本发明涉及益生菌安全性评估,尤其涉及一种益生菌潜在风险评估方法。
背景技术:
1、近年来,越来越多的有益微生物应用于食品、医疗等领域,这些有益微生物在维持肠道稳态,调节免疫力等有益健康的方面发挥着重要作用。这些有益微生物被人类服用,因此在被确定为益生菌并用于大规模生产之前,必须经过安全性评价。
2、耐药性是指细菌对抗菌药物不敏感的现象,一旦致病菌对某种抗生素产生了耐药性,那么该类抗生素可能就会失效。抗生素耐药基因(antibiotic resistance genes,args)是编码耐药性状的一段核苷酸序列,其不仅可以使细菌产生耐药性,还能在环境中通过质粒、接合元件等可移动遗传元件转移到其他细菌中,从而导致其他细菌产生同样的耐药性。毒力基因(virulence genes,vgs)是有利于致病菌在宿主体内生存和致病的基因,包括致病菌在宿主体内的定植、有毒物质的产生等。通过序列比对方法,可以检测到益生菌基因组中携带的所有args和vgs。
3、目前对益生菌的安全性评价方法主要是:(1)在体内或体外研究候选菌株的功能时,观测益生菌是否具有耐药表型和产毒能力,进而评价安全性(如文献“徐进,严卫星,杨宝兰,李志刚.中国发酵乳制品益生菌菌种的安全性评估[j].卫生研究,2008(02):193-195.”中通过检测益生菌菌种对抗生素的最低抑菌浓度,来评估益生菌对抗生素的耐药性)。(2)通过序列比对算法,检测益生菌基因组中存在的args、vgs以及可移动遗传元件,然后分别就这三个方面讨论该菌株基因组上的风险(例如,专利cn114277161a通过高通量测序技术,结合抗生素抗性基因数据库,来分析杀菌型乳制品中益生菌携带的抗生素耐药基因)。
4、然而这些评价方法存在以下问题:(1)无法观测到益生菌的潜在风险。益生菌基因组中存在的args和vgs理论上可通过可移动遗传元件发生转移从而造成潜在风险。(2)无法对益生菌种的综合风险给出有效评价。不同的菌株会表现出不同的潜在风险,基于益生菌的基因组数据可以分别分析在抗生素耐药基因存在及其转移、毒力基因存在、基因组稳定性上的风险,但无法得出综合评价结果。
技术实现思路
1、为了解决现有的益生菌安全性评价方法无法综合评估潜在风险的技术问题,本发明提供了一种益生菌潜在风险评估方法。该评估方法能够解决益生菌潜在风险评估中的复杂性和不确定性问题,综合考虑了可能的风险因素,并且能够综合同一菌种的多个菌株,在菌种水平上全面、定量地评估益生菌的潜在风险。
2、本发明的具体技术方案为:
3、一种益生菌潜在风险评估方法,包括以下步骤:
4、步骤s1:获取益生菌的基因组测序数据,确定潜在风险评估指标,分别为耐药性、毒性和基因组不稳定性;
5、步骤s2:设置潜在风险评估指标的权重;
6、步骤s3:基于评估指标,检测基因组中的潜在风险序列;
7、步骤s4:量化菌株在单个潜在风险评估指标下的风险,确定菌株在该指标下的风险等级;
8、步骤s5:统计三个潜在风险评估指标下不同风险等级菌株数量占全部菌株的比例;
9、步骤s6:根据步骤s5的统计结果和步骤s2设置的权重,确定三个潜在风险评估指标下益生菌的综合风险等级。
10、本发明的方法在评估益生菌潜在风险的过程中,考虑到了益生菌的安全风险是多因素(包括耐药性、毒性和基因组不稳定性)共同作用的结果,将耐药性、毒性和基因组不稳定性作为评价指标,分别将三个指标下的安全风险量化为风险得分和风险等级,再对综合风险进行量化,可以综合考虑可能的风险因素并定量评价益生菌的潜在风险,因而能实现益生菌潜在风险的全面、整体、有效评价。
11、此外,本发明的方法能综合同一菌种的多个菌株,可以在菌种水平上进行潜在风险评估。评估结果能够涵盖菌种,对新菌株的潜在安全风险具有一定的预测性。
12、作为优选,步骤s2中,耐药性指标的权重为0.635~0.640,毒性指标的权重为0.105~0.110,基因组不稳定性指标的权重为0.255~0.260,三个潜在风险评估指标的权重之和为1。
13、按照耐药性的重要性稍微大于基因组不稳定性,显著大于毒性,基因组不稳定性稍微大于毒性的重要性的原则,构建重要性比较矩阵,计算重要性比较矩阵中最大特征值对应的特征向量,对特征向量进行一致性检验和归一化处理,得到权重向量,权重向量中的元素即为三个指标对应的权重值。最终确立的三个潜在风险评估指标的权重在用于益生菌潜在风险评估时,具有较高的准确性和科学性。
14、作为优选,步骤s3所述潜在风险序列如下:耐药性指标对应的风险序列为抗生素耐药基因序列,毒性指标对应的风险序列为毒力基因序列,基因组不稳定性指标对应的风险序列为染色体上的可移动序列和质粒。
15、作为优选步骤s4的具体过程包括以下步骤:
16、步骤s41:将耐药性指标对应的抗生素耐药基因序列和基因组不稳定性指标对应的质粒,按照转移的难易程度分类;并设置每个类别的权重;
17、步骤s42:计算菌株在单个指标下的风险得分;
18、步骤s43:根据风险得分,确定菌株在该指标下的风险等级。
19、作为优选,步骤s41中,将耐药性指标对应的抗生素耐药基因序列和基因组不稳定性指标对应的质粒,按照转移的难易程度分类如下:类别1,不易转移;类别2,可能转移;类别3,极易转移;类别1的权重为0.105~0.110,类别2的权重为0.305~0.310,类别3的权重为0.580~0.585,三个类别的权重之和为1。
20、作为优选,步骤s42中,耐药性指标下的风险得分sarg计算公式如下:
21、
22、其中,ni是第i类抗生素耐药基因的个数,ki是第i类抗生素耐药基因的权重,i=1,2,3。
23、作为优选,步骤s42中,基因组不稳定性指标下的风险得分sm计算公式如下:
24、
25、其中,lmge/lchr表示染色体移动率,lmge是染色体中可移动序列长度,lchr是染色体长度,σ是菌株的染色体移动率与所属菌种的染色体移动率平均值之间的偏差,mi是第i类质粒的个数,ki是第i类和质粒的权重,i=1,2,3。
26、作为优选,步骤s42中,毒性指标下的风险得分svg计算公式如下:
27、
28、其中,nvg是菌株基因组中检出的毒力基因个数,n是产毒所需全部基因个数。
29、在上述公式中:sarg和sm计算公式考虑到了不同类别抗生素耐药基因、染色体上的可移动序列以及染色体外不同类别质粒造成的潜在风险程度不同;svg计算公式综合考虑了毒力基因的数量和产毒所需的全部基因数量。采用本发明中的风险得分公式,对菌株在三个评估指标下的潜在风险进行量化,能够较为准确地反映菌株的潜在风险。
30、作为优选,步骤s43中,基于风险得分确定风险等级的标准如下:
31、耐药性指标:耐药性指标下的风险得分sarg≤0.109,则风险等级为ⅳ;0.109<sarg≤0.309,则风险等级为ⅲ;0.309<sarg≤1.164,则风险等级为ⅱ;sarg>1.164,则风险等级为ⅰ;毒性指标:毒性指标下的风险得分svg=0,则风险等级为ⅳ;svg=1,则风险等级为ⅲ;svg=2,则风险等级为ⅱ;svg=3,则风险等级为ⅰ;
32、基因组不稳定性指标:基因组不稳定性指标下的风险得分sm≤0.109,则风险等级为ⅳ;0.109<sm≤0.309,则风险等级为ⅲ;0.309<sm≤1.164,则风险等级为ⅱ;sm>1.164,则风险等级为ⅰ。
33、作为优选,步骤s6的具体过程包括以下步骤:
34、s61:根据步骤s5的统计结果,建立评价矩阵;
35、s62:使用模糊算子,结合步骤s2为风险评估指标设置的权重,对评价矩阵进行加权求和,得对每个风险等级的隶属度分数;
36、s63:按最大隶属度原则,确定三个潜在风险评估指标下益生菌的综合风险等级。
37、与现有技术相比,本发明具有以下优点:
38、本发明的评估方法综合考虑了多个可能的风险因素,包括抗生素耐药基因的存在及其转移、毒力基因的存在,以及抗生素耐药基因转移到其他细菌中的风险,且综合了同一菌种内的多个菌株,能够在菌种水平上全面、定量地评估益生菌的潜在风险。