I群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂的制备方法及应用

本发明属于兽医生物制品，具体涉及一种i群4型禽腺病毒(fadv-4)即时长效复合免疫制剂的制备方法及其应用。

背景技术：

1、20世纪80年代末，巴基斯坦、印度、南美洲等多个国家报告了肉鸡中的一种新发疫病，其临床特征与经典包涵体肝炎(ibh)相似，该病主要表现为心包积液和肝炎，因此被称为肝炎-心包积液综合征(hhs)。1987年，在巴基斯坦卡拉奇附近的安卡拉地区，首次在3～5周龄肉鸡中报告了这种疾病，随后该疾病蔓延到伊拉克、墨西哥、秘鲁、智利、南美洲和中美洲、斯洛伐克和韩国等国家。1981年，韩国报道了首例hhs病例。1994年，印度首次在查谟和克什米尔、旁遮普和新德里的家禽中发现该疾病。2006～2014年，中国hhs病例呈散发或聚集分布，自2015年7月起，河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、新疆、安徽、山东、江西、湖北、江苏等省区相继爆发疫情，且呈快速传播趋势。我国是养禽大国而且拥有最大的禽肉禽蛋消费市场，禽腺病毒感染严重威胁家禽养殖的健康发展。

2、禽腺病毒属于腺病毒科禽腺病毒属，分为i、ii、iii三个群，不同群之间的抗原性存在显著差异。i群禽腺病毒在养禽场中广泛分布，拥有共同的群特异性抗原，可以从鸡、鸭、鹅、火鸡等多种禽类中分离到，根据分子标准和限制性内切酶图谱分析，可将i群禽腺病毒分为a、b、c、d、e五个种，包括fadv-1、2、3、4、5、6、7、8a、8b、9、10、11共12个血清型。ii群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒、雉鸡大理石脾病病毒、鸡大脾病病毒。iii群禽腺病毒仅包含产蛋下降综合征病毒。近年来危害全球养禽业的hhs，其病原已被证实是i群c种血清4型禽腺病毒(fadv-4)。

3、fadv-4呈二十面体结构，无囊膜，大小为70～90nm，基因组包含大小约为45kb的线性dsdna。病毒衣壳由3种主要结构蛋白组成，即hexon、fiber和penton。hexon形成衣壳的主要结构成分，含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，是中和抗体的主要靶蛋白和主要的保护性抗原，与致病性密切相关。

4、fadv-4主要感染3-7周龄鸡，其他年龄的鸡，包括产蛋鸡也可感染。未免疫的易感鸡强毒力毒株感染时，不表现任何临床症状而突然出现死亡高峰，死亡率30～70％不等。病毒在宿主细胞核内复制，产生嗜碱性包涵体。主要的病理变化是心包增厚、透明度不同程度降低；包涵体肝炎和心包腔积有草黄色透明或呈胶冻样液体；肝脏肿大、颜色变黄或有斑驳状土黄色不规则条纹，质脆；肾脏充血，肾叶肿大，分界清晰，输尿管有尿酸盐沉积；脾脏肿大、充血；严重者心脏及心冠脂肪有出血点；腺胃乳头或腺胃和肌胃交界处有时有出血。

5、水平传播和垂直传播均可导致fadv-4感染。fadv-4主要通过眼、上呼吸道及消化道等途径感染易感鸡。由于粪便中病毒滴度很高，fadv-4很容易通过粪-口途径水平传播。fadv-4病毒可通过胚胎卵传播给后代，且在子代中一段时间内保持潜伏状态而不被发现，在有免疫抑制因素时被重新激活。根据fadv-4毒株的致病性，感染病例会造成体重显著下降，影响鸡的生产性能，从而导致严重的经济损失。

6、fadv-4对鸡体淋巴组织的嗜性偏好可引起免疫抑制，病毒通过在淋巴组织中复制，损害鸡体的免疫能力而产生致病潜力。fadv-4感染可导致淋巴器官中b细胞和t细胞的耗竭，从而造成体液免疫和细胞免疫反应的抑制。

7、目前，针对hhs尚无高效治疗药物，该病的防治主要以预防为主。hhs疫苗已经在巴基斯坦、缅甸、埃及、日本、秘鲁、尼泊尔、韩国、越南、墨西哥等国家和地区商业化应用。中国在2021年批准了2个i群4型禽腺病毒疫苗，虽然疫苗的推广应用一定程度上降低了国内hhs的危害，但在临床实践中，鸡群免疫了fadv-4疫苗却依然暴发hhs的情况不断发生。分析原因可知，国际国内使用的fadv-4疫苗产品均为传统灭活苗，疫苗注射后需要14～21d才能发挥较好的保护作用，在这段免疫空白期内，易感鸡群仍有感染fadv-4的风险，同时疫苗免疫持续期后，如果不及时加强免疫，仍然遭受fadv-4的威胁。因此，在当前fadv-4普遍流行的情况下，开发免疫空白期短、免疫抗体产生快、免疫保护力产生早、免疫持续期长的疫苗产品，才能更好地解决fadv-4的防控。

8、卵黄抗体是存在于鸟类、爬行动物和两栖动物卵黄中的治疗性抗体，是通过成熟卵母细胞的选择性转运机制，从血液转移到卵黄中聚积形成类似于哺乳动物免疫球蛋白g(igg)的功能等效物。特异性igg通过使用目标抗原对蛋鸡进行免疫获得。目标抗原可以是简单的分子或复杂的结构例如病毒、细菌和其他寄生虫等。igg能够中和包括病毒在内的抗原分子，通过被动免疫从而使动物获得坚实的保护力，在机体防御中发挥重要作用。

9、igg因性能稳定、安全性高、成本低且产量大、可连续生产等优点，近年来被应用于多种人类和动物疫病的预防和治疗，取得了较为理想的效果。igg注射后能够快速发挥被动免疫作用、抵抗病毒微生物入侵，对病原感染起到快速阻断作用，但也存在一些不足之处，如抗体半衰期短、免疫保护时间短等问题。

10、根据hhs的流行特征和fadv-4的致病特点，如何开发安全高效的防控产品呢？活疫苗的研发周期较长，且fadv-4活疫苗毒力返强的风险带来的生物安全危害是不可接受的，同时活疫苗的使用也不利于该病的根除净化；现有fadv-4灭活疫苗的临床应用，一定程度上减少了该病的流行，但由于疫苗接种后14～21d的免疫空白期内，易感鸡仍有感染发病致免疫失败的风险，部分地区仍不时有hhs的暴发，造成重大的经济损失且存在大范围流行的隐患；抗体作为治疗性产品，接种后产生保护力早，可以迅速起到保护作用，但疗效持续时间短，无法作为持续免疫用制品。同时，当前行业内制备抗体所用高免种蛋均来自普通种蛋，不同程度携带有外源病原微生物，造成抗体制品应用过程中存在一定程度的疫病传播风险。基于上述分析，发明人探索结合灭活疫苗和抗体两类制品的优势，研发一种新型ⅰ群4型禽腺病毒免疫制剂，弥补现有产品和技术的不足，实现免疫后即时保护、免疫效果长期持续，对防治ⅰ群4型禽腺病毒感染具有重要的现实意义和经济价值。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一种i群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂的制备方法及应用，复合免疫制剂能够立即起到免疫作用，同时免疫效果持久，可持续至免疫后98w，并且父母代母鸡2周龄时免疫，至100周龄时对其2w子代仍提供100％保护、对其3w子代提供80％以上的保护。本发明提供的i群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂可有效降低鸡群中fadv-4垂直传播隐患和雏鸡早期感染风险。

2、本发明的目的是以下述方式实现的：一种i群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂的制备方法，将含有灭活i群4型禽腺病毒wz株病毒液的fadv-4灭活油乳剂作为油相，抗fadv-4igg纯化抗体作为水相，将油相缓慢加入到水相，并制成稳定的乳液，即为复合免疫制剂。

3、将油相缓慢加入到水相，通过剪切乳化制成稳定乳液。

4、通过1000-1200r/min剪切4-6min，制成的稳定乳液。

5、如上述作为油相的fadv-4灭活油乳剂的制备方法，包括以下步骤：使用ⅰ群4型禽腺病毒wz株接种spf鸡，无菌采集感染死亡鸡的肝脏组织，研磨、冻融、离心、除菌过滤、灭活，将灭活后病毒液与seppic isa 71vg佐剂按质量比3︰7的配比剪切乳化，制成fadv-4灭活油乳剂；灭活前fadv-4组织病毒液ld50为10-7.3/0.2ml。

6、如上述作为水相的抗fadv-4igg抗体的制备方法，包括以下步骤：使用fadv-4灭活油乳剂对spf蛋鸡进行二次加强免疫，收集种蛋，分离卵黄、提取、纯化后得到的igg抗体。

7、纯化后抗体抗fadv-4琼扩效价为1︰128，半数保护量(pd50)为10-5/0.05ml。

8、fadv-4灭活油乳剂与抗fadv-4igg纯化抗体的体积比为9:1时，1100r/min剪切，将油相fadv-4灭活油乳剂缓慢加入水相抗fadv-4igg纯化抗体中，5min内流加，制备出的乳液即为fadv-4复合免疫制剂。

9、如上述的ⅰ群4型禽腺病毒复合免疫制剂的应用。

10、如上述的ⅰ群4型禽腺病毒复合免疫制剂作为预防用疫苗的应用。作为预防用疫苗，对免疫鸡发挥即刻起效、长期免疫的作用。复合免疫制剂接种spf鸡0min、12h、1d、3d、5d时使用剂量为5×106.5ld50 fadv-4进行攻毒，保护率均为100％；免疫后1w、3w、5w、12w、20～90w及98w时，攻毒保护率也均为100％。

11、如上述的ⅰ群4型禽腺病毒复合免疫制剂作为父母代鸡群免疫用疫苗的应用。复合免疫制剂的免疫效力可稳定传递给子代。对免疫后父母代蛋鸡所产子代，使用5×106.5ld50剂量的fadv-4病毒攻击，至父母代免疫后98周时，对其2w子代可提供100％的保护作用，对其3w龄子代可提供80％的保护，对3w龄以上子代的保护率为20％～100％不等。

12、上述的i群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂在制备治疗性制品中的应用，尤其是治疗fadv-4感染制品的应用，治疗性制品为与其他物质混合制备的药品或者单独经过其他工艺进一步制备的药品等。如上述的ⅰ群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂在治疗fadv-4感染中的应用，试验鸡在感染fadv-4后0h、24h、36h时接种该复合免疫制剂，治愈率均达100％。

13、相对于现有技术，本发明的有益效果是：

14、本发明提供的一种ⅰ群4型禽腺病毒复合免疫制剂，性状稳定、不破乳不分层，安全性好、对免疫鸡群生产性能无影响；该免疫制剂接种试验鸡，免疫后0min即可完全抵挡fadv-4病毒的攻击，至免疫后98w时攻毒保护率仍为100％，对照鸡攻毒后死亡率100％；剖检观察，免疫鸡心脏、肝脏和肾脏发育正常，对照鸡出现hhs典型病变；攻毒后泄殖腔拭子pcr检测结果表明，免疫鸡均为阴性，未发生排毒现象，对照鸡均为阳性。elisa抗体检测结果表明，复合免疫制剂接种后1w抗体呈急剧上升趋势，免疫后第5周达到高峰并维持较高水平至免疫后第40周，至免疫后第98周抗体仍处于阳性水平。

15、本发明提供的ⅰ群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂，与现有fadv-4灭活疫苗免疫后14～21天才可产生保护力相比起效快，免疫后0min即可发挥高效保护作用，无免疫空白期；我国现已批复的两项fadv-4灭活疫苗产品，免疫期分别为3个月和4～6个月，本发明提供的ⅰ群4型禽腺病毒免疫制剂免疫期可持续至免疫后第98周，免疫效力更持久。由此可知，本发明提供的是一种ⅰ群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂。

16、本发明提供的一种ⅰ群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂，其免疫效力可有效传递给子代。父母代母鸡2周龄时免疫，至100周龄时对其2w子代仍提供100％保护、对其3w子代提供80％以上的保护。因此，该复合免疫制剂可有效降低鸡群中fadv-4垂直传播隐患和雏鸡早期感染风险。

17、本发明提供的一种ⅰ群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂，对fadv-4感染有良好的治疗效果，fadv-4感染后36小时内接种，治愈率达100％，可作为紧急免疫用疫苗使用，有效阻断fadv-4感染发病和传播。

18、本发明提供的一种ⅰ群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂，其制备工艺规程简单，使用fadv-4病毒感染易感鸡，采集肝组织灭活后即可制备有效抗原，节约了ⅰ群4型禽腺病毒体外培养工艺长期研究的时间成本和研发风险，同时克服了现有ⅰ群4型禽腺病毒体外培养使用鸡胚肝癌细胞(lmh)带来的致瘤性潜在隐患。

19、本发明提供的一种ⅰ群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂，制备材料均选用spf鸡及spf种蛋，与传统疫苗或抗体制造工艺使用普通种蛋相比，可有效避免家禽常见的21种外源病原微生物污染，产品更加纯粹，临床应用更安全，无隐性带毒、传播疫病风险。

20、综上，本发明提供的一种ⅰ群4型禽腺病毒即时长效复合免疫制剂，具有即时保护和免疫期长的明显优势，且免疫效力可稳定持续传递给子代；该复合制剂对fadv-4感染具有良好的治疗作用，可用于该疫病暴发后的紧急治疗；同时，该免疫制剂还具有制备简单、安全性好的工艺优势。因此，该免疫制剂的推广应用将更有利于ⅰ群4型禽腺病毒的预防控制和消灭。