皂苷衍生物在制备用于治疗和预防溃疡性结肠炎药物中的用途、制备方法及应用

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及皂苷衍生物在制备用于治疗和预防溃疡性结肠炎药物中的用途、制备方法及应用，是通过植物化学的手段从白头翁[pulsatillachinensis(bunge)regel]干燥根中分离得到的28个齐墩果烷型皂苷衍生物，此类化合物在抑制mlck通路激活，预防与治疗溃疡性结肠炎的应用。

背景技术：

1、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)是一种以腹痛、腹泻、直肠出血为主要症状的慢性复发性炎症性肠道疾，严重影响患者的工作能力和生活质量。虽然溃疡性结肠炎的治疗取得了很大的进展，但其发病机制尚不清楚，包括遗传、环境或免疫因素的积累。目前治疗uc的药物疗法包括氨基水杨酸酯类药物(如美沙拉嗪，mlz)、糖皮质激素和免疫抑制试剂，但上述治疗均不能帮助患者摆脱长期用药所带来的痛苦和严重的副作用。此外，uc的高复发率和严重并发症与结直肠癌的高风险相关。

2、uc发病起因于结肠粘膜上皮屏障受到损伤，上皮细胞层渗透性增加，免疫原性物质进入肠壁引发一系列过度免疫应答反应。dss诱导的小鼠uc模型是用于uc发病机制和药物研究的经典模型。在uc动物模型中典型的病理学变化为体重降低、结肠组织缩短、dai评分升高、长组织上皮屏障损伤以及结肠组织tnf-α异常高表达。肠上皮屏障包括上皮单层细胞和细胞间起调节屏障渗漏的紧密连接结构，在肠道稳态环境中起到了关键作用。研究表明上皮细胞肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，mlck)与调节上皮屏障通透性密切相关。mlck被激活后一方面使肌球蛋白轻链(myosin light chain，mlc)磷酸化，引发肌细胞收缩，增加上皮屏障通透性；另一方面mlck也参与调控claudin-2，occludin，zo-1等紧密连接结构。研究发现，在uc肠组织中长链mlck上调，启动下游长链mlck的转录，上调claudin-2表达破坏细胞间紧密连接结构和肠上皮屏障，加重uc的进程。因此，抑制mlck信号通路是发现新型uc治疗药物的关键靶点。

3、中药白头翁是毛茛科植物白头翁属植物白头翁(pulsatilla chinensis(bunge)regel)的干燥根。白头翁中的齐墩果烷型皂苷根据苷元可以分为齐墩果酸(oleanolicacid)和常春藤皂苷元(hederagenin)两种类型；根据c-3和c-28上是否具有寡糖基侧链分为3-寡糖基皂苷、28-寡糖基皂苷和3,28-双寡糖基皂苷三种类型。此外，寡糖基侧链上单糖单元的种类、连接位置、和糖链的长度的多样性进一步丰富了白头翁皂苷的结构多样性。苷元和糖基侧链的差异使得不同类型的白头翁皂苷具有不同的活性，如白头翁皂苷a显示了较好的抗癌活性(cn102133220a)，但未显示抗uc活性。

4、本发明所涉及的化合物1-9,11-16其治疗uc的活性为首次发现，其中化合物1，2和3为新化合物。

5、本发明首次发现3,28-双寡糖基齐墩果酸皂苷是白头翁治疗uc的主要药效组分，能够缓解uc小鼠结肠炎症状，下调mlck信号通路，修复肠上皮屏障。

技术实现思路

1、本发明是从白头翁[pulsatilla chinensis(bunge)regel]干燥根中提取分离得到的齐墩果烷型皂苷衍生物，经药理实验研究表明，这类化合物对uc具有显著的治疗作用。本发明的目的之一是提供具有抗uc活性的齐墩果烷型皂苷衍生物及其制备方法。本发明的另一个目的在于基于抗uc活性成分提供活性成分含量为50.0～99.9％(重量百分比)的白头翁提取物及其制备方法。本发明的再一个目的在于提供所述齐墩果烷型皂苷衍生物和/或白头翁提取物的用途，包括所述齐墩果烷型衍生物和/或白头翁提取物在制备预防和治疗uc药物中的应用。

2、目前关于白头翁抗uc的药效成分研究，仅白头翁皂苷b4(cn112107586a)和白头翁皂苷b5(cn108451964a)被公开报道。白头翁皂苷b4与本专利涉及的化合物母核骨架不同，白头翁皂苷b4为羽扇豆烷型三萜骨架，本专利涉及的化合物为齐墩果烷型三萜骨架。白头翁皂苷b5是以常春藤皂苷元为苷元的化合物，与本专利涉及的以齐墩果酸为苷元的化合物1,2,13-15的苷元结构和糖基取代基均不相同。另外，本专利涉及1种以常春藤皂苷元为苷元的新化合物3与白头翁皂苷b5的糖基取代基完全不同。白头翁皂苷苷元和糖基取代基的不同显著影响化合物的活性，如同样以常春藤皂苷元和齐墩果酸为苷元的白头翁皂苷化合物16-28在本研究中未显示抗uc活性。

3、本发明的技术方案如下：一种皂苷衍生物在制备用于治疗和预防溃疡性结肠炎药物中的用途，所述皂苷衍生物为齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，其结构通式为式i所示化合物；

4、

5、其中：r1为糖基或氢，r2为糖基或氢，r3为糖基或氢，r5为糖基或氢，r1，r2，r3和r5相同或不同；糖基为单糖基或2-4个单糖基形成的寡糖基；r4为羟基或氢。

6、上述的齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，主要是从白头翁[pulsatilla chinensis(bunge)regel]干燥根中分离得到的28个齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，其化学结构式可以具体如下：

7、

8、

9、所述齐墩果烷型三萜皂苷类化合物选自化合物1-9,11-15或选自：化合物1-3，5，13-15，其化学结构式如下：

10、所述化合物1,2,13,14,15包含于白头翁中药提取物，以白头翁中药提取物总重量为100％计，所述白头翁中药提取物含有化合物1,2,13,14,15中任意一种或2种以上，且重量占比白头翁中药提取物总重量的50％至99.9％。

11、一种白头翁中药提取物的制备方法，包括以下步骤：

12、1)取白头翁干燥根，用体积浓度为20-95％的乙醇水溶液提取，提取液浓缩后得到粗提物，将粗提物经过大孔树脂柱层析，洗脱液为体积浓度0、20％、50％、70％、100％的乙醇水溶液，分别进行洗脱；弃去纯水洗脱液，收集其余各部位洗脱液，浓缩得20％乙醇水溶液洗脱部分p20、50％乙醇水溶液洗脱部分p50、70％乙醇水溶液洗脱部分p70s和乙醇水溶液洗脱部分p100；

13、2)p70s组分载入mci小孔树脂色谱柱，用纯净水冲洗至洗脱液无色，用50％甲醇冲洗2个柱体积后，用70％甲醇冲洗5个柱体积，收集70％甲醇洗脱液，减压干燥后得到白头翁中药提取物p70。

14、3)基于步骤1)和步骤2)所得组分，进一步进行分离纯化

15、将上述组分p50经正相硅胶柱色谱梯度洗脱，得到组分p50-i、p50-ii和p50-iii。组分p50-i经葡聚糖凝胶柱色谱，反相色谱柱和半制备液相色谱纯化得到化合物11和12。p50-ii组分经葡聚糖凝胶柱色谱和反相色谱柱分离得到组分p50-iia和p50-iib。组分p50-iia通过半制备液相色谱纯化得到化合物9和10。组分p50-iib经半制备液相色谱纯化得到化合物6，7和8。组分p50-iii经葡聚糖凝胶柱色谱、反相柱色谱和半制备液相色纯化得到化合物3，4和5。组分p70s经正相硅胶柱色谱梯度洗脱得到p70s-i和p70s-ii两个组分，组分p70s-i经半制备液相色谱纯化得到化合物1和15；组分p70s-ii经半制备液相色谱纯化得到化合物2，14和13。组分p100经正相硅胶柱色谱梯度洗脱得到馏分p100-i～v；组分p100-i经正相和反相柱色谱分离得到化合物28，26和27；p100-ii通过正相硅胶柱色谱和半制备液相色谱纯化得到化合物23和一组混合物24/25；组分p100-iii经过反相柱色谱纯化得到化合物21和22。组分p100-iv通过葡聚糖凝胶柱色谱和半制备液相色谱分离纯化得到化合物20，19，18和化合物17。组分p100-v经过反相柱层析后，经半制备液相色谱反复纯化得到化合物16。

16、上述的大孔树脂可以为本领域常规的大孔树脂，譬如d101，xad16，xad1600等树脂。

17、上述制备方法中，在分离纯化步骤中，所用正相硅胶型号为100-200目和(或)300-400目，并用二氯甲烷-甲醇-水-甲酸系统梯度洗脱(体积比4：1：0.1:0.1～1：1：0.2:0.1)。

18、上述制备方法中，在分离纯化步骤中，反相色谱所用填料为ods-18，半制备高效液相色谱柱填料为ods-18，洗脱液为甲醇-水体系(体积比3:7～7:3)。

19、本发明的有益效果：本发明对所得的三萜皂苷及由活性皂苷组成的不同药效组分进行了体内抗溃疡性结肠炎活性研究，经药理实验研究表明，所述3，28-双寡糖基常春藤皂苷化合物3～12显示了较弱的抗uc活性；3，28-双寡糖基齐墩果酸三萜皂苷化合物1，2，13～15及由其组成的药效组分p70(抗uc活性白头翁提取物)对dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠具有显著的治疗效果，其活性明显优于3，28-双寡糖基常春藤皂苷类化合物。因此可用治疗溃疡性结肠炎，用于制备治疗和预防溃疡性结肠炎的药物。