酸枣仁皂甙A的药物用途的制作方法

酸枣仁皂甙a的药物用途
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，涉及酸枣仁皂甙a在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。


背景技术：

2.神经脱髓鞘疾病是神经系统的疾病，神经脱髓鞘疾病可以包括影响中枢神经系统和周围神经系统的疾病。中枢神经系统神经脱髓鞘疾病包括多发性硬化、德维克病 (devic’s disease)、炎性神经脱髓鞘疾病、中枢神经系统神经病如由维生素b12缺乏所引起的；骨髓病如脊髓痨(tabesdorsalis)，脑白质病如进行性多灶性白质脑病，脑白质营养不良或其组合。周围神经系统的神经脱髓鞘疾病包括格林巴利综合征(gbs)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、传导阻滞多灶性运动神经病 (mmn)和副蛋白血症脱髓鞘性周围神经病 (pdn)。
3.神经脱髓鞘疾病中神经元的髓鞘受损，该损伤损害受影响神经元中的信号转导。继而，根据受影响的神经类型、转导的降低导致感觉、运动、认知或其他功能中的缺陷。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种用于预防或治疗神经脱髓鞘疾病的药物。
5.本发明的目的是提供一种酸枣仁皂甙a在神经脱髓鞘疾病药物制备中的应用。
6.本发明的另一目的是提供以酸枣仁皂甙a或其药学可接受的盐作为活性成分，用于制备治疗或预防各种神经脱髓鞘疾病的药物组合物。
7.在第一方面，本发明提供了酸枣仁皂甙a或其衍生物在制备用于预防或治疗神经脱髓鞘疾病的药物中的应用。
8.本发明中，酸枣仁皂甙可以以不同形式存在，例如，本发明包括所述化合物的所有变体形式。在一些实施方式中，所述酸枣仁皂甙的衍生物包括酸枣仁皂甙a的游离酸、游离碱、酯、前药、药学上可接受的盐或互变异构体。
9.在一些实施方式中，所述神经脱髓鞘疾病包括：多发性硬化症、视神经炎、特发性炎性神经脱髓鞘疾病、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、横贯性脊髓炎、巴洛同心性硬化、脑桥中部髓鞘溶解、脊髓痨、视神经脊髓炎、进行性多灶性白质脑病、抗mag神经病、遗传性运动和感觉神经病、脑腱黄瘤病、以及脑白质营养不良，包括肾上腺脑白质营养不良、肾上腺脊髓神经病、卡纳万病、消失性白质病、亚历山大病、雷夫叙姆病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、异染性脑白质营养不良、球样细胞性脑白质营养不良。
10.在一些实施方式中，其中所述神经脱髓鞘疾病为急性炎性脱髓鞘性多发性神经病。
11.在一些实施方式中，所述酸枣仁皂甙a或其衍生物能缓解神经脱髓鞘疾病的症状、延迟神经脱髓鞘疾病的发展或者延长神经脱髓鞘疾病的复发时间，有效地保护髓鞘脱失。
12.在一些实施方式中，所述酸枣仁皂甙a或其衍生物具有保护髓鞘脱失的作用。
13.本发明的发明人通过酸枣仁皂甙a的nf-κb抑制作用的研究中，发现酸枣仁皂甙a具有极强的nf-κb抑制活性，对酸枣仁皂甙a进行了动物药效实验，结果发现其表现出了抑制炎症，能够有效保护髓鞘脱失的作用。治疗有效量的酸枣仁皂甙a可以减轻炎症、减少脱髓鞘、减少轴突丢失和/或减少神经元丢失。因此酸枣仁皂甙a或其衍生物可开发为预防或治疗神经脱髓鞘疾病的药物。
14.在第二方面，本发明提供了一种用于预防或治疗神经脱髓鞘疾病的药物组合物，所述药物组合物包括酸枣仁皂甙a或其衍生物，以及药学上可接受的载体。
15.在一些实施方式中，所述酸枣仁皂甙的衍生物包括酸枣仁皂甙a的游离酸、游离碱、酯、前药、药学上可接受的盐或互变异构体。
16.在一些实施方式中，所述药物组合物包括酸枣仁皂甙a或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
17.在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、调节剂、表面活性剂以及吸附载体中的一种或多种。
18.在一些实施方式中，所述酸枣仁皂甙a或其衍生物在药物组合物中的有效含量为1-95%，例如为1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、95%或它们之间的任意值。
19.上述的药物组合物，其组成含有治疗有效量的酸枣仁皂甙a或其药学可接受的盐，所述的酸枣仁皂甙a化合物在药物组合物当中可以是单独使用，也可以与其他药物配合使用。其中所述药物组合物的单剂量含活性成分酸枣仁皂甙a及其衍生物在药物组合物中的有效含量为1-95%。本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以进行改变从而获得能够对于具体患者、组合物以及给药模式而言有效达到需要的治疗响应的一定量的活性化合物。选定的剂量水平取决于具体化合物的活性、给药途径、待治疗疾病的严重程度以及待治疗患者的情况和前病史。然而，本领域的技术人员可以从较低的剂量开始给药，该剂量低于达到理想治疗效果所需要的剂量，然后逐渐增加剂量直到获得理想疗效。
20.上述的药物组合物除了含有治疗有效量的酸枣仁皂甙a或其药学可接受的盐之外，还含有药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等；填充剂如淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙、碳酸氢钠等；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇等；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、聚乙二醇等，另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
21.上述药物组合物是药剂学上所说的任何一种剂型，包括片剂、胶囊剂、软胶囊、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、颗粒剂、口服液和注射剂。
22.本发明的药物组合物通常可以通过口服、静脉内、皮下、颊内、直肠、皮肤、鼻内、气管、支气管给药，可以通过任何其它胃肠外途径给药，也可以例如通过口服或者鼻腔喷雾或通过吸入给药。
23.本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，然后将其制成所需的剂型。药物组合物可以使用多种方法中的任何一种制备，包括但不限于常规混
合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋和冻干。
24.本发明的药物组合物可以用于治疗各种神经脱髓鞘疾病，包括影响中枢神经系统和周围神经系统的疾病。比如：神经脱髓鞘疾病包括：多发性硬化症、视神经炎、特发性炎性神经脱髓鞘疾病、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、横贯性脊髓炎、巴洛同心性硬化、脑桥中部髓鞘溶解、脊髓痨、视神经脊髓炎、进行性多灶性白质脑病、抗mag神经病、遗传性运动和感觉神经病、脑腱黄瘤病、以及脑白质营养不良，包括肾上腺脑白质营养不良、肾上腺脊髓神经病、卡纳万病、消失性白质病、亚历山大病、雷夫叙姆病及佩利措伊斯-梅茨巴赫病、异染性脑白质营养不良、球样细胞性脑白质营养不良。
25.本发明还提供了一种预防或治疗神经脱髓鞘疾病的方法，该方法包括向有此需要的个体施用治疗有效量的酸枣仁皂甙a或其衍生物。
26.在一些实施方式中，所述神经脱髓鞘疾病包括：多发性硬化症、视神经炎、特发性炎性神经脱髓鞘疾病、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、横贯性脊髓炎、巴洛同心性硬化、脑桥中部髓鞘溶解、脊髓痨、视神经脊髓炎、进行性多灶性白质脑病、抗mag神经病、遗传性运动和感觉神经病、脑腱黄瘤病、以及脑白质营养不良，包括肾上腺脑白质营养不良、肾上腺脊髓神经病、卡纳万病、消失性白质病、亚历山大病、雷夫叙姆病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、异染性脑白质营养不良、球样细胞性脑白质营养不良。
27.在一些实施方式中，其中所述神经脱髓鞘疾病为急性炎性脱髓鞘性多发性神经病。
28.在一些实施方式中，该方法包括向有此需要的个体施用治疗有效量的酸枣仁皂甙a或其药学上可接受的盐。
29.本发明的方法包括哺乳动物的治疗。哺乳动物包括人。
30.本发明提供了治疗有效量的酸枣仁皂甙a或其衍生物。“治疗有效量”与“治疗有效剂量”的含义相同，并且当用于治疗神经脱髓鞘疾病时是指实现所需治疗效果所必需的化合物、组合物或组合的剂量，其包括足以减轻症状或使患者进入临床缓解期的剂量。本发明的用于治疗神经脱髓鞘疾病的化合物、组合物或组合中的活性成分的量可以变化，以便获得合适的剂量。
31.另外，在使用本发明的化合物或药物组合物的重复施用的情况下，本发明的化合物或药物组合物的实际有效量将进一步取决于因素，包括但不限于，给药的频率，本发明的化合物或药物组合物的半衰期。考虑到各种给药途径的不同效率，必需有效量的巨大的差异是预期之中的。例如，通常口服给药需要比通过静脉内注射给药更高的剂量水平。
32.给药可以是单剂量或累积的（连续给药），并且可由本领域技术人员很容易地确定。例如，神经脱髓鞘疾病的治疗可包括一次性施用有效剂量的本发明的化合物或药物组合物。或者，治疗神经脱髓鞘疾病可包括在一段时间内，例如每天、每几天、每周、每月或每年进行多次施用有效剂量的本发明的化合物或药物组合物。
33.本发明的发明人通过实验发现酸枣仁皂甙a可以改善、维持或延缓髓鞘疾病的恶化，能够降低髓鞘脱失的作用。因此酸枣仁皂甙a作为治疗脱髓鞘周围神经病药物具有很重要的临床意义和应用前景。
附图说明
34.图1显示了酸枣仁皂甙a基于报告基因靶向nf-κb信号通路的抑制作用。
35.图2显示了酸枣仁皂甙a对大鼠淋巴结 mnc 对不同抗原刺激的增殖实验结果。
36.图3显示了酸枣仁皂甙a对实验性自身免疫性神经炎模型中tnf-α、ifn-γ及il-10含量的影响。
37.图4显示了酸枣仁皂甙a对实验性自身免疫性神经炎模型中坐骨神经病理切片的影响。其中，a为正常对照组，b为ena组，c为酸枣仁皂甙a组，he
ꢀ×ꢀ
400。
38.图5显示了cpz介导的急性髓鞘脱失动物模型组mbp髓鞘标志蛋白含量随时间的变化。
39.图6显示了cpz介导的急性髓鞘脱失动物模型组plp和cnpase两种髓鞘标志蛋白含量随时间的变化。
40.图7显示了酸枣仁皂甙a对cpz介导的急性髓鞘脱失动物模型的gst-pi标记和bdnf表达的影响。
41.图8显示了酸枣仁皂甙a对cpz介导的急性髓鞘脱失动物模型的髓鞘碱性蛋白（mbp）的影响。
42.图1-8中，*p《0.05，** p《0.01，*** p《0.001。
具体实施方式
43.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
44.除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
45.除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
46.本技术中，酸枣仁皂甙a（jujuboside a），分子式c58h94o26，分子量1207.36，是大枣中含有的一种三萜皂苷类化合物。酸枣仁皂甙a的结构式如下：
47.术语“治疗”包括改善神经脱髓鞘疾病的一种或多种症状的治疗，或者延缓此类疾病进程的治疗，例如预防或延缓脱髓鞘例如周围脱髓鞘；它也包括治愈此类疾病的治疗，使得患者进入正常功能状态和/或将患者维持在正常功能状态或者延长复发时间。治疗用途可以包括预防用途，预防、控制或减轻患者神经脱髓鞘疾病发作的严重程度，还包括控制或减轻已存在疾病的严重性的治疗。药物或药物组合物可以在症状发作之前给药；也可以在症状发作之后给药。它可以给药于可能具有神经脱髓鞘疾病发作风险的患者。
48.下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
49.实验中使用的各种试剂都可从市场上购得，其用量除非另有说明否则按照常规的量使用。
50.实施例1：酸枣仁皂甙a化合物基于报告基因靶向nf-κb信号通路的抑制作用
51.将生长于对数期的nf-κb-re-luci 293细胞株（北京英茂盛业生物公司）吹打，一个小瓶的细胞调整细胞悬液以1:3的比例接种96孔细胞培养板，每孔200
ꢀµ
l。置于37℃ 5% co2培养箱培养24 h后，每孔弃100
ꢀµ
l培养基。空白组不加tnf-α（金斯瑞公司），加100
µ
l与实验组同dmso比例的pbs；炎症模型组每孔加50
µ
l与实验组相同dmso比例的pbs和50
µ
l1000ng/ml的tnf-α刺激；阳性对照组每孔加50
µ
lpdtc溶液(碧云天公司)和50
µ
l 200ng/ml的tnf-α刺激；实验组每孔加上不同浓度的药物溶液和50
µ
l200ng/ml的tnf-α溶液(注：tnf-α溶液在加入药物之后1h后加入)。继续培养24h后，吸出各孔培养液，轻轻加入25μl pbs，置-80℃裂解至少30min。取出培养板室温融化，每孔加入底物steady-glo
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reagent（promega公司）25μl，避光裂解至少20 min。取反应液40μl至384孔白色酶标板，用酶标仪检测化学发光值(rlu)，结果如图1所示，此值代表各检测样品中荧光素酶的表达水平，从而间接反映nf-κb的活化水平。
52.药物处理后结果显示，酸枣仁皂甙a(宝鸡晨光生物)在浓度为0.1、1、10μm/l时有明显的nf-κb抑制活性，且成剂量效应关系。
53.实施例2：酸枣仁皂甙a对实验性自身免疫性神经炎模型的影响
54.造模方法：将健康雄性lewis大鼠（南方医科大学实验动物中心）雄性，体重220g-280g，随机分为3组，正常对照组、ena组和酸枣仁皂甙a组每组10只，ena组大鼠尾根部皮下注射 200μl p257
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81 多肽与弗氏完全佐剂（mpbio公司）的混合乳液，隔天称重，观察发病情况。酸枣仁皂甙a组从免疫0天开始腹腔注射200μl酸枣仁皂甙a，5mg /kg，隔日一次，正常对照组给予相同体积的pbs。按发病程度分为0～10 级，0级：无异常；1级：尾部张力降低，尾尖上翘；2级：尾瘫，翻正反射部分缺失；3级：翻正反射缺失；4级：步态失调、姿态异常；5级：后肢轻瘫；6级：中度瘫痪；7级：后肢严重瘫痪；8级：四肢瘫痪；9级：濒死；10级：死亡。
55.实验方法：淋巴细胞增殖实验：致敏第16天，实验组每组随机选5只大鼠，进行淋巴结单个核细胞(mnc)分离，进行pbs 诱导的单个核细胞增殖实验。将细胞悬液加入96孔板，每孔200μl，每个样本每3孔分别加入10μlrpmi 1640 培养液、pbs培养56h，然后每孔加入3h-胸腺嘧啶培养 16 h，最后将培养物收集于49型玻璃纤维滤纸上，80℃烘干，将滤纸片放入加有闪烁液的闪烁杯中，在β液体闪烁计数仪（pe公司）上测定每分钟每孔细胞的脉冲数(cpm)。
56.致敏第16 天淋巴结mnc(2
×
106/ml) 培养56h后，取培养液上清，采用双抗体夹心 elisa 法，进行tnf-α、ifn-γ及il-10含量测定。
57.致敏第16天处死大鼠，取双侧坐骨神经，进行坐骨神经病理切片，苏木素-伊红(he)染色，用图像分析系统测定切片上神经组织的面积和炎性细胞数目，以炎性细胞数/mm2表示。
58.实验结果：正常对照组无大鼠发病；ena组大鼠第8天开始发病，第16天左右瘫痪达高峰，第18天后逐渐缓解；酸枣仁皂甙a组致敏后第9天开始发病，第19天左右瘫痪达高峰，第21天后逐渐缓解。
59.致敏第16天大鼠淋巴结mnc对不同抗原刺激的增殖实验结果如图2所示，与ena组比较，酸枣仁皂甙a组能明显抑制pbs诱导的单个核细胞增殖，ena组与正常对照组无差异。
60.致敏第16天淋巴结 mnc(2
×
106/ml) 培养56h后tnf-α、ifn-γ及il-10含量如图3所示，培养液上清中tnf-α、ifn-γ水平，酸枣仁皂甙a组显著低于ena组但均高于正常对照组，il-10水平各组之间无显著差别。
61.坐骨神经病理检查结果如图4所示：致敏第16天正常对照组正常，酸枣仁皂甙a组、ena组大鼠坐骨神经he染色病理切片显示神经束间、神经束内炎性细胞浸润及局灶性脱髓鞘。酸枣仁皂甙a组炎性细胞浸润显著轻于ena组(p＜0.01) 。
62.实施例3：酸枣仁皂甙a对cpz 诱导的急性髓鞘脱失动物模型的实验
63.实验方法：6-8周龄c57bl/6雄性小鼠（南方医科大学实验动物中心），体重约18-20g，spf级，根据实验需要分为以下4组：
①
正常对照组：饲喂6周常规饲料并正常饮水；
②
模型组（记为cpz组）：饲喂6周含0.2%铜离子螯合剂cpz(sigma公司)的饲料并正常饮水；
③
25 mg/kg酸枣
仁皂甙a组（记为酸枣仁皂甙a25组）：饲喂6周含0.2%cpz的饲料，正常饮水并在第3周末给予酸枣仁皂甙a（25 mg/kg/只/天）；
④ꢀ
50 mg/kg酸枣仁皂甙a组（酸枣仁皂甙a50组）：饲喂6周含0.2%cpz的饲料，正常饮水并在第3周末给予酸枣仁皂甙a50 mg/kg/只/天；受试药物连续给药3周直至实验结束，正常对照组和模型组动物给予等体积溶剂。
64.实验结果：1、cpz介导的急性髓鞘脱失的模型组，每周采用含量半定量统计方法检测mbp、plp、cnpase三种髓鞘标志蛋白含量随时间的变化。如图5和图6所示，动物饲喂含cpz的饲料后小鼠脑内mbp、plp 和cnpase三种髓鞘标志蛋白含量随时间的变化显著下降，说明cpz介导的急性髓鞘脱失动物模型中髓鞘逐渐脱失。
65.2、饲喂6周后，检测各组对 cpz 介导的急性髓鞘脱失动物模型的脑源性神经营养因子（bdnf）表达、成熟少突胶质细胞（gst-pi 标记）、髓鞘碱性蛋白（mbp）的影响。如图7和图8所示。
66.髓鞘碱性蛋白（mbp）平均面积半定量统计结果显示，饲喂含 cpz 饲料 6 周后模型组动物髓鞘脂质脱失严重，酸枣仁皂甙a组具有保护髓鞘脱失的作用。
67.成熟少突胶质细胞ols（gst-pi 标记）数量，模型组与正常对照组相比，gst-pi阳性细胞数显著降低，给予不同剂量的酸枣仁皂甙a组皆可增加gst-pi阳性细胞数，**p《0.01。酸枣仁皂甙a组与对增加单位面积内 gst-pi 的阳性细胞数具有剂量依赖性。
68.增加bdnf的表达可以为脱失的髓鞘提供营养支撑从而对抗或者逆转由cpz引起的髓鞘脱失，结果显示酸枣仁皂甙a组能够显著上调急性期脑内bdnf的表达。
69.实验结论：酸枣仁皂甙a在cpz 诱导的急性髓鞘脱失动物模型中，能够促进髓鞘脱失部位ols（gst-pi标记）的表达、促进神经营养因子bdnf的表达，说明酸枣仁皂甙a对cpz 介导的急性髓鞘脱失具有显著的对抗和缓解作用。
70.由上可知，通过实施例1-3的实验结果表明，酸枣仁皂甙a具有较强的nf-κb抑制作用，酸枣仁皂甙a能明显抑制pbs诱导的单个核细胞增殖，还能够有效地保护髓鞘脱失。因此可以证实，酸枣仁皂甙a可用于制备预防或治疗脱髓鞘周围神经病的药物。
71.本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。