一种探究蜂毒肽对急性肺损伤的作用机制的试验方法

本发明涉及急性肺损伤的药物治疗，特别涉及一种探究蜂毒肽对急性肺损伤的作用机制的试验方法。

背景技术：

1、急性肺损伤(acute lung injury，ali)是一个以炎症和肺毛细血管通透性增加为特征的临床综合征，严重时可引发急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distresssyndrome,ards)，其病理特点为弥漫性肺泡毛细血管膜损伤。目前，ali的发病率及死亡率高达30％至40％。ali所涉及的病因相当多，由多种内部和外部致病因素引起，例如严重感染、败血症、创伤、休克、急性胰腺炎、放化疗的医源性肺损害、有害物质吸入等，从临床角度可分为休克、创伤、严重感染与脓毒血症、误吸有害液体、吸入损伤性气体、药物、代谢性疾病等10类。无论哪种病因所导致的ali，其发病实质均与失控的炎症反应有关。

2、toll样受体(toll-likereceptors，tlr)是一大类高度保守的蛋白质，是先天免疫系统必不可少的病原体特异性识别传感器，可识别病原体相关和损害相关的分子模式，并引发一系列信号转导，进而导致炎性介质的释放，在天然免疫防御中起着重要作用，并最终激活获得性免疫系统。tlr家族至少己包括了12个成员，不同的tlr的配体也有所不同，其中tlr4是介导脂多糖应答的最主要受体。tlr4多分布在巨噬细胞、肺脏、淋巴细胞及脾脏、肝脏等组织中，可识别细菌的脂多糖(lps)，是细胞识别lps的重要分子，细胞是否能对lps的刺激发生反应与该细胞tlr4表达与否及表达的高低有密切的关系。革兰氏阴性菌脓毒症是导致ali的主要病因，脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜上的主要成分，可以启动炎症反应，诱导实验性急性肺损伤模型，因此，lps可通过激活肺组织的tlr4信号传导途径诱导炎症反应，诱导急性肺损伤。lps刺激后首先与lps结合蛋白(lbp)结合，然后再结合于细胞表面的cd14分子。cd14通过gpi锚定于细胞膜。lps以lps-lbp-cd14三体复合物形式活化tlr4信号转导。tlr4可以激活核因子-κb(nf-κb)并诱导炎症细胞因子的表达来调节炎症反应。lps激活tlr4/nf-κb信号通路主要有两条途径：一条是髓样分化因子88(myd88)依赖的信号通路；另一条myd88非依赖的信号通路。lps与tlr4结合，tlr4聚合使得信号转导到胞内，tlr4的胞内tir区域与myd88的羧基端结合，通过一系列信号转导，导致nf-κb抑制物磷酸化并降解，nf-κb与其抑制蛋白iκb解离，并转入细胞核，启动靶基因的表达，激活细胞因子il-1β、il-6、il-8、il-12、tnf-α等。相关研究表明，抑制nf-κb的表达能够明显抑制肺部炎症因子表达，显著减轻肺部的炎症反应，提高lps诱导的ali小鼠的生存率。

3、nod样受体蛋白3(nlrp3)炎症小体是一种在人体细胞浆内广泛存在的多蛋白复合物，包括nlrp3、凋亡相关斑点样蛋白(asc)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白(caspase-1)可调控多种促炎细胞因子如il-1β、il-18等的成熟及分泌。nlrp3炎症小体是tlr4介导的炎性途径中至关重要的下游效应因子，并且是诱导促炎性细胞因子分泌的关键因素。当tlr4信号途径被激活时，nf-κb可以激活nlrp3炎性小体，并导致大量il-1β的产生。il-1β属致炎细胞因子，可促进中性粒细胞浸润，加剧炎症反应。nf-κb和nlrp3介导的il-1β信号通路是人体的一种重要的炎症形成机机制。nf-κb可转录翻译il-1β前体(pro-il-1β)，而pro-il-1β转变为成熟的il-1β则需要nlrp3炎症小体的参与。

4、蜂毒因其特殊的消炎、抗菌、抗氧化等特殊的生物活性，近年来日益引起人们的关注，目前对蜂毒的研究主要集中于蜂毒肽的研究。蜂毒肽(melittin,mel)又称蜂毒溶血肽，是一种小分子多肽类生物毒素，约占蜂毒干重的50％左右，是蜜蜂毒中主要的功能物质。它是由26个氨基酸组成的线性多肽，具有较强的表面活性，能通过卵磷脂膜和混合膜。蜂毒肽具有许多生物学活性，包括抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗风湿等活性。有研究表明蜂毒肽可抑制用高脂或lps诱导的小鼠动脉粥样硬化的形成。蜂毒肽治疗可降低总胆固醇和甘油三酯水平，并恢复心脏和降主动脉的功能。此外，蜂毒肽处理还可降低动脉粥样硬化小鼠中tnf-α，il-1β，vcam-1，icam-1和tgfβ-1的表达水平。谭宁等研究了蜂毒肽对胶原诱导关节炎(collageninduceathritis,cia)模型关节炎症及对th17/treg细胞的影响，结果表明蜂毒肽可抑制胶原诱导关节模型炎症因子的表达，抑制关节滑膜增生及延缓骨质破坏，同时能上调treg细胞、降低th17细胞起到抑制免疫作用，提示蜂毒肽可能通过调节th17/treg细胞平衡从而达到治疗类风湿性关节炎的作用。park等在从类风湿患者身上获得的滑膜细胞和小鼠巨噬细胞研究中，发现蜂毒肽抑制了tnf-α/lps诱导的no和pge2的产生。park等研究报道蜂毒肽治疗可减轻肝损伤，炎症以及肝纤维化。研究结果显示蜂毒肽可抑制tnf-α处理的肝星状细胞(hepaticstellatecells,hscs)中的tnf-α分泌以及il-1β和il-6的表达。蜂毒肽可通过抑制nf-κb信号通路减轻硫代乙酰胺诱导的肝纤维化模型中的炎症和纤维化。他们还证明了在d-半乳糖胺/lps诱导的小鼠肝衰竭模型中，蜂毒肽可通过阻断nf-κb信号传导和凋亡途径来抑制肝衰竭。

5、综合以上的研究背景，我们推测蜂毒肽可能对lps诱导的大鼠急性肺损伤具有改善的作用，其机制可能与tlr4-myd88-nf-κb-nlrp3炎症通路有关，但目前国内外尚没有相关报道，也没有相关的试验可以验证此种猜想，而探明蜂毒肽是否通过抑制tlr4-myd88-nf-κb-nlrp3通路从而改善lps诱导的大鼠急性肺损伤，对于寻找关键的靶基因，筛选出合适的ali治疗药物具有重要的指导意义，为此，我们提出一种探究蜂毒肽对急性肺损伤的作用机制的试验方法。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种探究蜂毒肽对急性肺损伤的作用机制的试验方法，通过建立急性肺损伤大鼠模型，检测蜂毒肽处理后，相关炎症因子的表达水平，肺组织中tlr4、myd88、nf-κb、p-nf-κb、nlrp3表达的情况，为探明蜂毒肽是否通过抑制tlr4-myd88-nf-κb-nlrp3通路从而改善lps诱导的大鼠急性肺损伤设计了科学性的试验方法，对寻找关键的靶基因，筛选出合适的ali治疗药物提供重要的实验基础，可以有效解决背景技术中的问题。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、一种探究蜂毒肽对急性肺损伤的作用机制的试验方法，所述的试验方法采用气管内注射lps建立急性肺损伤大鼠模型，并选取60只雄性wistar大鼠随机分为：对照组、模型组、蜂毒肽组和地塞米松组，用药组在造模前15min给于腹腔注射蜂毒肽及地塞米松2次/d；统计每组大鼠存活率，存活大鼠于第2日吸入5％的异氟烷进行麻醉，腹主动脉取血获取血液样本后获取肺组织样本，将每组中数量一半的样本进行肺干湿比检测，计算肺组织湿/干比w/d，剩下的一半样本采用he染色观察肺组织样本的形态学变化、采用elisa法检测血液样本血清中tnf-α，il-6和il-1β的表达水平、采用免疫组化法检测肺组织样本中tlr4、myd88、p-nf-κb、nlrp3蛋白表达、采用western-blot检测肺组织样本中tlr4、myd88、nf-κb、p-nf-κb、nlrp3蛋白的表达，并对采集的数据以平均值±标准差表示，采用spss 16.0软件进行统计分析，多组均数间比较采用anova及newman-keuls-student多重比较t检验分析，当p<0.05时，认为差异有统计学意义。

4、进一步的，所述的试验方法包括以下步骤：

5、步骤一，构建ali大鼠模型

6、以5mg/kg标准量的脂多糖为诱导剂，向麻醉后的大鼠气管内注射入lps混悬液100μl，迅速将大鼠直立，左右晃动，待麻醉剂作用消退、大鼠清醒可以自主呼吸时，将大鼠放回鼠笼；

7、步骤二，设计动物实验方案

8、选取60只雄性wistar大鼠，按照随机数字表法将大鼠随机分为：对照组、模型组、蜂毒肽组和地塞米松组，每8小时记录动物的存活数量，计算每组动物的存活率，将模型组、蜂毒肽组和地塞米松组的大鼠按照步骤一进行造模，蜂毒肽组和地塞米松组的大鼠在造模前15min给于腹腔注射给药；

9、步骤三，采集与处理检验样本

10、s31，用非抗凝采血管采集大鼠腹主动脉血液，采血后将采血管放置于4℃冰盒中静置2h，然后用4℃低温离心机以3000rpm的转速离心20min，吸取上清液血清并分装，于-80℃保存；

11、s32，取血后，立即打开大鼠胸腔，经右心室用pbs灌流液将肺组织冲洗干净后，迅速取出，再用预冷的pbs将其漂洗干净，称取100mg左肺组织置于-80℃冰箱保存，右肺置于4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋处理，剩余肺组织置于-80℃冰箱保存；

12、s33，摘取肺组织后，用生理盐水冲洗肺组织表面血迹，用滤纸吸干表面水份并称重，然后把肺组织置于80℃烤箱烘烤48h，待肺组织干燥至恒重，再次称烘干肺组织的重量，并计算肺组织湿/干比w/d；

13、步骤四，肺组织样本he染色

14、取步骤s32中石蜡切片经常规脱蜡后，放入双蒸水中浸润10min后进行he染色；

15、步骤五，elisa法检测血清中tnf-α，il-6和il-1β的表达水平；

16、步骤六，免疫组化检测肺组织样本中tlr4、myd88、p-nf-κb、nlrp3蛋白的表达；

17、步骤七，western blot检测肺组织样本中tlr4、myd88、nf-κb、p-nf-κb、nlrp3蛋白的表达；

18、步骤八，数据处理

19、将上述步骤中获取的数据以平均值±标准差表示，统计分析采用spss16.0软件，多组均数间比较采用anova及newman-keuls-student多重比较t检验分析，p<0.05认为差异有统计学意义。

20、进一步的，所述步骤四中he染色步骤为：

21、a，mayer’s苏木素溶液染色7min；

22、b，自来水洗涤；

23、c，1％盐酸乙醇溶液分化2s；

24、自来水洗涤；

25、d，温水反蓝10min；

26、e，伊红酒精溶液染色l～2min；

27、f，自来水洗涤；

28、g，85％-95％酒精溶液脱水各2min；

29、h，100％无水乙醇溶液脱水3min×2次；

30、i，二甲苯溶液中透明3min×2次；

31、j，中性树胶封片，干燥，拍照分析。

32、进一步的，所述的腹腔注射蜂毒肽及地塞米松的用量分别为0.35mg/kg和5mg/kg。

33、进一步的，所述的用药组包括蜂毒肽组和地塞米松组。

34、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

35、(1)本发明通过建立急性肺损伤大鼠模型，检测蜂毒肽处理后，相关炎症因子的表达水平，检测肺组织样本中tlr4、myd88、nf-κb、p-nf-κb、nlrp3等蛋白表达的情况，为探明蜂毒肽是否通过抑制tlr4-myd88-nf-κb-nlrp3通路从而改善lps诱导的大鼠急性肺损伤设计了科学性的试验方法，对寻找关键的靶基因，筛选出合适的ali治疗药物提供重要的实验基础。