一种融合前构象糖蛋白汉坦病毒疫苗及其制备方法和应用

本发明属于疫苗制备，具体涉及一种融合前构象糖蛋白汉坦病毒疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、汉坦病毒是一组由啮齿类动物传播的病毒，根据其地理分布和自然宿主，分为旧世界汉坦病毒(old world hantaviruses，owhs)和新世界汉坦病毒(new worldhantaviruses，nwhs)，新世界汉坦病毒会导致危及生命的汉坦病毒心肺综合征(hantavirus cardiopulmonary syndrome，hcps)，snv(sin nombre orthohantavirus)和andv(andes virus)是美洲hcps的主要病原体，而旧世界汉坦病毒会导致肾综合征出血热(haemorrhagic fever with renal syndrome，hfrs)，与hfrs相关的汉坦病毒主要分布在欧亚地区，病死率在0.1％和15％之间，主要是汉滩病毒(hantaan virus，htnv)、汉城病毒(seoul virus，seov)、多布拉瓦-贝尔格莱德汉坦病毒(dobrava-belgrade virus，dobv)和普马拉汉坦病毒(puumala hantavirus，puuv)的感染。

2、汉坦病毒属于布尼亚病毒目(bunyavirales)汉坦病毒科(hantaviridae)的正汉坦病毒属(orthohantavirus)。它是一种有包膜分节段的单股负链rna病毒，基因组包括l、m、s三个片段，分别编码病毒的rna聚合酶、包膜糖蛋白和核衣壳蛋白。目前主要是利用htnv包膜糖蛋白(glycoprotein complex，gpc)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，np)作为抗原组分。研究表明，其中汉坦病毒包膜糖蛋白gpc是介导病毒黏附细胞受体的关键蛋白，htnv的多数中和抗原位点主要集中在gpc上，但是gpc的免疫原性相对较弱，刺激机体产生的中和抗体出现较晚，且滴度不高，而中和抗体在抗htnv感染中至关重要。gpc成熟后可以裂解为gn和gc两个亚基。其中gn介导与宿主受体的结合，gc是一种ⅱ型膜融合蛋白，可在酸性ph条件下发生构象变化，进而暴露出融合环，介导病毒包膜与细胞的内吞体膜融合，从而将病毒的基因组释放至细胞质。因而gpc是中和抗体的主要靶标，是关键的保护性抗原。

3、20世纪90年代起，包含汉滩型和汉城型汉坦病毒的双价灭活疫苗在我国开始被应用于临床。接种对象为流行区16～60岁人群。接种程序分为基础免疫和加强免疫，基础免疫2剂次(第0、14天)，在1年后加强1剂。汉坦病毒的防治与彻底根除有赖于疫苗的研制。但现阶段灭活疫苗的效果不是太理想，如细胞免疫应答弱，免疫接种程序长等，而其中最突出的不足就是诱导的中和抗体效价偏低、维持时间短，接种人群的中和抗体水平在免疫一年后几乎测不到，也使灭活疫苗长期的免疫保护效果令人担忧，因此急需开发新型肾综合出血热(hfrs)疫苗能够诱导针对汉坦病毒较高水平的中和抗体。

4、包括htnv在内的有包膜病毒通过包膜糖蛋白结合到宿主细胞受体后,启动了病毒融合蛋白的一系列构象变化，而宿主体内产生的中和抗体一般结合病毒糖蛋白融合前构象的空间表位，并通过阻断糖蛋白结合受体这一过程达到阻断病毒感染的作用。因此，如果疫苗中包含的病毒抗原都是包膜糖蛋白融合前的构象，那么其诱导的抗体将绝大部分都是中和抗体，这是诱导中和抗体的理论基础。但融合前构象的病毒糖蛋白因需要通过构象变化(变构)介导膜融合，所以是一种处于亚稳态的蛋白，其结构通常并不稳定，中和抗体效价偏低。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种融合前构象糖蛋白汉坦病毒疫苗及其制备方法和应用，根据已经解析的汉坦病毒包膜糖蛋白近全长晶体结构着手，从引入gn、gc亚基间的二硫键，以及稳定gc的融合前构象的分子内二硫键进行设计，获得融合前构象的htnv包膜糖蛋白抗原，利用dna疫苗或mrna疫苗表达载体，制备得到的htnv核酸疫苗为肾综合征出血热的防治提供新型候选疫苗，在此基础上可将此策略应用于包括但不限于seov、puuv、dobv、snv、andv等其他汉坦病毒，从而制备获得可诱导高中和抗体效价的核酸疫苗。

2、本发明提供了一种融合前构象糖蛋白汉坦病毒疫苗及其制备方法，基于现有汉坦病毒包膜糖蛋白的结构生物学信息，通过氨基酸突变改造汉坦病毒gpc抗原，在gn-gc异源二聚体相互接近的氨基酸之间、gc四聚体相互接近的氨基酸之间引入稳定gn-gc和gc四聚体结构的二硫键，获得表达稳定的融合前构象抗原疫苗；

3、所述汉坦病毒包括htnv、seov、puuv、dobv、snv和andv。

4、进一步地，所述汉坦病毒疫苗还包括htnv gp抗原疫苗、seov gp抗原疫苗、puuvgp抗原疫苗、dobv gp抗原疫苗、snv gp抗原疫苗和andv gp抗原疫苗。

5、进一步地，所述htnv gp抗原疫苗的制备中的氨基酸突变改造过程为：将731位苏氨酸点突变为半胱氨酸，835位甘氨酸点突变为半胱氨酸，291位点丝氨酸处点突变为半胱氨酸；

6、所述seov gp抗原疫苗的制备中的氨基酸突变改造过程为：将729位苏氨酸点突变为半胱氨酸，将833位甘氨酸点突变为半胱氨酸，将289位苏氨酸点突变为半胱氨酸；

7、所述puuv gp抗原疫苗的制备中的氨基酸突变改造过程为：将741位苏氨酸点突变为半胱氨酸，将845位甘氨酸点突变为半胱氨酸，将301位丙氨酸点突变为为半胱氨酸；

8、所述dobv gp抗原疫苗的制备中的氨基酸突变改造过程为：将731位苏氨酸点突变为半胱氨酸，将835位甘氨酸点突变为半胱氨酸，将291位苏氨酸点突变为半胱氨酸；

9、snv gp抗原疫苗的制备中的氨基酸突变改造过程为：将735位苏氨酸点突变为半胱氨酸，将839位甘氨酸点突变为半胱氨酸，将295位亮氨酸点突变为为半胱氨酸；

10、andv gp抗原疫苗的制备中的氨基酸突变改造过程为：将734位苏氨酸点突变为半胱氨酸，将838位甘氨酸点突变为半胱氨酸，将294位组氨酸点突变为半胱氨酸。

11、进一步地，所述htnv gp抗原疫苗的制备包括如下步骤：

12、s1，通过构建pcaggs-opti gpc(t731c)-myc(pcaggs-opti gpc-t731c-myc)单突变质粒将731位苏氨酸点突变为半胱氨酸；

13、s2，通过构建pcaggs-opti gpc(g835c/s291c)-myc(pcaggs-opti gpc-g835c/s291c-myc)双突变质粒将835位甘氨酸点突变为半胱氨酸，将291位点丝氨酸处点突变为半胱氨酸；

14、s3，构建pcaggs-opti gpc(g835c/s291c/t731c)(pcaggs-opti gpc-g835c/s291c/t731c)三突变质粒，获得htnv gp抗原疫苗。

15、进一步地，s1中，以puc-opti gpc质粒为模板，设计突变引物opti gpc-f-infusion、gpc-r-infusion、opti gpc-t731c seg 1-r和opti gpc-t731c seg2-f，分别以opti gpc-f-infusion、opti gpc-t731c seg 1-r；opti gpc-t731c seg2-f、gpc-r-infusion为引物pcr扩增t731c seg 1和t731c seg 2，然后与经ecor i和kpn i双酶切后的pcaggs-myc载体连接，获得单突变质粒pcaggs-opti gpc(t731c)-myc。

16、进一步地，s2中，先构建pcaggs-opti gpc(g835c)-myc质粒：以puc-opti gpc质粒为模板，设计突变引物opti gpc-f-infusion、gpc-r-infusion、opti gpc-g835c seg 1-r和opti gpc-g835c seg 2-f，将835位甘氨酸点突变为半胱氨酸，获得pcaggs-opti gpc(g835c)-myc质粒；

17、然后以pcaggs-opti gpc(g835c)-myc质粒为模板，设计opti gpc-s291cseg 1-r引物和opti gpc-s291c seg 2-f引物，将291位点丝氨酸处点突变为半胱氨酸，获得pcaggs-opti gpc(g835c/s291c)质粒；

18、分别以opti gpc-f-infusion、opti gpc-s291c seg 1-r；opti gpc-s291c seg2-f、gpc-r-infusion为引物pcr扩增g835c/s291c seg 1和g835c/s291c seg 2，然后与经ecor i和kpn i双酶切后的pcaggs-myc载体连接，构建获得双突变质粒pcaggs-opti gpc(g835c/s291c)-myc。

19、进一步地，s3中，所述pcaggs-opti gpc(g835c/s291c/t731c)三突变质粒的构建过程为：以pcaggs-opti gpc(g835c/s291c)质粒为模板，分别以opti gpc-f-infusion、opti gpc-t731c seg 1-r；opti gpc-t731c seg 2-f、gpc-r-infusion为引物pcr扩增g835c/s291c/t731c seg 1和g835c/s291c/t731c seg 2，然后与经ecor i和kpn i双酶切后的pcaggs-myc载体连接，获得三突变质粒pcaggs-opti gpc(g835c/s291c/t731c)-myc，即htnv gp抗原。

20、本发明还提供了上述制备方法制备得到的汉坦病毒疫苗，所述汉坦病毒疫苗包括但不限于htnv gp抗原疫苗、seov gp抗原疫苗、puuv gp抗原疫苗、dobv gp抗原疫苗、snvgp抗原疫苗和andv gp抗原疫苗。

21、进一步地，所述疫苗形式包括但不限于dna、mrna、环状rna、载体递送的核酸分子及其他类型核酸分子。

22、本发明还提供了上述汉坦病毒疫苗在制备预防和治疗肾综合征出血热或汉坦病毒肺综合征的药物或载体中的应用。

23、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

24、1、本发明中htnv核酸疫苗具有以下优势：

25、(1)核酸疫苗可以模拟的病毒自然感染，同时具备外源性抗原提呈途径和内源性抗原提呈途径的双重免疫机制，同时被抗原提呈细胞的mhc-ii类分子和mhc-i类分子提呈，分别激活cd4+型t细胞和cd8+型t细胞，因此能有效激活体液免疫和细胞免疫应答；

26、(2)制备核酸疫苗仅需要知道病原体的抗原序列即可进行设计，研发周期短并且蛋白质抗原在宿主细胞内表达，无因毒力返祖或残留毒力病毒颗粒而引发疫病的危险，安全性高；

27、(3)核酸疫苗表达的抗原蛋白在构象上与其天然抗原的构象更接近，可以保持抗原的天然构象，从而使其免疫原性更强；

28、(4)虽然mrna疫苗的优点十分突出，但因mrna自身的一些特点，在早期限制了其推广应用。作为rna的一种，mrna稳定性要远低于dna，容易降解。当前很多技术从碱基修饰以及递送系统等层面进行了系统性优化，然后再通过脂质纳米颗粒(lnp)递送，整个生产效率低下，价格昂贵。即便如此，修饰后的线性mrna的半衰期仍然较短，这大大限制了其产量。而环形rna(circ rna)因其首尾相接的环形结构，能够抵御细胞内核酸酶的降解，因此更为稳定，免疫原性也更低，成为线性mrna的良好替代品，所以目前mrna疫苗还在不断的发展中。

29、2、本发明中htnv核酸疫苗具有以下优势：

30、dna疫苗也可以像mrna一样通过模拟病毒感染诱导高水平的抗体，但dna疫苗更稳定，且更容易制备，并且目前发现dna疫苗诱导的抗体滴度都偏低，原因可能在于dna疫苗产生的抗原表达水平低且由mhc-ii类分子提呈效率偏低，从而诱导的免疫应答水平不高，这一问题可以通过在接种时加入免疫佐剂改善。

31、3、本发明提供的融合前构象糖蛋白汉坦病毒疫苗的制备方法中对于htnv m序列改造中：

32、(1)胞膜糖蛋白(gpc)的密码子优化，获得在真核细胞中高水平表达gpc的m基因序列；

33、(2)基于现有htnv gp的结构生物学信息，通过氨基酸突变改造htnv gp抗原，在gn-gc异源二聚体相互接近的氨基酸之间、gc四聚体相互接近的氨基酸之间引入可以稳定gn-gc和gc四聚体结构的二硫键，获得可以表达稳定的融合前构象htnv gp抗原，从而诱导高水平的中和抗体，为新型hfrs疫苗的研制提供新的策略。

34、4、本发明制备得到的htnv gp抗原疫苗疫苗，为利用融合前htnv gp抗原作为新型hfrs疫苗的设计思路奠定了关键基础，同时可将此策略应用于seov、puuv、dobv、snv和andv等其他汉坦病毒，从而制备获得可诱导高中和抗体效价的核酸疫苗。