一种纳米颗粒疫苗的低温制备方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种纳米颗粒疫苗的低温制备方法。

背景技术：

1、功能核酸分为脱氧核糖核酸和核糖核酸，根据核酸的不同功能又可以分为sirna，mrna和反义核酸等等，目前被广泛的用在生物医药领域中。虽然功能核酸被广泛的应用，但是其利用率比较低，主要是其在生物体中极易受到核酸酶降解以及低的转染效率的限制，这严重影响了功能核酸的应用。多肽是靶向蛋白质靶点结合的天然靶点，特别是非药物靶点，因此多肽具有免疫原性，被广泛应用于癌症疫苗中。特别是新抗原肽，它只在肿瘤中表达而不在正常细胞中表达，因此绕过了中央胸腺耐受性，具有高度的免疫原性，可以和主要组织相容性复合体(mhcs)亲和，并能激活肿瘤特异性cd4+和cd8+t细胞产生免疫应答.然而，新抗原的免疫原性通常较弱，现阶段临床探索的癌症疫苗配方并不能引发强大的肿瘤抗原特异性cd8+t细胞的免疫应答，而这对肿瘤疫苗的抗肿瘤免疫却至关重要。这主要由于肿瘤疫苗在引流淋巴结(lns)的低效积聚、抗原呈递细胞(apc)细胞摄取不足以及低水平的抗原交叉呈递。

2、基于纳米颗粒的癌症疫苗(纳米疫苗)被广泛用在抗原和佐剂的共同递送上，这归因于纳米颗粒(<200nm)不仅可以选择性地聚集在引流淋巴结内来增加抗原的免疫原性和稳定性，还可以实现apc靶向递送和增强的交叉呈递。然而，纳米疫苗的载体材料(比如脂质体、金属有机框架、介孔二氧化硅、聚合物)本身可能会引起宿主反应在体内降解、代谢和排泄过程中会产生短期和长期毒性。除此之外，载体材料会产生想不到的免疫反应，比如：常见的聚合物载体聚乙二醇(peg)已被鉴定为具有免疫原性。聚乙二醇化的纳米颗粒注射到小鼠体内会诱发聚乙二醇(peg)特异性抗体，从而使得基于peg的药物或疫苗递送系统从体内快速清除。另外，抗原装载不足：抗原和佐剂大都是通过包封或者偶联在纳米颗粒上的，这导致纳米颗粒上抗原和佐剂的装载不足(低于<20％)，使得纳米疫苗在体内在免疫原性降低，免疫应答弱，从而难以获得强大的免疫反应，再者，纳米框架材料在对抗原保护的同时也阻碍了抗原捕获和抗原暴露，从而使得纳米疫苗难以像实现病毒一样多拷贝展示来介导有效的免疫反应。因此，开发一种简单而通用的免疫佐剂和抗原直接组装来共通递送用以降低合成的复杂性和增加合成的灵活性仍然是一个重要的技术问题。进一步的开发一个生物相容性好并且无毒可降解的抗原载体作为免疫佐剂，并能够将抗原有效的呈递到apcs的细胞质中要构建一种安全、高性能、有效抗原负载的纳米癌症疫苗仍然具有挑战性。

3、因此，本发明报告了一种新的策略来解决这些问题，我们将氟取代功能核酸与抗原肽在低温条件下进行自组装；由于分子静电引力、色散力作用二者很容易形成纳米材料，氟取代的核酸能够破坏碱基之间的氢键结合，逆转核酸的空间结构，增加核酸的活性位点，从而提高核酸的组装能力，比非氟取代更容易与抗原肽组装成纳米结构。另外，由于形成了纳米颗粒，提高了功能核酸和抗原肽对蛋白酶水解的抗性以及细胞质传递效率。氟取代材料疏水疏脂还大大提高了纳米材料的溶酶体的逃逸能力，从而减少功能核酸和抗原肽在溶酶体的降解。由于纳米材料的尺寸效应，它可以有效地在引流淋巴结富集，被apc细胞摄取之后，可以刺激dc细胞成熟，更好的刺激有效的抗原特异性cd8+细胞毒性t淋巴细胞(ctl)反应和有效的免疫介导的肿瘤治疗。这种氟取代功能核酸和抗原肽自组装形成纳米颗粒的方法，对于开发制备具有不同功能的纳米疫苗具有重要的科学意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种纳米颗粒疫苗的低温制备方法，其采用一种简单的低温条件下自组装方法将功能核酸和抗原肽进行自组装，可以实现有效的抑制肿瘤的生长，促进抗原肽的细胞质传递。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种纳米颗粒疫苗的低温制备方法，其特征在于：氟取代功能核酸和抗原肽在缓冲液中混合均匀，先于37℃反应1h～24h，再于4℃反应6h～72h，反应结束后离心收集沉淀、洗涤，即得到所述纳米颗粒疫苗。

4、优选的，上述一种纳米颗粒疫苗的低温制备方法中，所述氟取代功能核酸包括修饰氟原子核酸衍生物，所述氟取代功能核酸中的核酸为单链dna/rna或双链rna/dna中的一种或多种；所述氟取代功能核酸中氟取代在核酸中五元糖环的2’位置，或者氟原子在碱基上的任意位置修饰，氟原子在碱基上的修饰个数为一个或多个。所述抗原肽选自：(i)蛋白质抗原或其片段；(ii)肿瘤相关抗原或肿瘤新抗原；(iii)病毒抗原；所述抗原肽具体可以为人乳头瘤病毒e6蛋白、人乳头瘤病毒e7蛋白、间皮素、ova抗原肽(siinfekl或isqavhaahaeineagr)、obsl1抗原(regvelcpgnkyemrrhgtthslvihd)、hbv表面抗原(hbsag)、hbv核心抗原(hbcag)、血凝素抗原(ha)中的任意一种。氟取代的核酸由于其可以提高核酸的稳定性，广泛的应用在核酸适配体、g-四链体。氟原子作为极性最强的原子，可以显著的改变核酸的物理化学性质。氟取代的核酸能够破坏碱基之间的氢键结合，逆转核酸的空间结构，增加核酸的活性位点，从而提高核酸的组装能力。本发明中，以氟取代的具有免疫佐剂性质的功能核酸(cpg)为原料，进一步通过分子静电引力、分子堆叠以及水桥的作用，与抗原肽在低温下自组装形成功能核酸纳米疫苗，实现了无载体的递送免疫佐剂和抗原肽，避免了载体带来的免疫原性，并实现了抗原高装载率组装。本发明克服传统核酸纳米结构制备的限制，也避免了由于传统的高温制备纳米疫苗而导致的抗原丢失，展现了一种简单的、通用的实现任意核酸和抗原肽的直接组装，从而对开发制备具有不同功能的纳米疫苗具有重要的科学意义。

5、优选的，上述一种纳米颗粒疫苗的低温制备方法中，所述缓冲液的ph为6～8。

6、优选的，上述一种纳米颗粒疫苗的低温制备方法具体包括以下步骤：

7、(1)氟取代功能核酸原液的制备：将氟取代功能核酸溶解在无菌水中，室温条件下吹打均匀，得到浓度为50μm～200μm的氟取代功能核酸原液；

8、(2)抗原肽原液的制备：将抗原肽溶解在溶剂中，室温条件下混合均匀，得到浓度为1mm～10mm的抗原肽原液；

9、(3)纳米颗粒疫苗的制备：将氟取代功能核酸原液与抗原肽原液在缓冲液中混合均匀，所得混合液先于37℃反应1h～24h，再于4℃反应6h～72h，反应结束后于5000～10000rpm离心1min～60min收集沉淀、洗涤，即得到所述纳米颗粒疫苗；

10、其中，步骤(2)中，所述溶剂为水、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇、异丙醇中的一种或多种。

11、其中，步骤(3)中，所述混合液中氟取代功能核酸与抗原肽的摩尔比为1:1～1:100。

12、如上所述低温制备方法制备所得的纳米颗粒疫苗。

13、上述一种纳米颗粒疫苗在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

14、本发明的有益效果在于：

15、传统的自组装制备的温度达到了90℃～100℃，反应时间为0.1h～1.5h，这种条件下抗原容易发生失活(food.funct.2021,12,10083-10096；j.funct.foods.2015,18,28-34；j.agric.food.chem.2005,53,4962-4967)，并随着反应时间的延长，抗原丢失越严重，甚至是完全丢失，这导致抗原与igg和igm的结合能力直线下降，使得纳米疫苗的免疫效率大大降低。本发明提供的一种简单通用的低温制备纳米疫苗方法，利用氟取代的核酸可以实现低温条件下(37℃反应1h～24h，再于4℃反应6h～72h)与抗原肽的自组装形成纳米颗粒疫苗，37℃是抗原最活跃的温度，用于制备纳米疫苗最合适，另外，4℃条件下可以让纳米疫苗长到合适的纳米尺寸。本发明所制备的纳米颗粒疫苗可实现无载体的共递送免疫佐剂和抗原肽，避免了载体带来的免疫原性，并实现抗原高装载，同时，在低温条件下可以避免传统的高温制备纳米疫苗而导致的抗原丢失。本发明展现了一种简单的、通用的实现任意核酸和任意抗原肽的直接自组装，从而对开发制备具有不同功能的纳米疫苗具有重要的科学意义。该方法简单、原料易得，不添加任何载体，具有广泛的通用性，所得纳米结构具有较高的稳定性和超过的抗原装载效率，超高的新抗原密度增加了抗原提呈细胞(apc)对新抗原纳米疫苗的摄取，并呈递抗原，从而增强机体的先天免疫反应并驱动随后的适应性免疫反应。作为一种通用方法，本发明为未来临床环境中极简组合的疫苗设计提供了参考。

16、本发明在低温条件下制备纳米颗粒疫苗，不会让抗原肽的抗原丢失。

17、本发明提供的纳米颗粒疫苗无毒无害，不涉及任何有机溶剂。

18、本发明制备纳米颗粒疫苗的方法简单、绿色、温和且成本低廉。

19、本发明提供的纳米颗粒疫苗稳定性高，可以在体内良好的循环，富集在淋巴结区域。

20、本发明的制备策略可适用于未来临床环境中极简组合的疫苗设计。