一种细菌细胞膜/DNA四面体复合物及其制备方法和用途

本发明属于生物药物，具体涉及一种细菌细胞膜/dna四面体复合物及其制备方法和用途。

背景技术：

1、大量研究表明，自组装合成的dna四面体作为一种新型的核酸纳米药物，能够促进多种干细胞(脂肪干细胞、骨髓干细胞、神经干细胞等)再生，并且其自身的抗炎抗氧化功能也使其可以应用于多种疾病的治疗中。此外，这种三维的四面体结构拥有出色的生物安全性及灵活的可编辑性且可以被多数细胞通过内吞途径摄取。因此，dna四面体常被用作药物载体，多种核酸序列(适配体、sirna、microrna等)及化疗药物(紫杉醇、阿霉素等)被孵育、化学连接或者其他方式负载于其上，并被大量携载入细胞从而发挥相应作用。

2、公告号为cn109663134b的专利申请公开了采用dna四面体载5-氟尿嘧啶和as1411，其抗癌效果显著著强于5-氟尿嘧啶，并且安全性更好。5-氟尿嘧啶是作为最常见的尿嘧啶抗代谢类药物，进入体内后，转化成为氟尿嘧啶脱氧核苷酸(f-dump)，与胸苷酸合成酶的活性中心共价结合，抑制其酶活性，从而使脱氧核苷酸缺乏，影响dna合成。此外，氟尿嘧啶核苷(fump)能够以伪代谢物形式掺入dna和rna中影响细胞功能产生细胞毒性。as1411是由26个碱基组成的富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列，它可以形成g-四联体，不仅可以特异性地与肿瘤细胞核膜上高表达的核仁素相结合，起到核酸适配体的作用，还可以通过与核仁素形成复合物，引起核仁素再分配，抑制核糖体的生物合成并诱导肿瘤细胞的凋亡。as1411和5-氟尿嘧啶修饰的dna四面体同时具有肿瘤细胞靶向性及杀伤性，首先通过as1411靶向肿瘤细胞，dna四面体将5-氟尿嘧啶携载入肿瘤细胞并释放，影响肿瘤细胞dna及rna的合成，发挥肿瘤细胞的杀伤作用。

3、新的研究表明，微生物存在于肿瘤细胞和免疫细胞内，表明这些微生物可以影响肿瘤微环境的状态。肿瘤组织的微生物与正常组织的微生物明显不同，某些微生物在肿瘤组织中特异性聚集，使其成为强大的治疗靶点。

4、肿瘤与肿瘤微环境密切相关，肿瘤可以通过释放细胞信号分子影响其微环境，促进血管的生成和诱导免疫耐受，而微环境中的免疫细胞可影响癌细胞的增长和发育。肿瘤微环境是指肿瘤细胞存在的周围微环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质。肿瘤微环境通常呈现整体缺氧及酸性环境，肿瘤及周围组织细胞会大量凋亡，导致炎症浸润及炎症因子分泌，且肿瘤本身的发生发展也会引发相应的免疫反应。t细胞作为细胞免疫的主体类群，在肿瘤免疫细胞杀伤中具有重要作用。而在肿瘤微环境中，t细胞中cd8阳性t亚型可以对肿瘤细胞造成杀伤作用。

5、经as1411和5-氟尿嘧啶共同修饰的dna四面体是一种新型的dna纳米药物，它同时具有肿瘤细胞靶向性及杀伤性：首先通过dna适配体as1411靶向肿瘤细胞，dna四面体药物运输载体将5-氟尿嘧啶携载入肿瘤细胞并释放，影响肿瘤细胞dna及rna的合成，发挥肿瘤细胞的杀伤作用。体外应用时，其对肿瘤细胞有较为理想的杀伤作用，但应用于体内时，药物对肿瘤的浸润性差，聚集于肿瘤组织的药物浓度较低，导致其对实体瘤的生长抑制作用欠佳。同时，as1411和5-氟尿嘧啶共同修饰的dna四面体不能影响肿瘤微环境的免疫细胞，起到免疫增强的作用。

技术实现思路

1、尽管5-氟尿嘧啶和as1411修饰的dna四面体在体外具有较为理想的肿瘤细胞毒性，但应用于体内肿瘤时，由于药物的肿瘤浸润性较差，而对实体瘤的治疗效果不好。为了解决上述问题，本发明提供了一种细菌细胞膜/dna四面体复合物及其制备方法和用途。本发明针对dna四面体药物肿瘤浸润性差，体内应用效果不理想的问题，以细菌细胞膜为载体，借细菌细胞膜对肿瘤外聚集的细菌生物膜的天然趋化性，将四面体药物运载至肿瘤组织，并精准作用于肿瘤细胞，提高四面体药物在体内的药物疗效。

2、本发明提供了一种细菌细胞膜/dna四面体复合物，它是将细菌细胞膜作为药物载体，载dna四面体后得到的复合物。

3、进一步地，所述复合物是将细菌和dna四面体混合孵育后得到的复合物。

4、进一步地，所述孵育时细菌浓度为108～1010cfu/ml；和/或，所述dna四面体的浓度为500～4000nm。

5、进一步地，所述孵育时细菌浓度为109cfu/ml；和/或，所述dna四面体的浓度为2000nm。

6、进一步地，所述孵育的温度为37℃；和/或，所述孵育的时间为10～30min；

7、优选地，所述孵育的时间为15min。

8、进一步地，所述孵育后还包括提纯，步骤如下：离心，收集沉淀，戊二醛溶液固定，洗涤，再次离心；

9、优选地，所述离心的条件为8000～10000rpm离心5～10min；

10、和/或，所述戊二醛溶液的浓度为2～5％；

11、和/或，所述固定的时间为10～30min。

12、进一步地，

13、所述细菌为变异链球菌；

14、和/或，所述dna四面体由四条dna单链自组装合成；所述四条dna单链的核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.5所示；seq id no.3所示的核苷酸序列5’端连接5-氟尿嘧啶。

15、进一步地，所述dna四面体的合成方法包括以下步骤：将四条dna单链加入到tm缓冲液中，95℃维持10min，降温到4℃维持30min以上，即得；

16、优选地，所述四条dna单链为等摩尔比的四条dna单链。

17、本发明还提供了一种制备前述的细菌细胞膜/dna四面体复合物的方法，它包括如下步骤：

18、(1)将细菌浓度调整至108～1010cfu/ml；

19、(2)将dna四面体浓度调整至500～4000nm；

20、(3)将二者混合后孵育，即得；

21、优选地，步骤(1)中，将细菌浓度调整至109cfu/ml；

22、和/或，步骤(2)中，将dna四面体浓度调整至2000nm；

23、和/或，步骤(3)中，所述孵育的温度为37℃；和/或，所述孵育的时间为10～30min；

24、和/或，步骤(3)中，所述孵育后还包括提纯，步骤如下：离心，收集沉淀，戊二醛溶液固定，洗涤，再次离心；

25、更优选地，步骤(3)中，所述孵育的时间为15min；

26、和/或，步骤(3)中，所述离心的条件为8000～10000rpm离心5～10min；

27、和/或，所述戊二醛溶液的浓度为2～5％；

28、和/或，所述固定的时间为10～30min。

29、本发明还提供了前述的细菌细胞膜/dna四面体复合物在制备抗肿瘤药物中的用途；

30、优选地，所述肿瘤为人口腔鳞癌。

31、本发明还提供了一种抗肿瘤药物，它是以前述的细菌细胞膜/dna四面体复合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成。

32、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

33、本发明基于dna四面体纳米药物，将细菌细胞膜作为药物载体，利用细菌细胞膜对细菌肿瘤生物膜的天然趋化性，将dna四面体纳米药物运送至特异性聚集于肿瘤周围的细菌生物膜上，同时释放药物，使其能够精准应用于肿瘤细胞。本发明细菌细胞膜优选变异链球菌细胞膜。本发明不仅拥有良好的肿瘤生物膜趋化性，大大增强了药物对实体瘤的浸润性，并且细菌载体能够影响肿瘤微环境的免疫细胞，起到免疫增强作用，最终增强了药物对肿瘤生长的抑制作用。

34、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

35、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。