻糖、卡波姆、羟乙基纤维素与水混合均匀，加热搅拌一定时间，得到第一溶液；s2：将甘油、己二醇和β-葡聚糖加入到第一溶液中，继续搅拌，均质，得到第二溶液；s3：将第二溶液45℃以下，加入三乙醇胺，并调整ph值，搅拌一定时间出料，灌装后湿热灭菌即得。
12.优选地，步骤1）中，所述加热温度为80℃，搅拌速度为200rpm，搅拌时间为30min。
13.优选地，步骤3）中，所述湿热灭菌的条件为：105℃下灭菌60min或115℃下灭菌30min或121℃下灭菌20min。
14.本发明的有益效果：1）本发明通过加入海藻糖、卡波姆和羟乙基纤维素，并改变卡波姆和羟乙基纤维素与海藻糖的比例，以改变该凝胶的粘稠度，从而使该凝胶经湿热灭菌后仍具有优良的生物学活性；通过加入甘油、己二醇使其具有很强的保湿性，能形成凝胶膜覆盖在伤口处，从而能保护伤口免受感染，加入β-葡聚糖使得该凝胶具有一定的抗炎活性，使伤口处微环境得到改善，进而增快创面的修复速度。
15.2）本发明加入甘油和己二醇来调节该凝胶的保湿性，使其能快速在创面表面形成保护膜，为创面提供湿性愈合环境；同时，通过加入适宜浓度的β-葡聚糖使该凝胶具有明显的抗炎活性，抵抗伤口创面感染，协同促进胶原蛋白对创面的修复作用。
16.3）本发明人源化胶原蛋白凝胶的制备方法首先将重组ⅲ型人源化胶原蛋白与不同比例的海藻糖、卡波姆、羟乙基纤维素和水混合均匀，形成热稳定更高的相互联结的“三层结构”，使胶原蛋白经湿热灭菌后仍具有很高生物学活性；然后将甘油、己二醇和β-葡聚糖加入凝胶，混匀，使其对重组ⅲ型人源化胶原蛋白促创面修复起到协同作用。
附图说明
17.图1为本发明人源化胶原蛋白凝胶的“三层结构”体系结构示意图；图2为实施例3中各配方重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶对hacat细胞和hsf细胞生长的影响；图3为海藻糖对湿热灭菌前后重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶活性的影响；图4为不含海藻糖的重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶灭菌前后对hsf细胞迁移的影响；图5为实施例3中各配方重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶湿热灭菌（105℃，60min）后对hsf细胞迁移的影响；图6为对比例1中重组ⅲ型人源化胶原蛋白sds-page电泳结果；图7为实施例8制备的重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶实物图；图8为实施例8、对比例2和对比例3中胶原蛋白凝胶对hacat细胞和hsf细胞生长的影响；
图9为实施例8、对比例2和对比例3中胶原蛋白凝胶对hsf细胞迁移活性考察。
具体实施方式
18.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
19.实施例1本实施例是一种协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶，按质量百分比计，该凝胶由以下成分组成：重组ⅲ型人源化胶原蛋白0.1%；海藻糖0.5%～5%；卡波姆0.05%～0.5%；羟乙基纤维素0.05%～0.3%；甘油1%～5%；己二醇0.05%～1%；β-葡聚糖0.05%～2%；三乙醇胺0.05%～0.5%；余量为水。通过加入海藻糖、卡波姆和羟乙基纤维素，并改变卡波姆和羟乙基纤维素与海藻糖的比例，以改变该凝胶的粘稠度，从而使该凝胶经湿热灭菌后仍具有优良的生物学活性；该凝胶还通过加入甘油、己二醇使其具有很强的保湿性，能形成凝胶膜覆盖在伤口处，从而能保护伤口免受感染，加入β-葡聚糖使得该凝胶具有一定的抗炎活性，使伤口处微环境得到改善，进而增快创面的修复速度。
20.为了解决湿热灭菌导致人源化胶原蛋白三螺旋结构遭到破坏，导致其生物活性丧失的问题，本实施例将一定比例的卡波姆、羟乙基纤维素和海藻糖与重组ⅲ型人源化胶原蛋白混合均匀，得到使胶原蛋白溶剂化结构更加稳定的结构。该结构为一个个相互联结的“三层结构”，如图1所示。其中，卡波姆和羟乙基纤维素二者均具有优良的耐热性能，卡波姆分子作为羧基给予体能与一个或两个以上羟基结合形成氢键而增稠，故其能与胶原蛋白溶剂化周围的海藻糖中的羟基结合而使不同的胶原蛋白溶剂化结构相互联结；同时，羟乙基纤维素可溶解于热水也可溶于冷水，高温或煮沸不沉淀，使其具有更大范围的溶解性和粘度特性，从而进一步提高了“三层结构”体系溶液在高温下的稳定性。
21.本实施例所述重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶通过改变卡波姆、羟乙基纤维素、海藻糖三者的配比，以改变该凝胶的粘稠度，从而使各胶原蛋白“三层结构”之间联结更紧密，耐热性更好。然而粘度太大可能会影响胶原蛋白的溶剂化作用，从而导致“三层结构”被破坏，使胶原蛋白的非极性基团裸露出来，导致其高温变性。因此，本实施例所述胶原蛋白凝胶中卡波姆、羟乙基纤维素和海藻糖的比例范围为1～10:1～6:10～40；优选为8:15:100。本实施例中，所述重组ⅲ型人源化胶原蛋白的分子量为4万道尔～10万道尔；所述卡波姆包括卡波姆940、卡波姆941、卡波姆980、卡波姆981、卡波姆934p、卡波姆971p、卡波姆974p、卡波姆71g、卡波姆5984和卡波姆1342中的一种或多种。
22.本实施例所述重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶通过甘油和己二醇使其具有较好的保湿性，使该凝胶在皮肤损伤处形成薄膜保护的同时能快速地为创面形成湿性愈合环境；同时，通过加入β-葡聚糖使该凝胶具有一定的抗炎活性。本发明所述胶原蛋白凝胶中己二醇、甘油和β-葡聚糖三者的百分比为1～20:20～100:1～40；优选为5:40:1。该凝胶一个优选的配方为：重组ⅲ型人源化胶原蛋白0.1%；海藻糖1%；卡波姆0.08%；羟乙基纤维素0.15%；甘油4%；己二醇0.5%；β-葡聚糖0.1%；三乙醇胺0.08%；余量为水。
23.该协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶的制备方法，首先在第一阶段就将重组ⅲ型人源化胶原蛋白、海藻糖、卡波姆、羟乙基纤维素与水混合，在高温下进行搅拌得到第一溶液；然后再将其它原料加入第一溶液进行均质，均质完成后降温，调ph值即
得。本制备方法的优点为首先制备得到重组ⅲ型人源化胶原蛋白热稳定结构，相对于均质完成后再加入重组ⅲ型人源化胶原蛋白的凝胶，湿热灭菌后其生物学活性明显提高。具体制备步骤如下：s1：将重组ⅲ型人源化胶原蛋白、海藻糖、卡波姆、羟乙基纤维素和水混合均匀，加热至80℃后，200rpm搅拌30min，得到第一溶液；s2：将甘油、己二醇和β-葡聚糖加入到第一溶液中，200rpm搅拌10min，均质5min，得到第二溶液，均质速度3000rpm；s3：将第二溶液温度降至45℃以下，加入三乙醇胺，调节ph为4.0～7.0，再搅拌5分钟出料，灌装后湿热灭菌即得；所述湿热灭菌的条件为：105℃下灭菌60min或115℃下灭菌30min或121℃下灭菌20min。
24.实施例2本实施例进行不同比例海藻糖、卡波姆、羟乙基纤维素的重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶的配制，并进行凝胶性状的观察和粘度的测定。配制方法为将重组ⅲ型人源化胶原蛋白、海藻糖、卡波姆、羟乙基纤维素与水混合均匀，加热至80℃，200rpm搅拌30min即得。具体配方如表1所示：表1.不同胶原蛋白凝胶配方
。
25.对上述配方1～16制备的重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶进行性状评价和粘稠度检测。评价方法为：观测各配方凝胶形态和质地，最优（凝胶透明，质地细腻均一，粘稠度优）、优秀（凝胶透明，质地细腻均一，粘稠度较稠（稀））、较优（凝胶透明，质地均一，粘稠度略稠（稀））、略差（凝胶透明，质地（局部）不均一，粘稠度略稠（稀））。凝胶粘度采用ndj-5s数字式粘度计进行检测，生产商为上海精天电子仪器有限公司，量程为1～100000 mpa.s。结果如表2所示：表2.各配方凝胶性状评价及粘度值
。
26.实施例3本实施例为灭菌前后胶原蛋白凝胶生物活性考察。
27.准备实施例2中最优配方凝胶（配方3、配方6、配方7、配方10和配方14）各4份，各取1份不灭菌，其余3份进行不同条件的湿热灭菌，灭菌条件分别为105℃，60min；115℃，30min和121℃，20min，然后将灭菌前和灭菌后的凝胶经0.22μm滤膜过滤，4℃冰箱储存备用。
28.试验材料： hacat细胞、hsf细胞、高糖dmem培养基、hsf专用培养基、胎牛血清（fbs）、双抗（青霉素/链霉素）、胰酶、磷酸缓冲溶液（pbs）、96孔板、6孔板、培养瓶、离心管等。
29.试验仪器：细胞培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、水浴锅、离心机等。
30.1、mtt法检测在hacat细胞和hsf细胞中加入不同配方凝胶样品后24h、48h的od值，mtt法的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量, 在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。具体od值如表3～表6所示：表3. 加入不同配方凝胶24h后对hacat细胞生长的影响（od490nm）
31.表4. 加入不同配方凝胶48h后对hacat细胞生长的影响（od490nm）
32.表5. 加入不同配方凝胶24h后对hsf细胞生长的影响（od490nm）
33.表6. 加入不同配方凝胶48h后对hsf细胞生长的影响（od490nm）。
34.实验结果一：与正常细胞组比较，上述各配方胶原蛋白凝胶在灭菌前均体现出明显的促进hacat细胞和hsf细胞生长增殖的作用。说明重组ⅲ型人源化胶原蛋白本身具有促进细胞生长增殖的生物学活性，如图2所示。
35.实验结果二：配方3（没有海藻糖）经3种不同条件湿热灭菌后，其hacat细胞和hsf细胞的数量与正常细胞组的细胞数量相当，说明仅有卡波姆和羟乙基纤维素的胶原蛋白凝胶经湿热灭菌后没有促细胞生长增殖的活性，如图3所示。
36.实验结果三：不同百分质量比的卡波姆、羟乙基纤维素和海藻糖对胶原蛋白的耐热性有一定的影响。在一定粘度范围内，该凝胶湿热灭菌后的生物活性随着粘度的增大而
升高，优选卡波姆、羟乙基纤维素和海藻糖的比例为8:15:100。
37.2、划痕实验考察在hsf细胞中加入不同配方凝胶样品24h后细胞迁移情况。
38.试验步骤：用marker笔在6孔板背后均匀划3条横线；取对数生长期的hsf细胞铺于6孔板中，密度为5
×
105cells/ml；待细胞铺满后用10μl枪头垂直横线划痕，然后用pbs冲洗3次，加入含不同配方的培养基（凝胶：培养基为1:9），正常细胞组只加培养基。观察各配方凝胶加入后24h内细胞的迁移情况。
39.实验结果一：与正常组细胞比较，无海藻糖的配方（配方3）在灭菌前表现出明显的促细胞迁移作用，但经3种不同条件湿热灭菌后，细胞迁移的程度均减弱，与正常细胞组相当（图4）；而含海藻糖的配方在湿热灭菌后仍具有促细胞迁移的活性，并进行了无菌检查，结果为上述凝胶（含海藻糖的配方）经湿热灭菌后14天内无菌落生长，可认为该灭菌方式既不影响其生物活性，又能达到无菌的效果。
40.实验结果二：与正常组细胞比较，除配方3外的其它4个配方在湿热灭菌后均显示促进细胞迁移的活性；其中，配方10凝胶组活性最强，在24h时划痕的汇合度近100%，接近完全汇合，如图5所示。
41.对比例1本对比例主要考察仅含海藻糖的重组ⅲ型人源化胶原蛋白溶液在湿热灭菌后其生物学活性的变化。各配方配制方法为将重组ⅲ型人源化胶原蛋白、海藻糖与水混合均匀，加热至80℃，200rpm搅拌10min即得。具体配方如表7所示：表7.含不同比例海藻糖的胶原蛋白溶液配方。
42.对比例1中各配方（配方17～配方19）在湿热灭菌后其生物学活性均丧失，体现为对hacat细胞和hsf细胞的生长和迁移均无促进作用；表明仅含海藻糖的胶原蛋白溶液在湿热灭菌后会丧失其生物学活性。通过sds-page凝胶电泳分别对胶原蛋白溶液和胶原蛋白海藻糖混合溶液灭菌前后进行分析，得出胶原蛋白溶液湿热灭菌后胶原蛋白的分子量显著降低，而胶原蛋白与海藻糖混合溶液中胶原蛋白的分子量未发生明显的变化（图6），可以推测海藻糖可以保护胶原蛋白湿热灭菌后不发生断裂，但其三螺旋结构遭到了破坏，从而导致其生物活性丧失。
43.实施例4本实施例为考察加入不同比例的甘油和己二醇对胶原蛋白凝胶保湿性的影响。制备方法为将重组ⅲ型人源化胶原蛋白、海藻糖、卡波姆、羟乙基纤维素和水混合均匀，加热至80℃后，200rpm搅拌30min；然后加入甘油、己二醇，200rpm搅拌10min，均质5min，均质速度3000rpm，然后降温即得。具体配方如表8所示：表8.不同胶原蛋白凝胶配方
。
44.对各配方制备的重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶的保湿性进行评价，评价方法为：各取0.5g样品涂抹在玻璃板面（10
×
10cm）上，涂抹面积为（2
×
2cm），2个平行，室温条件下放置，分别在0h、1h、2h、4h、8h观测，观测现象包含凝胶形态（凝胶状、干枯），质地（均一、局部干枯），水润度（水润、一般、干枯）。具体结果如表9所示：表9.各配方凝胶保湿性结果
。
45.表9中结果表明各配方制备的重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶在室温下2h内均能保持优秀的保湿性，而只有当配方中甘油百分比含量不小于4%，且己二醇百分含量不小于0.5%时，在室温下放置8h时也能保持相对良好的凝胶状态，比如配方28、配方29、配方33和配方34，其中，配方28中甘油和己二醇的百分含量最低，作为优选配方。
46.实施例5本实施例为对实施例4中配方28制备的重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶进行抗炎活性考察。在配方28凝胶中加入不同百分含量的β-葡聚糖，制备方法为将重组ⅲ型人源化胶原蛋白、海藻糖、卡波姆、羟乙基纤维素和水混合均匀，加热至80℃后，200rpm搅拌30min；然后加入甘油、己二醇和β-葡聚糖，200rpm搅拌10min，均质5min，均质速度3000rpm，然后开始
降温；待温度降至45℃以下，加入三乙醇胺调节ph为4.0～7.0即得。通过脂多糖(lps)干预小鼠巨噬细胞raw264.7建立炎症细胞模型，对各配方胶原蛋白凝胶的体外抗炎活性进行研究，具体配方如表10所示：表10.不同胶原蛋白凝胶配方。
47.实验方法：先通过细胞毒性检测确定受试物的浓度范围，选择细胞活力大于90%的浓度。然后取处在对数生长期的raw264.7细胞,消化后计数，1000rpm离心5min，弃上清，用培养基重悬；按5
×
104cells/well接种至96孔板中，每孔200μl，放置于培养箱中培养24h
±
2h。弃掉培养基，开始诱导及给药。受试物孔中加入含一定浓度受试物和lps（1μg/ml）的培养基；阴性对照加入含有lps的细胞培养基；阳性对照孔中加入含阳性对照（地塞米松100μg/ml）和lps的培养基；空白/溶剂对照孔中加细胞培养基，每孔200ul，孵育24h
±
2h。孵育结束后，收集150μl细胞培养上清液于1.5ml无菌离心管中，置于-80℃冰箱保存，备用。用elisa检测试剂盒检测tnf-α，il-6的含量。结果如表11所示：表11.各配方凝胶tnf-α，il-6的含量。
48.由表11可得胶原蛋白凝胶中加入一定浓度的β-葡聚糖后具有明显的抗炎活性，但浓度超过一定量时抗炎活性降低；其中，优选β-葡聚糖的百分含量为0.1%。
49.实施例6本实施例为实施例5中各胶原蛋白凝胶进行高温试验和加速试验，考察凝胶的外观、性状等指标有无明显变化。高温试验为取适量样品分装于软膏管中，置于60℃水浴中，放置10天，于第5、10日取样进行检测；加速试验为取适量样品分装于软膏管中，置于相对湿度为75%
±
5%的干燥器上部，盖上上盖，放入恒温培养箱，于40℃
±
2℃条件下放置6个月，于
第30、60、90、180天取样进行检测。结果见表12所示：表12.各配方凝胶稳定性考察。
50.结果显示：各配方（配方35～配方38）重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶经过高温试验和加速试验后都能保持凝胶状，且颜色、气味等性状均未发生变化。
51.实施例7本实施例为考察实施例5中配方36重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶促进大鼠皮肤损伤的修复作用。20只成年健康雌性sd大鼠（220g
±
20g）随机分成模型组、空白凝胶组（无重组ⅲ型人源化胶原蛋白，其它同配方36）、胶原蛋白凝胶单用组（配方10，不含甘油、己二醇和β-葡聚糖，调节ph至4.0~7.0）和胶原蛋白凝胶合用组（配方36），共4组，每组5只。各凝胶组均进行湿热灭菌后使用。背部用剃毛器剃毛后再用脱毛膏将短毛除尽，然后用3%戊巴比妥钠按照30mg/kg腹腔注射麻醉。用碘伏将皮肤消毒后，取直径6mm的打孔器在相应部位取圆形创面，切除皮肤全层。止血后，空白敷料组和胶原蛋白敷料组用相应敷料覆盖伤口后用医用纱布和胶带固定，模型组直接用医用纱布和胶带固定。术后大鼠单笼单只饲养，自由进食和饮水，每天换药并观察伤口的愈合情况。于术后2,5,7,14d计算创面愈合率；同时，将各组新生皮肤剪下来，检测vegf的含量。结果详见表13和表14。
52.表13.各组动物在凝胶给予后第2,5,7,14d的损伤皮肤的愈合率（n=5）
53.表14.各组动物在凝胶给予后第14d损伤处新生皮肤中vegf含量的比较（n=5）
54.实验结果一：与模型组比较，配方10胶原蛋白凝胶组的大鼠损伤皮肤愈合率增加，但只在凝胶给予后第2d具有显著性差异（p《0.05）；而配方36胶原蛋白凝胶组的愈合率显著地提高，14d内均具有显著性差异（p《0.05）。与配方10凝胶比较，配方36凝胶的愈合率也明显增强，在凝胶给予后第2d和第5d时二者均具有显著性差异（p《0.05）。说明通过加入甘油、己二醇和β-葡聚糖，对重组ⅲ型人源化胶原蛋白的促皮肤损伤修复具有协同作用。
55.实验结果二：与模型组比较，配方10和配方36凝胶组修复皮肤中vegf含量明显提高（p《0.01）；同时，配方36比配方10修复皮肤中的vegf含量明显增多，具有统计学意义（p《0.05）。可以推测甘油、己二醇和β-葡聚糖的加入可以协同胶原蛋白促进vegf的生成，促进血管内皮细胞迁移、增殖和血管生成，从而促进皮肤损伤的修复。
56.实施例8本实施例为考察协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶的制备方法中加料顺序对凝胶的生物学活性的影响。以实施例5中配方36的凝胶配方作为考察基础。
57.本发明制备方法：s1：将重组ⅲ型人源化胶原蛋白、海藻糖、卡波姆、羟乙基纤维素和水混合均匀，加热至80℃后，200rpm搅拌30min，得到第一溶液；s2：将甘油、己二醇和β-葡聚糖加入到第一溶液中，200rpm搅拌10min，均质5min，均质速度3000rpm，然后开始降温；s3：待温度降至45℃以下，加入三乙醇胺调节ph为4.0~7.0，再搅拌5分钟出料，灌装后湿热灭菌即得。凝胶实物图如图6所示。
58.对比例2制备方法：s1：将海藻糖、卡波姆、羟乙基纤维素和水混合均匀，加热至80℃后，200rpm搅拌30min得到第一溶液；s2：将重组ⅲ型人源化胶原蛋白、甘油、己二醇和β-葡聚糖加入到第一溶液中，200rpm搅拌10min，均质5min，均质速度3000rpm，然后开始降温；s3：待温度降至45℃以下，加入三乙醇胺调节ph为4.0~7.0，再搅拌5分钟出料，灌装后湿热灭菌即得。
59.对比例3制备方法：s1：将海藻糖、卡波姆、羟乙基纤维素和水混合均匀，加热至80℃后，200rpm搅拌30min得到第一溶液；s2：将甘油、己二醇和β-葡聚糖加入到第一溶液中，200rpm搅拌10min，均质5min，
均质速度3000rpm，然后开始降温；s3：待温度降至45℃以下，加入重组ⅲ型人源化胶原蛋白，搅拌10min后加入三乙醇胺调节ph为4.0～7.0，再搅拌5分钟出料，灌装后湿热灭菌即得。
60.将所制备的三种重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶进行生物学活性考察，分别考察各凝胶对hacat细胞和hsf细胞生长活性和迁移的影响。实验方法同实施例3，具体结果如下：相较于正常细胞组，实施例7中的重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶明显能促进hacat细胞和hsf细胞的生长和迁移，24h时hacat细胞和hsf细胞数量分别增长了18.4%和23.1%，具有显著性差异（p《0.05），24h时划痕区域基本上汇合。对比例2和对比例3凝胶湿热灭菌后对hacat细胞和hsf细胞的生长未体现出明显的促进作用，其划痕区域的汇合程度也与正常细胞组相当（图8，图9）。
61.结果显示，先将重组ⅲ型人源化胶原蛋白与海藻糖、卡波姆、羟乙基纤维素和水混合，加热至80℃后，200rpm搅拌30min是重组ⅲ型人源化胶原蛋白湿热灭菌后保持生物学活性的一个必要前提。此步骤的目的之一是先将重组ⅲ型人源化胶原蛋白与一系列具有热稳定作用的原料混合均匀，制备成相互联结的“三层结构”，其中重组ⅲ型人源化胶原蛋白处在“三层结构”的中心，从而大大提高了重组ⅲ型人源化胶原蛋白热稳定性。
62.实施例9本实施例为验证所制备协同促修复热稳定重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶对动物皮肤的刺激性。选取6只健康、初成年的雌性白化兔，体重3kg
±
0.5kg，随机分成2组，分别为空白组和配方36凝胶组。空白组给予0.5ml灭菌水，配方36组给予0.5ml上述重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶。试验前12h将动物背部脊柱两侧被毛除去（约10cm
×
15cm区域），注意脱毛时不损伤皮肤。取受试物涂于兔背部两侧，用2.5cm
×
2.5cm的吸收性纱布块覆盖接触部位，然后用绷带固定6h。接触期结束后取下纱布，用持久性墨水对接触部位进行标记，并用温水清洗除去残留试验材料并拭干。按照gb/t 16886.10-2017医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏反应试验中动物皮肤刺激试验给出的记分系统（表15）描述每一接触部位在除去纱布后（1
±
0.1）h、（24
±
2）h、（48
±
2）h和（72
±
2）h记录各接触部位皮肤红斑和水肿反应情况并评分。皮肤刺激试验结果如表16所示：表15.皮肤反应记分系统
63.表16. 刺激反应积分。
64.由表16动物皮肤刺激试验结果可知，该重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶对白化兔的皮肤刺激试验，未见明显刺激性反应。
65.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。