一种基于卟啉接枝羧甲基壳聚糖的酸/H2O2响应型纳米微球的制备及应用

本发明涉及一种基于卟啉接枝羧甲基壳聚糖的酸/h2o2响应型纳米微球的制备及应用，属于先进功能材料和生物医药。

背景技术：

1、细菌感染一直是全球重点关注的公共卫生安全问题。抗生素的使用虽然在一定程度上降低了细菌感染性疾病的发病率和死亡率，但随着抗生素的广泛使用甚至滥用，细菌对抗生素的耐药性问题暴露出来了。与传统抗菌疗法不同，光疗具有时空可控性、低毒且无耐药性等优点，在灭活微生物、治疗感染疾病等方面有极好的应用前景。光疗过程中光敏剂的选择十分重要。传统的光敏剂存在易发生自聚集猝灭、周期代谢时间短、缺乏靶向性等问题，使得它们的抗菌治疗效果并不理想。同时，由于光疗是一种局部治疗方式，精确成像指引对其亦至关重要。因此研究和开发一种改善传统光敏剂缺陷的新型抗菌策略尤为重要。

2、纳米技术的发展为改善传统光敏剂缺陷的新型抗菌治疗提供了有效的方案，将光敏剂用天然亲水载体包封起来，可以改善其自聚集猝灭现象，延长血液循环代谢时间。另外，通过成像指引可以解决光疗局部治疗的问题。然而，大多数纳米诊疗体系都是基于简单的物理封装，药物泄漏问题不可避免。此外，它们大多缺乏细菌特异性，对临近正常细胞存在非特异性损伤。同时，现有的成像指引大多是连续照射，存在背景荧光干扰，还会激活光敏剂，造成非特异性损伤，危害正常组织。因此亟待开发一种兼具有效的光敏剂装载量、感染部位的响应性、感染部位自发成像指引且具有高效杀菌于一体的新型纳米材料，用于细菌感染的治疗。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、传统纳米材料大多采用物理封装，直接涂敷于伤口处，易发生药物泄露并缺乏感染部位的响应性。同时，传统成像指引大多是连续照射，存在背景荧光干扰，还会造成非特异性损伤，危害正常组织。

3、[技术方案]

4、为解决以上问题，本发明设计构建了细菌微环境响应型兼具光动力、光热和自发荧光成像多功能于一体的高效光敏剂负载量的纳米微球，并将其用于自发荧光成像指引的细菌靶向光疗，其克服和解决了传统纳米材料易发生药物泄露、缺乏感染部位的响应性，传统成像指引背景干扰、非特异性损伤的问题。

5、本发明的第一个目的是一种制备基于卟啉接枝羧甲基壳聚糖的酸/h2o2响应型纳米微球的方法，包括如下步骤：

6、(1)卟啉接枝羧甲基壳聚糖(cmc-pc)的合成：

7、将5,10,15,20-四-(4-氨基苯基)卟啉(tapp)、碱试剂、n,n-二甲基甲酰胺混合，混匀后滴加氯乙酰氯，室温下进行反应；反应结束后，加水析出沉淀，分离收集沉淀，洗涤，得到反应中间体；然后将反应中间体、碱试剂、n,n-二甲基甲酰胺混合，混匀后滴加羧甲基壳聚糖(cmc)的水溶液，室温下进行反应；反应结束后，透析，离心、收集固体，干燥，得到卟啉接枝羧甲基壳聚糖，记作cmc-pc；

8、(2)氨基小分子改性：

9、将cmc-pc、碱试剂和n,n-二甲基甲酰胺混合，混匀后缓慢滴入n,n,n',n'-四乙基二乙烯三胺，室温下进行反应，反应结束后透析，再将透析液离心、收集固体，干燥，得到氨基小分子改性卟啉分子键合羧甲基壳聚糖，记作cmc-pc-n；

10、(3)酸/h2o2响应型纳米微球(cppo@cmc-pc-n)的制备：

11、将cmc-pc-n、双(2,4,5-三氯水杨酸正戊酯)草酸酯(cppo)溶于四氢呋喃中，得到混合液；然后将混合液缓慢加入到磷酸盐缓冲溶液中，混匀反应，结束后除去四氢呋喃，抽滤，收集滤液，即得cppo@cmc-pc-n。

12、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，tapp、碱试剂和氯乙酰氯的摩尔比为1：(10-15)：(10-15)。

13、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，反应中间体与碱试剂的摩尔比为1：(1-2)。

14、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，反应中间体与cmc的质量比为(3-5):1。

15、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，cmc的水溶液的浓度为1-5mg/ml；具体可选3mg/ml。

16、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中制备反应中间体的过程中，n,n-二甲基甲酰胺相对tapp的用量条件为0.03-.05ml/mg。具体可选0.04ml/mg。

17、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中制备cmc-pc的过程中，n,n-二甲基甲酰胺相对反应中间体的用量条件为0.03-.05ml/mg。具体可选0.04ml/mg。

18、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中碱试剂为碳酸钾。

19、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中透析的截留分子量为3000-5000。

20、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，cmc-pc、碱试剂和n,n,n',n'-四乙基二乙烯三胺的摩尔比为1：(10-15)：(10-25)。

21、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，n,n-二甲基甲酰胺相对cmc-pc的用量条件为0.1-0.5ml/mg。具体可选0.25ml/mg。

22、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中碱试剂为碳酸钾。

23、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中透析的截留分子量为3000-5000。

24、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，磷酸盐缓冲溶液的ph值为7.0-7.4。

25、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中cmc-pc-n和cppo的质量比为1：(1.5-2)。具体可选1:1.6。

26、在本发明的一种实施方式中，四氢呋喃相对cmc-pc-n的用量条件为1-3ml/mg；具体可选2ml/mg。

27、在本发明的一种实施方式中，四氢呋喃与磷酸盐缓冲溶液的体积比为1:(2-5)；具体可选1:3。

28、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中1mg/ml cppo@cmc-pc-n中氨基小分子改性卟啉分子(pc-n)的含量为0.1-0.5mg/ml，cppo的含量为0.4-0.8mg/ml。

29、在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括：

30、(1)卟啉接枝羧甲基壳聚糖(cmc-pc)的合成：

31、将5,10,15,20-四-(4-氨基苯基)卟啉(tapp)溶于5-10ml n,n-二甲基甲酰胺，加入碳酸钾，在搅拌状态下缓慢滴入氯乙酰氯，室温搅拌反应9-12h，反应结束后，将反应液滴入大量水中，产物沉淀析出，多次离心清洗获得反应中间体1；

32、将反应中间体1溶于4-8ml n,n-二甲基甲酰胺，加入碳酸钾，在搅拌状态下缓慢滴入4-16ml羧甲基壳聚糖(cmc)的水溶液，室温反应9-12h，反应结束后透析3-4天除去未反应的碳酸钾、盐酸等杂质，透析液离心弃上清，冷冻干燥后，通过索式提取除去未反应的反应中间体1，真空干燥后获得卟啉接枝羧甲基壳聚糖，记作cmc-pc；

33、(2)氨基小分子改性：

34、将cmc-pc溶于5-10ml n,n-二甲基甲酰胺，加入碳酸钾混合，在搅拌状态下缓慢滴入n,n,n',n'-四乙基二乙烯三胺，室温反应9-12h，反应结束后透析3-4天除去未反应的n,n,n',n'-四乙基二乙烯三胺、碳酸钾、盐酸等杂质，透析液离心弃上清，冷冻干燥后获得氨基小分子改性卟啉分子键合羧甲基壳聚糖，记作cmc-pc-n；

35、(3)酸/h2o2响应型纳米微球(cppo@cmc-pc-n)的制备：

36、将溶解于1-3ml四氢呋喃的cmc-pc-n和双(2,4,5-三氯水杨酸正戊酯)草酸酯(cppo)缓慢注入到5-9ml磷酸盐缓冲溶液中，混合物在通风橱中剧烈搅拌9-12h左右除去四氢呋喃，通过抽滤除去混合液中未包裹进去的cppo，将得到的滤液转移到10ml容量瓶中定容，得到cppo@cmc-pc-n。

37、在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中索式提取后的洗涤液在紫外光谱中来自于卟啉的峰值始终低于0.2-0.4。

38、本发明的第二个目的是本发明所述的方法制备得到的基于卟啉接枝羧甲基壳聚糖的酸/h2o2响应型纳米微球cppo@cmc-pc-n。

39、在本发明的一种实施方式中，所述的cppo@cmc-pc-n中cmc-pc-n的结构单元的结构式如式(ⅰ)：

40、

41、式中，n＝20-2000。

42、本发明的第三个目的是提供一种上述酸/h2o2响应型纳米微球在制备用于光动力/光热杀菌的杀菌材料中应用。

43、本发明的第四个目的是提供一种用于非疾病的诊断与治疗的光动力/光热杀菌方法，所述方法是采用上述酸/h2o2响应型纳米微球作为杀菌材料。

44、在本发明的一种实施方式中，所述的用于非疾病的诊断与治疗的光动力/光热杀菌方法是加入cppo@cmc-pc-n进行光照；

45、具体包括如下步骤：将cppo@cmc-pc-n溶于溶剂中，之后和菌液混合，然后在适当光源下进行照射10min，再梯度稀释涂布于固体培养基上，培养12-24h后对菌落进行计数，可得到杀菌率；其中溶剂为液体培养基，菌液包括金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，光源为白色led灯。

46、本发明的第五个目的是提供一种上述酸/h2o2响应型纳米微球在制备用于自发荧光成像的探针中应用。

47、本发明的第六个目的是提供一种用于非疾病的诊断与治疗的自发荧光成像指引方法，所述方法是采用本发明所述的基于卟啉接枝羧甲基壳聚糖的酸/h2o2响应型纳米微球作为成像材料。

48、在本发明的一种实施方式中，所述的用于非疾病的诊断与治疗的自发荧光成像指引方法是在伤口感染处加入cppo@cmc-pc-n；

49、具体包括如下步骤：将cppo@cmc-pc-n涂抹于感染金黄色葡萄球菌的小鼠伤口处，采用ivis成像系统对小鼠进行拍摄，得到伤口处的自发荧光成像图。

50、[有益效果]

51、(1)本发明制备得到的cppo@cmc-pc-n中光敏剂卟啉与天然聚合物羧甲基壳聚糖采用化学结合的方式固定，从而避免了光敏剂的泄露问题并改善了单一光敏剂卟啉的稳定性、生物相容性以及血液循环时间。

52、(2)本发明制备得到的cppo@cmc-pc-n由于其内部丰富的氨基，在细菌弱酸性环境中质子化转变为季铵盐，导致纳米微球亲水性提高，发生特异性解离并与带负电的细菌细胞膜静电结合，从而实现了感染部位的ph响应性解离，提高细菌靶向性。

53、(3)本发明制备得到的cppo@cmc-pc-n中独特的cppo可与细菌微环境中h2o2反应，激活光敏剂发出荧光，从而实现感染部位的自发荧光成像指引，提高光动力和光热效果。