一种含有洋地黄苷的滴眼液的制备方法与流程

1.本发明涉及一种药物制剂的制备，特别涉及一种新的含有洋地黄苷的滴眼液的制备方法。


背景技术：

2.含有洋地黄苷的滴眼液，是一种已经上市的药物，通用名称：七叶洋地黄双苷滴眼液，其组份为：每10ml含洋地黄苷0.15mg，七叶亭苷1.0mg，辅料为硼酸与纯化水，适应症为眼底黄斑变性以及眼疲劳，规格0.4ml:洋地黄苷0.006mg,七叶亭苷0.040mg。
3.其中的洋地黄苷（英文名称：digitalis glycosides）是洋地黄叶的提取物，含20多种强心甙，主要由3种不同的强心甙元—洋地黄毒甙元、羟基洋地黄毒甙元、芰他洛甙元与不同的糖缩合而成，作为眼药用的洋地黄叶提取物，在水中溶解。
4.目前市场上销售的洋地黄叶提取物，包括水提物和醇提物，以洋地黄苷计，含量为20％-60％ （重量百分比）。
5.七叶亭苷是从木犀科植物苦枥白蜡树的干燥枝皮或干皮中提取的一种香豆素类化合物，常温下为白色结晶性粉末，可采用合成方法制备，化学名称：6-(β-d-吡喃葡糖氧基)-7-羟基-2h-1-苯并呋喃-2-酮, 英文化学名称：6-(β-d-glucopyranosyloxy)-7-hydroxy-2h-1-benzopyran-2-one。七叶亭苷的其他名称包括：马粟树皮苷, 七叶林, 秦皮甲素, 七叶苷, bicolorin, crataegin, enallachrome, escosyl, esculetin 6-beta-d-glucoside, esculine。
6.七叶亭苷的溶解性：能溶于热水、热乙醇、乙酸、甲醇、吡啶及氯仿，微溶于泠水及乙醇。极微溶于乙醚。
7.由洋地黄提取物和七叶亭苷制备的滴眼液的制备方法现有技术已有报道，如：中国专利cn200510030723.7实施例3，中国专利cn200610147972.9实施例19，两者均以洋地黄叶干燥提取物投料，其中的提取物来源于有机层如氯仿，乙酸乙酯等。
8.中国专利cn200910242110.8实施例2公开了一种洋地黄提取物的制备及其应用，其中的提取物来源于水层，cn200910090337.5对比例2制备的洋地黄提取物来源于水层。
9.上述现有技术中，所有提取物的组分都含有洋地黄苷，但因提取方法不同，含量和成分也有差异，由于洋地黄叶提取物含有水溶性较低的成分，导致洋地黄干燥提取物在水中溶解困难，增加了滴眼液制备过程的操作难度，也造成得到的眼药水水溶液制剂稳定性差，存储时间短，长时间或低温储存溶液出现沉淀或色变，导致该药物生产困难。


技术实现要素：

10.本发明提供一种新的含有洋地黄苷的滴眼液的制备方法，和现有技术相比，本发明利用洋地黄叶提取物在水中微溶的特点，使用液态洋地黄叶提取物投料，溶解速度大大提高，提高了制剂制备效率，另外还意外的发现，所得滴眼液稳定性也大大提高，提升了药物质量。
11.本发明所述制备方法，步骤如下：步骤一，将硼酸20g，七叶亭苷0.1g投入到500ml注射用水中，室温搅拌5分钟使溶解，然后加入液态洋地黄叶提取物，加入量按照洋地黄苷计为0.015g，室温搅拌5分钟使溶解，使用氢氧化钠调节溶液ph值到5.5-6.5，搅拌5分钟，加入纯化水至1000ml；步骤二，药液过滤到无菌的储存罐中，随后在氮气保护下罐装到由聚乙烯颗粒制成的单位剂量容器中，密封包装，即得；其中含有洋地黄苷的滴眼液的包装规格为0.4ml，含有洋地黄苷为0.006mg，含有七叶亭苷0.04mg。
12.其中，所述聚乙烯颗粒制成的单位剂量容器为0.4ml容量的一次性使用容器。
13.本发明发现，先将硼酸和通常需要加热才能溶解的七叶亭苷投入水中搅拌，无需加热即可使七叶亭苷快速溶解（硼酸具有助溶作用），待其溶解后再加入本发明方法制备的液态洋地黄叶提取物可以使两种药物在不加热的情况下较快地溶解，从而加快了操作，提高了效率，使产品更加稳定。
14.本发明进一步发现，在灌装过程中通入氮气，可以防止氧化反应发生，使本发明配方组成更简化，更安全，无需任何其他添加剂。
15.本发明的关键在于，本发明所述液态洋地黄叶提取物采用以下方法制备得到，1）取洋地黄叶粗粉100g加入90%（v/v）乙醇溶液300ml，80℃回流提取60分钟，共提取三次，合并提取液，提取液回收乙醇，浓缩后离心过滤，得到含有洋地黄苷的固体；2）固体加水150ml分散，用等体积氯仿萃取，共三次，合并氯仿层，用2%(w/w)的naoh溶液1l洗涤氯仿液，分离氯仿层，氯仿层用水洗涤至水层呈中性，分离氯仿层，收集所有的水层与naoh溶液层，合并后浓缩得含有洋地黄苷的浓缩物100ml；3）含有洋地黄苷的浓缩物用100ml50%的丙酮水溶液溶解，再用等体积乙酸乙酯萃取二次，分离后得到含有洋地黄苷的水层，水层经hplc检测，其中洋地黄苷为1.36mg/10ml。
16.本发明利用部分洋地黄苷在水中溶解，部分洋地黄苷在水中微溶的特点，制备一种液态洋地黄叶提取物，并用其投料，溶解速度大大提高，提高了制剂制备效率，另外还意外的发现，所得滴眼液稳定性也大大提高，提升了药物质量。
17.本发明发现，苷类溶解性取决于分子结构，一般极性大的，糖基越多的，水溶性越大；而苷元如果为大分子的或低极性的，且糖基少，则水溶性差。本发明正是利用这个特性，通过提取方法的改进得到一种可溶于水的，且适合制备成滴眼液的洋地黄叶提取物。
18.本发明方法所得洋地黄叶提取物是一种复合洋地黄苷提取物，含有多种成分，主要成分是水溶性的，但有部分是两亲性的，即可溶于水，又可以溶于有机溶剂，因此本发明的提取物是可以溶于水的成分。本发明的方法中，步骤1）是90%乙醇提取后，将乙醇除去，得到溶于水中的产物，并干燥得到固体，其中包括了水溶性的和两亲性的成分，但主要是水溶性的。步骤2）使用氯仿萃取，目的是将上一步固体中的脂溶性成分去除，使用碱性水溶液洗涤氯仿层，是为了最大限度保留有效成分，避免将少量两亲性成分由氯仿带走去除干净，本步骤最后是将本步骤的所有水层集合在一起并浓缩，其中的主要成分是水溶性的，但有部分是两亲性的成分。步骤3）用丙酮水溶液溶解上一步的浓缩液是没有问题的，因为其中的成分即有水溶性的，又有两亲性的，用乙酸乙酯萃取是为了去除其中更倾向于脂溶性的两亲性部分，使产物更容易溶于水，最后得到水层是本发明的产物，其中洋地黄苷含量为1.36mg/10ml。
19.本发明经过上述处理，特别是步骤3）浓缩物用100ml50%的丙酮水溶液溶解，再用等体积乙酸乙酯萃取二次，分离乙酸乙酯层得到含洋地黄叶提取物的水层，是为了去除其中更倾向于脂溶性的两亲性成分，使产物更容易溶于水，该水层经过检测并调节好浓度后，可以直接作为原料进行投料，对于液体制剂来说，这种投料方法，可以解决难溶性物料洋地黄苷在配制过程中因难溶导致的所有问题，克服了现有技术的缺陷，取得了意想不到的技术效果。本发明的方法在物料溶解速度和产品稳定性方面均优于现有技术。
附图说明
20.图1，本发明液态洋地黄叶提取物hplc色谱图。
具体实施方式
21.以下通过实施例进一步说明本发明。
22.实施例1含有洋地黄苷的滴眼液配方：七叶亭苷0.1g加入液态洋地黄叶提取物（加入量按照洋地黄苷计）15mg硼酸20g氢氧化钠适量加入纯化水至1000ml。
23.制备方法：步骤一，将硼酸20g，七叶亭苷0.1g投入到500ml注射用水中，室温搅拌5分钟使溶解，然后加入液态洋地黄叶提取物（加入量按照洋地黄苷计为0.015g），室温搅拌5分钟使溶解，使用氢氧化钠调节溶液ph值到5.5-6.5，搅拌5分钟，加入纯化水至1000ml；步骤二，药液过滤到无菌的储存罐中，随后在氮气保护下罐装到由聚乙烯颗粒制成的单位剂量容器中，密封包装，即得；其中含有洋地黄苷的滴眼液的包装规格为0.4ml，含有洋地黄苷0.006mg，含有七叶亭苷0.04mg。
24.其中，所述聚乙烯颗粒制成的单位剂量容器为0.5ml容量的一次性使用容器。
25.所述液态洋地黄叶提取物，制备方法如下：1）取洋地黄叶粗粉100g加入90%（v/v）乙醇溶液300ml，80℃回流提取60分钟，共提取三次，合并提取液，提取液回收乙醇，浓缩后离心过滤，得到含有洋地黄苷的固体；2）固体加水150ml分散，用等体积氯仿萃取，共三次，合并氯仿层，用2%(w/w)的naoh溶液1l洗涤氯仿液，分离氯仿层，氯仿层用水洗涤至水层呈中性，分离氯仿层，收集所有的水层与naoh溶液层，合并后浓缩得含有洋地黄苷的浓缩物100ml；3）含有洋地黄苷的浓缩物用100ml50%的丙酮水溶液溶解，再用等体积乙酸乙酯萃取二次，分离后得到含有洋地黄苷的水层，水层经hplc检测，其中洋地黄苷为1.36mg/10ml。
26.本发明液态洋地黄叶提取物中洋地黄苷的含量测定属于现有技术，如可以采用中国专利cn200610147972.9中的方法检测。
27.实施例2
本发明液态洋地黄叶提取物hplc色谱图，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(200mm
×
4.6mm，5μm)；以水
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乙腈为流动相(水与乙腈的体积比为1∶1)；流速1ml/min；检测波长220nm。取20μl本发明所述液态洋地黄叶提取物，在上述色谱条件下检测，所得色谱图见图1。
28.对比例：干燥洋地黄叶提取物的制备：1）取洋地黄叶粗粉100g加入90%乙醇溶液300ml，于80℃回流提取60分钟，共提取三次，合并提取液，所得提取液回收乙醇，浓缩液离心过滤，得到固体。
29.2）固体加水150ml分散，用等体积氯仿萃取，共三次，合并氯仿层，用2%(w/w)的naoh溶液1l洗涤氯仿液，分离氯仿层，氯仿层用水洗涤至水层呈中性，分离氯仿层，水层与naoh溶液层合并浓缩得浓缩物100ml；3）浓缩物干燥后得到干燥洋地黄叶提取物51.2mg，经含量测定，干燥洋地黄叶提取物中含有洋地黄苷为20.4mg。
30.采用上述干燥洋地黄叶提取物制备含有洋地黄苷的滴眼液的制备方法，所述方法步骤入下：1)步骤一，将硼酸20g和七叶亭苷0.1g投入到500ml注射用水中，然后加入干燥洋地黄叶提取物15mg升温到40℃搅拌30分钟使溶解，使用氢氧化钠调节溶液ph值到5.5-6.5，搅拌，加入纯化水至1000ml。
31.2)步骤二，药液过滤到无菌的储存罐中，随后在氮气保护下罐装到由聚乙烯颗粒制成的单位剂量容器中，密封包装，即得；其中含有洋地黄苷的滴眼液的包装规格为0.4ml，含有洋地黄苷0.006mg，含有七叶亭苷0.04mg。
32.实验例以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果。
33.一、溶解性实验实验采用以下方法投料，将硼酸20g，七叶亭苷0.1g投入到500ml注射用水中，然后加入洋地黄叶提取物0.015g；投料方法采用上述相同方法进行，其中的洋地黄苷的制备采用以下不同方法制备：1）用本发明实施例1的方法制备洋地黄叶提取物投料2）中国专利cn2005100307237实施例制备例1方法制备洋地黄叶提取物投料3）中国专利cn200610147972.9实施例15方法制备洋地黄叶提取物投料4）本发明对比例方法制备洋地黄叶提取物投料观察不同方法制备的物料投料后，在室温搅拌的情况下物料溶解时间，结果见下表：表1，溶解时间表
34.二、稳定性考察按照包装规格为0.4ml含有洋地黄苷0.006mg，含有七叶亭苷0.04mg制备含有洋地黄苷的滴眼液，采用以下四种方法制备：1）用本发明实施例1的方法制备洋地黄叶提取物并制备滴眼液2）中国专利cn2005100307237实施例制备例1方法制备洋地黄叶提取物，实施例3方法制备滴眼液3）中国专利cn200610147972.9实施例15方法制备洋地黄叶提取物，实施例19方法制备滴眼液4）本发明对比例方法制备洋地黄叶提取物并制备滴眼液含量测定采用本发明实施例2的方法。
35.实验1、45℃高温下放置90天加速稳定性实验，结果见下表：表2，高温加速稳定性表
[0036] 实验2、4500lx条件下照射90天加速稳定性实验，结果见下表：表3，光照加速稳定性表
[0037] 三、动物实验:本发明实施例1制备的含有洋地黄苷的滴眼液对实验性大鼠黄斑变性的作用实验方法:以碘酸钠尾静脉注射的方法建立黄斑变性大鼠模型，将造模后的大鼠随机分为2组，每组各10只，分别为生理盐水组、含有洋地黄苷的滴眼液组。正常组10只正常饲养，造模后第1天，分别予生理盐水、含有洋地黄苷的滴眼液滴眼，3次/天，给药时间分别为9:00、12:00、15:00，共给药10天，10天后对动物进行处理，对视网膜病理组织进行观察检测。
[0038]
病理组织的固定、脱水、包埋、切片方法如下：(1)取材：大鼠麻醉后快速摘取眼球，小心去除多余的肌肉及结膜组织；(2)固定：1)做好前房穿刺后置于4%pfa溶液中预固定20min；2)沿角膜缘剪开角膜，去除眼前节及部分玻璃体，余下组织再次置于4％pfa溶液中，4℃固定24h；(3)脱水：弃pfa溶液，将组织置于装有30％蔗糖溶液的ep管中脱水，待组织沉入管底时，脱水结束；(4)包埋：弃蔗糖溶液，将组织置于装有o．c．t包埋剂的包埋盒中，将视神经长轴方向与包埋盒长边平行放置，摆好位置后，缓慢用液氮冷冻组织；待组织完全冷冻后，放置于-80℃冰箱保存。
[0039]
(5)切片：将组织块从-80℃冰箱取出，放置于-20℃冰箱平衡30min。使用冰冻切片机沿眼球视神经长轴方向行8μm切片，当观察到组织过视神经时，使用洁净防脱载玻片开始收片，每片收集2-3个样本，室温晾干加入o.c.t，待o.c.t干后，将切片置于装有丙酮的玻璃染色缸中，后固定15min；干燥后-20℃保存。
[0040]
采用tunel法对切片进行染色，风干，-20℃冰箱避光保存；第二天采用荧光倒置显微镜观察，分别采用紫外光和绿色光进行激发，每组随机选取3张切片，每张切片选取随机选取5个视野进行拍摄，分别计数各视野内凋亡阳性细胞数和细胞总数，计算凋亡率(％)=凋亡阳性细胞数／同视野细胞总数
×
100％。
[0041]
tunel法检测视网膜细胞凋亡结果:10天时，模型对照组视网膜色素上皮层及外核层见大量呈均匀固缩状或月牙状的
凋亡细胞，与正常组比较，差异有统计学意义(p＜0.05)。含有洋地黄苷的滴眼液组与模型对照组比较，视网膜色素上皮层及外核层细胞凋亡均减少 (p＜0.05)。
[0042]
表4给药10天后各组大鼠视网膜细胞凋亡率%比较
[0043]
注，*：与正常组比较，差异有统计学意义(p《0.05)。
&
：与模型组比较，差异有统计学意义(p《0.05)。
[0044]
结论: 含有洋地黄苷的滴眼液对实验性干性amd大鼠视网膜有保护作用，能够改善视网膜细胞功能及病理组织损伤，可抑制实验性大鼠实验性大鼠黄斑变性视网膜细胞凋亡。