包含抗CTLA4-抗PD-1双特异性抗体和西奥罗尼的药物组合的制作方法

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种包含抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体和西奥罗尼的药物组合及其用途。具体地，本发明涉及一种包含突变的抗ctla4-抗pd-1的双特异性抗体和西奥罗尼或其可药用盐或其晶型的药物组合及其用途。

背景技术：

1、跨膜受体pd-1(程序性细胞死亡-1)是cd28基因家族成员之一，在活化的t细胞，b细胞以及骨髓系细胞都有表达。pd-1的配体pdl1(programmed cell death 1ligand 1，亦简称为pdl-1)和pdl2(programmed cell death 1ligand 2，亦简称为pdl-2)均属于b7超家族，其中pdl1在多种细胞都有表达，包括t细胞，b细胞以及内皮细胞和上皮细胞，pdl2则仅表达于抗原呈递细胞如树突状细胞和巨噬细胞。

2、pd-1/pdl1信号通路在调节免疫耐受、微生物感染及肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。pd-1的表达主要在t细胞等免疫细胞，而pd-1的配体pdl1主要在许多人类肿瘤组织呈高表达。阻断pd-1/pdl1信号通路可使被抑制的t细胞激活，进而攻击癌细胞。阻断pd-1/pdl1信号可以促进肿瘤抗原特异性t细胞的增殖，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，进而抑制局部肿瘤生长(julie r et al.,2012，n engl jmed.366:2455–2465)。另外，高表达pdl1的肿瘤伴随着很难被检测到的癌症(hamanishi et al.,2007,proc.natl.acad.sci.usa 104:3360-5)。一种实施有效的方法是通过体内注射抗pd-1抗体对pd-1的表达进行调控。由于pd-1抗体的广谱抗肿瘤前景和惊人的药效，业界普遍认为针对pd-1通路的抗体将带来治疗多种肿瘤治疗的突破性的进展：用于治疗非小细胞性肺癌，肾细胞癌，卵巢癌，黑色素瘤(hometm.b.,parisi g.,et al.,2015,semin oncol.42(3):466-473)，白血病以及贫血病(heldsa,heine a,et al.,2013,curr cancer drug targets.13(7):768-74)。

3、细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic t lymphocyte sociated antigen4，亦简称为ctla4)与cd28分子在基因结构、染色体定位、序列的同源性及基因表达具有十分相近的关系，都是共刺激分子b7的受体，主要表达于被激活t细胞表面。ctla4与b7结合后能抑制小鼠和人t细胞的激活，在t细胞活化中起负调节作用。

4、ctla4抗体(或抗ctla4单克隆抗体)或ctla4配体可以阻止ctla4与其天然配体结合，从而封闭ctla4对t细胞负性调节信号的传导，增强t细胞对各种抗原的反应性，在这方面体内与体外研究结果基本一致。目前已有ctla4单克隆抗体处于临床试验阶段或被批准用于治疗前列腺癌，膀胱癌，结肠直肠癌，胃肠道癌，肝癌，恶性黑色素瘤等(grosso jf.,jure-kunkel mn.,2013,cancer immun.13:5.)。

5、白细胞介素2(il-2)由t细胞产生，是调节t细胞亚群的生长因子，也是调控免疫应答的重要因子，并可促进活化b细胞增殖，参与抗体反应、造血和肿瘤监视。重组的人il-2已经被美国fda批准用于治疗恶性肿瘤(包括黑色素瘤、肾肿瘤等)，同时正在进行治疗慢性病毒感染的临床研究(chavez,a.r.,et al.,2009,ann n y acad sci,1182:p.14-27)。ctla4及ctla4抗体作为t细胞功能状况的重要影响因素，通过干预机体免疫微环境。体外和体内试验实验中，ctla4抗体可特异地解除ctla4对机体免疫抑制，激活t细胞，诱导il-2产生，在抗肿瘤及寄生虫等疾病的基因治疗中有广泛应用前景。

6、ctla4抗体可对疾病产生特异性治疗作用，并发挥较高疗效，补充传统用药的不足，由此开辟基因治疗的新途径。

7、双特异性抗体(bispecific antibody)亦称为双功能抗体，是同时靶向两种不同抗原的特异性药物，其可通过免疫分选纯化生产。另外，也可通过基因工程获得。基因工程方法在结合位点优化，合成形式的考量以及产量等方面都具有相应的灵活性，所以具有一定的优势。目前，其存在形式已被证明有超过45种(dafne müller,kontermann re.2010,biodrugs,24(2):89-98)。目前已开发的多种双特异性抗体为igg-scfv形式即morrison模式(coloma mj,morrison sl.1997,nat biotechnol.15:159-163)，由于这种类似于天然存在的igg形式，其在抗体工程、表达和纯化上所具有的优势，已被证明是双功能抗体的其中一种理想存在形式(miller br,demarest sj,et al.,2010,protein eng des sel；23:549-57；fitzgerald j,lugovskoy a.2011.mabs；3:299-309)。

8、adcc(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)即抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，是指抗体的fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其fc段与杀伤细胞(nk细胞、巨噬细胞等)表面的fc受体(fc receptor,fcr)结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。

9、cdc(complement dependent cytotoxicity)即补体依赖的细胞毒性，是指当抗体与细胞膜表面相应抗原特异性结合后，形成复合物而激活补体系统，进而在靶细胞表面形成mac，导致靶细胞溶解。补体能导致多种细菌和其他病原生物细胞的溶解，是机体抵抗病原生物感染的重要防御机制。

10、fc受体是表达在特定免疫细胞表面，用于识别抗体fc区域介导免疫应答的免疫球蛋白家族蛋白。抗体fab区域识别抗原后，其抗体fc区域与免疫细胞(如杀伤细胞)上的fc受体结合，启动免疫细胞的应答功能，如吞噬作用及adcc。

11、根据fc受体识别抗体类型及表达细胞的不同，fc受体主要分为fcγr、fcαr和fcεr三种类型，fcγr又可分为fcγri(亦称为cd64)、fcγrii(亦称为cd32)、fcγriii(亦称为cd16)和fcrn(亦称为neonatal fc receptor)四种亚型。其中fcγri、fcγrii、fcγriii与adcc效应密切相关。fcγriii是介导adcc的最主要分子，在不同细胞类型中具有高度同源的fcγriiia和fcγriiib两种亚型，在fcγriiia人群中存在单核干多态性(snp)位点引起的高亲和力fcγriiia亚型，分别称为fcγriiia_v158和低亲和力fcγriiia_f158两个亚型。fcγri对igg的fc区域具有较高的亲和力，参与adcc过程；fcγrii有fcγriia，fcγriib和fcγriic(亦分别称为cd32a，cd32b，cd32c)三个亚型，其中fcγriia具有adcc活性；fcγriia在人群中存在由于单核苷酸突变导致的两种亚型，分别称为fcγriia_h131和fcγriia_r131；fcγriib为抑制性受体，fcγriib是典型的抑制性fcγr，可抑制附近的itam通路。例如，免疫复合物与bcr结合后，fc段会结合同一细胞上的fcγriib，负性调节b细胞激活，减少抗体、细胞因子的分泌(hogarth pm,pietersz ga.2012,nature reviews drugdiscovery,11(4):311-331)。

12、igg家族包含四个成员，igg1、igg2、igg3和igg4，它们重链恒定区的可结晶片段(fragment crystallizable，fc)区域存在氨基酸的差异，导致它们与fcγrs的亲和力各不相同。igg1是人体内最多的亚型，也是单抗药物中用的最多的亚型，igg1能够结合各种fcγrs，能够引发adcc以及cdc效应。igg2与fcγrs的亲和力最弱，但是igg2仍能够通过与fcγriia的结合引发单核细胞介导的adcc。igg3与fcγrs的结合能力最强，能引发adcc，且cdc效应比igg1更强。igg4分子与fcγri之外的fcγrs结合较弱，igg4分子引起cdc和nk细胞介导的adcc的可能性较低；然而，igg4亚型抗体可通过与fcγri的结合介导adcp效应，靶向于免疫细胞的抗体药物存在adcp效应可能会导致免疫细胞损伤，具有影响药物药理学负面效应。目前，尚需要开发新的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，以减少或消除抗体介导的adcc、adcp和/或cdc活性对抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体所结合的免疫细胞造成的损伤，提高抗体药物药效。

13、化疗药物目前主要分为下述九类(赫捷等，临床肿瘤学，北京：人民卫生出版社，2016：230-237)第一类为直接与dna结合，阻止dna复制的药物，包括各种炕化剂、丝裂霉素和博来霉素、达卡巴嗪、铂类药物如顺铂和卡铂、喜树碱类药物及其衍生物；第二类为阻止核酸生物合成的药物，这类药物主要影响瘤细胞的酶系，使dna和rna的前体物合成受阻，从而抑制dna或rna形成，主要包括甲氨蝶岭、氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、羟基脲和阿糖胞苷等，主要作用于s期细胞，属抗代谢类化疗药，为周期特异性抗癌药；第三类为影响转录的化疗药物，主要药理作用是插入dna双螺旋与其形成非共价结合，从而干扰dna上的遗传信息转录到依赖dna的mrna上，导致模报功能受到损害、转录受阻，主要包括。第四类为影晌微管蛋白和有丝分裂的药物主要包括长春碱类、鬼臼毒素类和紫杉醇类等植物药；第五类为影晌核糖体功能，阻止蛋白质合成的药物以二尖杉醋碱类植物药为代表，它能抑制蛋白质合成的起始阶段，使核糖体分解并释出新生肽链，但不能阻止mrna和trna与核糖体的结合这类药可使核dna和胞质rna减少、多聚核糖体解聚，并拥制有丝分裂；第六类为影晌细胞膜的药物植物凝集素如刀豆素(con-a)和植物凝集素(pha)等可以和细胞膜上的糖蛋白受体结舍，从而影响瘤细胞的dna合成，阻止瘤细胞分裂；第七类为诱导细胞凋亡(apoptosis)的药物，如三氧化二砷等；第八类为激素类主要通过调节内分泌米治疗肿瘤，包括雌激素类、抗雌激素类、孕激素类、雄激素类、抗雄激素类、肾上腺皮质激素类、抗肾上腺皮质激素类(包括氯苯二氯乙烷和氨鲁米特)；第九类为抗肿瘤靶点治疗，包括单克隆抗体、表皮生长因子信号传导抑制剂(如针对受体型酪氨酸激酶通路的靶向药物)、泛素蛋白酶体抑制剂、血管生成抑制剂等。

14、西奥罗尼(chiauranib)是由深圳微芯生物科技股份有限公司开发的一种多靶点多通路选择性激酶抑制剂。西奥罗尼可选择性抑制aurora b、csf1r和vegfr/pdgfr/c-kit等多个激酶靶点，从而抑制肿瘤细胞增殖、增强抗肿瘤免疫以及抑制肿瘤血管生成，实现多通路机制的抗肿瘤药效。西奥罗尼在前期的临床试验中，针对多线治疗失败的小细胞肺癌(sclc)患者，相比于历史对照数据，其单药治疗取得了十分积极的疗效结果。中国专利文献(公开号：cn 111728974a)披露了西奥罗尼化合物的结构，为n-(2-氨基苯基)-6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺，其结构式如下面的式i所示。

15、

16、然而，很多肿瘤患者在接受化疗药物治疗后疾病仍无法得到长期控制，5年生存率仍然很低。因此，开发更低毒性、更有效的治疗手段或者联合给药治疗方案具有巨大的临床意义。

技术实现思路

1、本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，创造性地将抗ctla4-抗pd-1抗体与西奥罗尼适当地联用，得到的药物组合具有良好的抗肿瘤效果。

2、由此提供了下述发明：

3、本发明的一个方面涉及一种药物组合，其包含西奥罗尼或其可药用盐(例如盐酸盐)或其晶型(例如非溶剂化晶型a、b或c)，以及至少一种(例如1种、2种或3种)抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体。

4、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述西奥罗尼或其可药用盐或其晶型与所述抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体的质量比为1：(1-1000)，优选为1：(5-500)，更优选为1：(10-100)。

5、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述西奥罗尼或其可药用盐或其晶型与所述抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体的质量比为1：(5-1000)，优选为1：(10-500)，更优选为1：(10-100)、1：(10-150)、1：(10-200)、1：(10-250)、1：(10-300)、1：(10-350)、1：(10-400)或1：(10-450)。

6、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体的单位剂量为100mg-1000mg、200mg-800mg、200mg-500mg、300mg-600mg、400mg-500mg或者450mg。

7、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述西奥罗尼或其可药用盐或其晶型的单位剂量为0.1mg-100mg、0.5mg-50mg、1mg-20mg、2mg-15mg、3mg-12mg、4mg-8mg或者5mg。

8、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，

9、所述药物组合为固定组合，例如为药物组合物；或者

10、所述药物组合是非固定组合，例如所述非固定组合中的西奥罗尼或其可药用盐或其晶型、抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体各自存在于独立的药物组合物中。

11、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其中，所述药物组合物独立地为固体药物组合物或液体药物组合物。

12、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的辅料，例如载体和/或赋形剂。

13、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述药物组合物不包含除了西奥罗尼或其可药用盐或其晶型和抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体其它活性药物成分。

14、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其包括：

15、靶向pd-1的第一蛋白功能区，和

16、靶向ctla4的第二蛋白功能区；

17、其中：

18、所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为单链抗体；其中，所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:27－29所示的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:30－32所示的lcdr1－lcdr3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:33－35所示的hcdr1－hcdr3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:36－38所示的lcdr1－lcdr3；

19、或者，

20、所述第一蛋白功能区为单链抗体，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白；其中，所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:33－35所示的hcdr1－hcdr3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:36－38所示的lcdr1－lcdr3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:27－29所示的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:30－32所示的lcdr1－lcdr3；

21、所述免疫球蛋白均为人igg1亚型；

22、并且按照eu编号系统(eu numbering system)，所述免疫球蛋白的重链恒定区在第234位点、235位点和237位点中的任意2个位点或3个位点发生突变，并且突变后，双特异性抗体与fcγriiia和/或c1q的亲和力常数相比突变前降低；优选地，所述亲和力常数通过fortebio octet分子相互作用仪测得。

23、在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其中，发生上述突变后，双特异性抗体与fcγriiia、fcγri、fcγriia_h131、fcγriiia_v158和/或fcγriib的亲和力常数相比突变前降低；优选地，所述亲和力常数通过fortebio octet分子相互作用仪测得。

24、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其中，按照eu编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区具有如下突变：

25、l234a和l235a；或者

26、l234a和g237a；或者

27、l235a和g237a；

28、或者

29、l234a、l235a、g237a。

30、本发明中，如果没有特别说明，位点之前的字母表示突变前的氨基酸，位点之后的字母表示突变后的氨基酸。

31、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其包括：

32、靶向pd-1的第一蛋白功能区，和

33、靶向ctla4的第二蛋白功能区；

34、其中：

35、所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为单链抗体；其中，所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:27－29所示的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:30－32所示的lcdr1－lcdr3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:33－35所示的hcdr1－hcdr3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:36－38所示的lcdr1－lcdr3；

36、或者，

37、所述第一蛋白功能区为单链抗体，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白；其中，所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:33－35所示的hcdr1－hcdr3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:36－38所示的lcdr1－lcdr3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:27－29所示的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seq id nos:30－32所示的lcdr1－lcdr3；

38、所述免疫球蛋白均为人igg1亚型；

39、并且按照eu编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区具有如下突变组合之一：

40、l234a和l235a；或者

41、l234a和g237a；或者

42、l235a和g237a；或者

43、l234a、l235a、g237a。

44、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其中，按照eu编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区还具有选自如下的一个或多个突变：

45、n297a、d265a、d270a、p238d、l328e、e233d、h268d、p271g、a330r、c226s、c229s、e233p、p331s、s267e、l328f、a330l、m252y、s254t、t256e、n297q、p238s、p238a、a327q、a327g、p329a、k322a、t394d、g236r、g236a、l328r、a330s、p331s、h268a、e318a和k320a。

46、在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其为igg-scfv形式即morrison模式。

47、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其中，

48、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列选自seq id no:14和seq id no:18；并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列选自seq id no:16和seq id no:20；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列选自seq id no:2、seq id no:6、seq id no:10、seq id no:41和seq id no:43；并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自seq idno:4、seq id no:8、seq id no:12、seq id no:42和seq id no:44；

49、或者，

50、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列选自seq id no:2、seq id no:6、seqid no:10、seq id no:41和seq id no:43；并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列选自seq id no:4、seq id no:8、seq id no:12、seq id no:42和seq id no:44；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列选自seq id no:14和seq id no:18；并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自seq id no:16和seq id no:20。

51、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其选自如下的(1)－(20)中的任一项：

52、(1)

53、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:16所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:4所示；

54、(2)

55、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:16所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:6所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:8所示；

56、(3)

57、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:16所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:10所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:12所示；

58、(4)

59、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:18所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:20所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:4所示；

60、(5)

61、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:18所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:20所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:6所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:8所示；

62、(6)

63、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:18所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:20所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:10所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:12所示；

64、(7)

65、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:4所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq idno:16所示；

66、(8)

67、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:4所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:18所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq idno:20所示；

68、(9)

69、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:6所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:8所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq idno:16所示；

70、(10)

71、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:6所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:8所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:18所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq idno:20所示；

72、(11)

73、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:10所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:12所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:16所示；

74、(12)

75、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:10所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:12所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:18所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:20所示；

76、(13)

77、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:16所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:41所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:42所示；

78、(14)

79、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:16所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:43所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:44所示；

80、(15)

81、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:18所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:20所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:41所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:42所示；

82、(16)

83、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:18所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:20所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:43所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:44所示；

84、(17)

85、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:41所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:42所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:16所示；

86、(18)

87、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:43所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:44所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:16所示；

88、(19)

89、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:41所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:42所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:18所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:20所示；

90、以及，

91、(20)

92、所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:43所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:44所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:18所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:20所示。

93、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体：

94、所述免疫球蛋白的重链的氨基酸序列如seq id no:40所示，并且其轻链的氨基酸序列如seq id no:24所示。

95、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其中，所述免疫球蛋白或其抗原结合片段以大于大约10-7m，例如大于大约10-6m、10-5m、10-4m或10-3m或更大的亲和力常数结合fcγriiia_f158、fcγri、fcγriia_h131、fcγriiia_v158和/或fcγriib；优选地，所述亲和力常数通过fortebio octet分子相互作用仪测得；

96、优选地，所述免疫球蛋白或其抗原结合片段与fcγriiia_f158、fcγri、fcγriia_h131、fcγriiia_v158和/或fcγriib没有结合信号或者结合信号小于0.1nm；优选地，所述结合信号是指通过fortebio octet分子相互作用仪测得的响应值。

97、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其中，所述免疫球蛋白或其抗原结合片段以大于大约10-9m，例如大于大约10-8m、10-7m、10-6m或10-5m或更大的亲和力常数结合c1q；优选地，所述亲和力常数通过fortebiooctet分子相互作用仪测得；

98、优选地，所述免疫球蛋白或其抗原结合片段与c1q没有结合信号或者结合信号小于0.1nm；优选地，所述结合信号是指通过fortebio octet分子相互作用仪测得的响应值。

99、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区与所述第二蛋白功能区直接连接或者通过连接片段连接；和/或所述单链抗体的重链可变区与所述单链抗体的轻链可变区直接连接或者通过连接片段连接。

100、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其中，所述连接片段为(ggggs)n，n为正整数；优选地，n为1、2、3、4、5或6。

101、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为1个、2个或者2个以上。

102、在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区为1个，和第二蛋白功能区为2个。

103、在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其中，所述单链抗体连接在免疫球蛋白的重链的c末端。由于免疫球蛋白由两条重链，因此，一个免疫球蛋白分子连接有两个单链抗体分子。优选地，两个单链抗体分子相同。优选地，所述单链抗体通过前述连接片段与免疫球蛋白的重链的c末端形成酰胺键连接。

104、在本发明的一个或多个实施方案中，所述免疫球蛋白的恒定区是人源化的，例如，重链恒定区均采用ig gamma-1chain c region，accession:p01857；轻链恒定区均采用igkappa chain c region，accession:p01834。

105、在本发明的一个或多个实施方案中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体以小于大约10-5m，例如小于大约10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的kd结合ctla4蛋白和/或pd-1蛋白。

106、在本发明的一个或多个实施方案中，所述的药物组合，其中，所述抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体为单克隆抗体。

107、在本发明的一个或多个实施方案中，所述的药物组合，其中，所述抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体为人源化抗体。

108、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其中，所述单链抗体连接在免疫球蛋白的重链的c末端。

109、在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体，其包括：

110、靶向pd-1的第一蛋白功能区，和

111、靶向ctla4的第二蛋白功能区；

112、所述第一蛋白功能区为1个，所述第二蛋白功能区为2个；

113、其中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为单链抗体；

114、所述免疫球蛋白的重链的氨基酸序列如seq id no:40所示，并且其轻链的氨基酸序列如seq id no:24所示；

115、所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:43所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:44所示；

116、所述单链抗体连接在免疫球蛋白的重链的c末端；

117、所述第一蛋白功能区与所述第二蛋白功能区通过第一连接片段连接；并且所述单链抗体的重链可变区与所述单链抗体的轻链可变区通过第二连接片段连接；所述第一连接片段和所述第二连接片段相同或不同；

118、优选地，所述第一连接片段和所述第二连接片段的氨基酸序列独立地选自seq idno:25和seq id no:26；

119、优选地，所述第一连接片段和所述第二连接片段的氨基酸序列均如seq id no:26所示。

120、本发明的另一方面涉及一种药盒产品，其包含本发明中任一项所述的药物组合，以及产品说明书。

121、在本发明的一些实施方式中，所述的药盒产品，其包含独立包装的第一产品和第二产品，

122、其中，

123、所述第一产品包含本发明中任一项所述的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体；

124、所述第二产品包含西奥罗尼或其药学上可接受的盐(例如盐酸盐)或其晶型(例如非溶剂化晶型a、b或c)；

125、优选地，所述第一产品和所述第二产品还独立地包含一种或多种药学上可接受的辅料；

126、优选地，所述药盒产品还包含产品说明书。

127、在本发明的一个或多个实施方案中，所述的药盒产品，其中，所述第一产品的单位剂量，按照其中的所述抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体的质量计算，为100mg-1000mg、200mg-800mg、200mg-500mg、300mg-600mg、400mg-500mg或者450mg。

128、在本发明的一个或多个实施方案中，所述的药盒产品，其中，所述第二产品的单位剂量，按照其中的西奥罗尼或其可药用盐或其晶型的质量计算，为0.1mg-100mg、0.5mg-50mg、0.5mg-10mg、1mg-10mg、2mg-8mg或者1mg-5mg或者5mg。

129、在本发明的一个或多个实施方案中，所述的药盒产品，其中，所述第二产品的单位剂量，按照其中的西奥罗尼或其可药用盐或其晶型的质量计算，为1mg-20mg、2mg-15mg、3mg-12mg、4mg-8mg或者5mg。

130、本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的药物组合在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途；

131、优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、白血病、乳腺癌、间皮瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、胰腺癌和鼻咽癌中的一种或多种；

132、优选地，所述肺癌选自非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌和肺鳞癌中的一种或多种；

133、优选地，所述胃癌为胃腺癌或食管结合部腺癌；

134、优选地，所述肿瘤为具有msi-h/dmmr表型的实体瘤；优选地，所述肿瘤选自具有msi-h/dmmr表型的下述肿瘤中的一种或多种：

135、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、间皮瘤、肉瘤、肾上腺皮质癌、恶性黑色素瘤和卵巢生殖细胞肿瘤。

136、msi(microsatellite instability)是微卫星不稳定性。微卫星(microsatellite)是遍布于人类基因组中的短串联重复序列,有单核苷酸、双核苷酸或高位核苷酸的重复，重复次数10-50次。与正常细胞相比，某些异常组织细胞，如肿瘤，内的微卫星由于重复单位的插入或缺失而导致微卫星长度的改变，就叫做msi。根据msi不稳定性和程度，可分为微卫星高度不稳定型(msi-h)、微卫星低度不稳定型(msi-l)和微卫星稳定型(mss)。造成msi的主要原因是dna错配修复(mismatch repair，mmr)功能缺陷。人类错配修复基因(mmr基因)经转录翻译后可表达相应的错配修复蛋白，如果任一mmr蛋白表达缺失可造成细胞的错配修复功能缺陷，则对dna复制过程中的碱基错配丧失修复功能而造成累积，导致微卫星不稳定(msi)的发生，约15％的结直肠癌是经由msi途径引发的。最早发现于结直肠癌，也可发生于胃癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质肿瘤等(baretti m等人.pharmacolther.2018；189:45-62.)，后续研究在间皮瘤、肉瘤、肾上腺皮质癌、恶性黑色素瘤和卵巢生殖细胞肿瘤中亦发现msi-h/dmmr特征。

137、msi-h和dmmr代表两种不同检测方法所产生的结果，dmmr与msi-h在生物学上具有一致性，称为msi-h/dmmr或者msi-high/dmmr，msi-l和mss则是mmr正常(proficientmismatch repair，pmmr)的表型。dmmr检测方法为基于肿瘤标本(包括手术标本、穿刺标本)进行msh2、mlh1、msh6以及pms2四个错配基因的免疫组化蛋白检测，若四个蛋白里面任何一个蛋白表达缺失则为dmmr；如四个蛋白均为阳性表达则肿瘤为pmmr，即错配修复功能完整。msi的检测为肿瘤细胞和体细胞重复dna序列(微卫星序列)的长度进行一一配对检测，并比较长度。当使用pcr方法并基于美国nci标准检测5个标准位点时，如果其中有两个或两个以上位点不一致则为不稳定，定义为msi-h，如果一个位点不一致则称为msi-l(微卫星低度不稳定)，如5个位点均一致则为mss。高通量测序(high-throughput sequencing)(或称下一代测序，next-generation sequencing technology，ngs)亦可作为检测微卫星不稳定性的方法。当选用更多的微卫星位点，如多于5个或者其他一些微卫星位点，进行pcr检测时，通常≥30％的位点不一致就叫msi-h，所有位点都一致就定义为mss，在0到30％之间是msi-l。

138、根据本发明中任一项所述的药物组合，其用于治疗或预防肿瘤；

139、优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、白血病、乳腺癌、间皮瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、胰腺癌和鼻咽癌中的一种或多种；

140、优选地，所述肺癌选自非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌和肺鳞癌中的一种或多种；

141、优选地，所述胃癌为胃腺癌或食管结合部腺癌；

142、优选地，所述肿瘤为具有msi-h/dmmr表型的实体瘤；优选地，所述肿瘤选自具有msi-h/dmmr表型的下述肿瘤中的一种或多种：

143、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、间皮瘤、肉瘤、肾上腺皮质癌、恶性黑色素瘤和卵巢生殖细胞肿瘤。

144、本发明的再一方面涉及一种治疗或预防肿瘤的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的药物组合的步骤；

145、优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、白血病、乳腺癌、间皮瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、胰腺癌和鼻咽癌中的一种或多种；

146、优选地，所述肺癌选自非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌和肺鳞癌中的一种或多种；

147、优选地，所述胃癌为胃腺癌或食管结合部腺癌；

148、优选地，所述肿瘤为具有msi-h/dmmr表型的实体瘤；优选地，所述肿瘤选自具有msi-h/dmmr表型的下述肿瘤中的一种或多种：

149、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、间皮瘤、肉瘤、肾上腺皮质癌、恶性黑色素瘤和卵巢生殖细胞肿瘤。

150、在本发明的一个或多个实施方式中，所述的治疗或预防肿瘤的方法，其中，所述给予有需求的受试者以有效量的抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体的步骤为在手术治疗之前或之后，和/或在放射治疗之前或之后。

151、在本发明的一个或多个实施方式中，所述的治疗或预防肿瘤的方法，其中，

152、抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体的单次给药剂量为每千克体重0.1-100mg，优选1-10mg(例如1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg)；或者，抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体的单次给药剂量为每位受试者10-1000mg(例如大约100mg、大约150mg、大约200mg、大约250mg、大约300mg、大约350mg、大约400mg、大约450mg、大约500mg、大约600mg、大约700mg、大约800mg、大约900mg或大约1000mg)，优选50-500mg、100-400mg、150-300mg、150-250mg或200mg；

153、优选地，每3天、4天、5天、6天、10天、1周、2周或3周给药一次；

154、优选地，给药方式为静脉滴注或静脉注射。

155、在一些方案中，抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体的施用治疗以2周(14天)或3周(21天)为一个周期，优选在每个周期第一天(d1)静脉给予抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体。例如，所述抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体以每两周一次(q2w)或者每三周一次(q3w)的频率施用。

156、在本发明的一个或多个实施方式中，所述的治疗或预防肿瘤的方法，其中，所述抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体和西奥罗尼同时或顺序施用。

157、抗体治疗药物，特别是单克隆抗体(mab)已在多种疾病的治疗中取得了良好的疗效。获取这些治疗性抗体的传统实验方法是采用抗原免疫动物，在免疫动物体内获取靶向抗原的抗体，或通过亲和力成熟的方法来改进那些与抗原的亲和力较低的抗体。

158、轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(cdr)(重链(h)的cdr包含hcdr1、hcdr2、hcdr3，轻链(l)的cdr包含lcdr1、lcdr2、lcdr3；其由kabat等人命名，见sequences of proteins of immunological interest,fifth edition(1991),第1-3卷,nih publication 91-3242,bethesda md)。

159、通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过vbase2数据库分析下面的(1)-(13)项中的单克隆抗体序列的cdr区的氨基酸序列，结果如下：

160、(1)14c12

161、重链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:16所示。

162、其重链可变区的3个cdr区的氨基酸序列如下：

163、hcdr1:gfafssyd(seq id no:27)

164、hcdr2:isgggryt(seq id no:28)

165、hcdr3:anrygeawfay(seq id no:29)

166、其轻链可变区的3个cdr区的氨基酸序列如下：

167、lcdr1:qdinty(seq id no:30)

168、lcdr2:ran(seq id no:31)

169、lcdr3:lqydefplt(seq id no:32)

170、(2)14c12h1l1

171、重链可变区的氨基酸序列如seq id no:18所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:20所示。

172、其重链可变区的3个cdr区的氨基酸序列与14c12相同。

173、其轻链可变区的3个cdr区的氨基酸序列与14c12相同。

174、(3)4g10

175、重链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:4所示；

176、其重链可变区的3个cdr区的氨基酸序列如下：

177、hcdr1:gysftgyt(seq id no:33)

178、hcdr2:inpynnit(seq id no:34)

179、hcdr3:arldyrsy(seq id no:35)

180、其轻链可变区的3个cdr区的氨基酸序列如下：

181、lcdr1:tgavttsnf(seq id no:36)

182、lcdr2:gtn(seq id no:37)

183、lcdr3:alwysnhwv(seq id no:38)

184、(4)4g10h1l1

185、重链可变区的氨基酸序列如seq id no:6所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:8所示；

186、其重链可变区的3个cdr区的氨基酸序列与4g10相同。

187、其轻链可变区的3个cdr区的氨基酸序列与4g10相同。

188、(5)4g10h3l3

189、重链可变区的氨基酸序列如seq id no:10所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:12所示；

190、其重链可变区的3个cdr区的氨基酸序列与4g10相同。

191、其轻链可变区的3个cdr区的氨基酸序列与4g10相同。

192、(6)biab001(m)

193、其重链可变区涉及的9个cdr区的氨基酸序列如下：

194、hcdr1:gfafssyd(seq id no:27)

195、hcdr2:isgggryt(seq id no:28)

196、hcdr3:anrygeawfay(seq id no:29)

197、hcdr4:gysftgyt(seq id no:33)

198、hcdr5:inpynnit(seq id no:34)

199、hcdr6:arldyrsy(seq id no:35)

200、hcdr7:tgavttsnf(seq id no:36)

201、hcdr8:gtn(seq id no:37)

202、hcdr9:alwysnhwv(seq id no:38)

203、其轻链可变区涉及的3个cdr区的氨基酸序列如下：

204、lcdr1:qdinty(seq id no:30)

205、lcdr2:ran(seq id no:31)

206、lcdr3:lqydefplt(seq id no:32)

207、(7)biab002(m)

208、其重链可变区涉及的9个cdr区的氨基酸序列与biab001(m)相同。

209、其轻链可变区涉及的3个cdr区的氨基酸序列与biab001(m)相同。

210、(8)biab003(m)

211、其重链可变区涉及的9个cdr区的氨基酸序列与biab001(m)相同。

212、其轻链可变区涉及的3个cdr区的氨基酸序列与biab001(m)相同。

213、(9)biab004(m)

214、其重链可变区涉及的9个cdr区的氨基酸序列与biab001(m)相同。

215、其轻链可变区涉及的3个cdr区的氨基酸序列与biab001(m)相同。

216、本发明的抗体biab004(hg1tm)在biab004(m)非可变区引入氨基酸突变。按照eu编号系统在234、235和237位点引入氨基酸突变：

217、通过在其重链铰链区域第234号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(l234a)，第235号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(l235a)，第237号位点引进了甘氨酸到丙氨酸的点突变(g237a)获得biab004(hg1tm)。

218、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

219、如本文中所使用的，当提及ctla4蛋白(cytotoxic t-lymphocyte associatedantigen 4)的氨基酸序列时，其包括但不限于ctla4蛋白的全长，或者ctla4的胞外片段ctla4ecd或者包含ctla4ecd的片段；还包括ctla4ecd的融合蛋白，例如与小鼠或人igg的fc蛋白片段(mfc或hfc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在ctla4蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“ctla4蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。并且，当描述ctla4蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。

220、如本文中所使用的，当提及pd-1蛋白的氨基酸序列时，其包括但不限于pd-1蛋白(ncbi genbank:nm_005018)的全长，或者pd-1的胞外片段pd-1ecd或者包含pd-1ecd的片段；还包括pd-1ecd的融合蛋白，例如与小鼠或人igg的fc蛋白片段(mfc或hfc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在pd-1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“添加)，蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。并且，当描述pd-1蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。

221、如本文中所使用的，如果没有特别说明，所述b7为b7-1和/或b7-2；其具体蛋白序列为现有技术中已知序列，可以参考现有文献或者genbank中公开的序列。例如，b7-1(cd80,ncbi gene id:941)；b7-2(cd86,ncbi gene id:942)。

222、如本文中所使用的，术语ec50是指半数最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，是指能引起50％最大效应的浓度。

223、如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(l)链和一条“重”(h)链)组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ轻链。重链通常可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“基酸区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“基酸区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循kabat sequences of proteins of immunologicalinterest(national institutes of health,bethesda,md.(1987and 1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature 342:878-883的定义。特别地，重链还可以包含3个以上cdr，例如6、9、或12个。例如在本发明的双功能抗体中，重链可以是igg抗体的重链的c端连接另一个抗体的scfv，这种情况下重链含有9个cdr。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。

224、可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

225、在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

226、如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(kohler et al.,nature,256:495,1975)，但也可采用重组dna技术获得(如参见u.s.patent 4,816,567)。

227、如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分cdr区被一非人源抗体(供体抗体)的cdr区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(fr)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，jones et al.,nature,321:522 525(1986)；reichmann etal.,nature,332:323 329(1988)；presta,curr.op.struct.biol.,2:593 596(1992)；和clark,immunol.today 21:397 402(2000)。

228、如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，epitopemapping protocols in methods in molecular biology，第66卷，g.e.morris，ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。

229、如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

230、如本文中所使用的，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：gi698,er2566,bl21(de3),b834(de3),blr(de3)。

231、如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

232、如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。

233、如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5m，例如小于大约10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的亲和力(kd)结合该抗原。在本发明的一些实施方案中，术语“靶向”是指特异性结合。

234、如本文中所使用的，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5m，例如小于大约10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的解离平衡常数(kd)结合抗原，例如，如使用表面等离子体共振术(spr)在biacore仪中测得，或通过fortebio octet分子相互作用仪测得。

235、如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。

236、如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington's pharmaceutical sciences.edited by gennaro ar,19thed.pennsylvania:mack publishing company,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

237、如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。

238、如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如ctla4与b7结合或者ctla4活性过高相关的疾病如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如ctla4与b7结合或者ctla4活性过高相关的疾病如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

239、“复发性”癌症是在对初始治疗(例如手术)产生应答后，在初始部位或远处部位再生的癌症。“局部复发性”癌症是在治疗后，在与先前治疗的癌症相同的位置出现的癌症。

240、“转移性”癌症是指从身体的一部分(例如肺部)扩散到身体的另一部分的癌症。

241、如本文中所使用的，术语“完全消除”是指通过现有的仪器设备(例如fortebiooctet分子相互作用仪)检测显示没有结合信号或结合信号极低。在本发明的一个实施方案中，没有结合信号或结合信号极低是指结合信号(即响应值或response)低于0.1nm。

242、在本发明中，如果没有特别说明，所述“第一”(例如第一蛋白功能区、第一连接片段或者第一产品)和“第二”(例如第二蛋白功能区、第二连接片段或者第二产品)是为了指代上的区分或表述上的清楚，并不具有典型的次序上的含义。

243、本发明中，如果没有特别说明，“大约”或者“约”是指在所修饰的数值或者物理量的10％、20％或30％的范围内上下浮动，例如，大约100分钟或约100分钟，可以是90分钟-110分钟、80分钟-120分钟或者70分钟-130分钟。

244、西奥罗尼的晶型包括但不限于非溶剂化晶型a、非溶剂化晶型b和非溶剂化晶型c，参照中国专利授权cn 107868044b中的记载，其中：

245、所述非溶剂化晶型a的x-射线粉末衍射图在反射角2θ为6.88°、9.26°、12.74°、13.82°、18.58°、20.86°和25.72°处有特征峰；

246、所述非溶剂化晶型b的x-射线粉末衍射图在反射角2θ为4.88°、9.68°、12.74°、14.52°、17.72°、24.30°、25.26°处具有特征峰；

247、所述非溶剂化晶型c的x-射线粉末衍射图在反射角2θ为4.84°、9.68°、12.92°、14.60°、16.46°、17.44°、22.00°、25.28°处具有特征峰。

248、发明的有益效果

249、本发明实现了如下的(1)至(2)项中所述技术效果中的一项或多项：

250、(1)本发明的药物组合具有良好的治疗或预防肿瘤的效果。

251、(2)本发明的药物组合中，抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体与西奥罗尼具有协同作用，取得了治疗或预防肿瘤协同效果；其中所述肿瘤包括但不限于：黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、白血病、乳腺癌、间皮瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、胰腺癌或鼻咽癌；优选地，所述肺癌为非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌或肺鳞癌；优选地，所述胃癌为胃腺癌或食管结合部腺癌。