HIV-1Tat蛋白抑制剂及其应用

本发明涉及一种hiv-1tat蛋白抑制剂及其应用，属于生物。

背景技术：

1、由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，hiv)引起的人类获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，aids)。根据联合国艾滋病规划署最近公布的信息，截至2020年底，全球约有3770万艾滋病病毒感染者，新增感染人数150万，有68万人死于艾滋病相关疾病，有2750万人正在接受抗病毒治疗(antiretroviraltherapy，art，俗称“鸡尾酒疗法”)。艾滋病流行以性传播、血液/体液传播和母婴传播为主，影响因素广泛复杂。

2、抗逆转录病毒治疗hiv-1感染和艾滋病的进展非常迅速。第一种艾滋病治疗药物，齐多夫定(zidovudine，azt)在发现病毒后的10年内被开发和使用。包括azt在内的第一代抗hiv-1药物几乎都是hiv-1逆转录酶抑制剂。20世纪90年代中期，hiv-1蛋白酶抑制剂的开发和抗逆转录病毒疗法(art)的引入使艾滋病的治疗发生了革命性的变化。截止2020年7月2日，美国fda共批准了9类39种抗hiv药物，包括13种核苷类逆转录酶抑制剂(nrtis)、6种非核苷类逆转录酶抑制剂(nnrtis)、11种蛋白酶抑制剂(pis)、4种整合酶抑制剂(instis)、1种进入抑制剂、1种融合抑制剂、1种药代动力学增强剂、1种融合附着抑制剂和1种辅助受体拮抗剂附着后抑制剂，以及7种不同类型药物的合剂。将作用于不同靶点的抗hiv药物联合应用，可以将病毒复制抑制到现有方法检测不到的水平，在一定程度上重建免疫功能，改善临床症状，病人可以长期健康生存。然而，现有抗逆转录病毒药物的广泛使用也给艾滋病的治疗带来了一些障碍，例如，耐药毒株的出现和传播。目前抗病毒药物的作用靶点有逆转录酶、蛋白酶、整合酶等，但几乎所有的靶点都出现过耐药相关报道。在接受过抗逆转录病毒治疗的患者和没有接受治疗的hiv-1患者中，核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点主要以m184v/i为主，非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点主要以k103n/s，y181c/i和g190a/s为主。这些耐药位点会引起患者对拉米夫定、依非韦伦或奈韦拉平药物产生高度耐药。因此，仍需寻找新的药物靶点，并针对其设计或筛选新的抗病毒药物。

3、tat蛋白是hiv-1复制和基因表达所必须的反式激活蛋白，含有86-102个氨基酸，分子量约为14-16kda。tat蛋白可与hiv-1rna 5'端ltr上的反式激活反应区(transactivation responsive region，tar)结合，增强病毒复制起始，提高hiv-1基因转录水平。近年来的研究已经证实tat不仅在hiv-1启动子反式激活中具有重要作用，还参与调节hiv-1致病相关的多种细胞和分子通路。例如，tat蛋白可通过调节多种细胞通路以帮助hiv-1复制，如蛋白酶体机制和炎症相关途径。此外，tat还被发现可与其他hiv-1蛋白相互作用，包括vpr、nef、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，nc)和rev。其中，tat与vpr和nef的相互作用增加了其反式激活功能，而tat与nc或rev的相互作用导致tat蛋白降解，从而抑制相关功能。还有研究结果表明，tat与外泌体有关。基于tat蛋白在hiv-1复制中的重要调控作用，我们将其作为筛选新型抗hiv-1药物的靶标。hiv-1tat抑制剂的筛选将为发现并设计以tat蛋白为靶标的新型抗hiv-1药物奠定基础，避免已存在的耐药毒株对于抗hiv-1药物治疗效果的影响；同时，筛选出的hiv-1tat抑制剂还可用于tat相关的逆转录病毒致病机制研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种hiv-1tat蛋白抑制剂及其应用

2、本发明提供一种hiv-1tat蛋白抑制剂，所述hiv-1tat蛋白抑制剂的活性成分包括化合物way-297131，所述化合物way-297131的分子式为c13h13no4s2，所述化合物way-297131的结构式为：

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4、本发明提供一种治疗和/或治疗hiv-1病毒引起的疾病的药物,所述药物的活性成分包括化合物way-297131，所述化合物way-297131的分子式为c13h13no4s2，所述化合物way-297131的结构式为：

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6、本发明要求保护化合物way-297131在制备hiv-1tat蛋白抑制剂中的应用，所述化合物way-297131的分子式为c13h13no4s2，所述化合物way-297131的结构式为：

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8、本发明还要求保护所述的化合物way-297131在制备预防hiv-1病毒引起的疾病的药物中的应用。

9、本发明还要求保护所述的化合物way-297131在制备治疗hiv-1病毒引起的疾病的药物中的应用。

10、本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包上述的化合物way-297131或上述的药物或上述的抑制剂。

11、所述试剂盒可以为用于预防或治疗hiv-1病毒引起的疾病的试剂盒。

12、所述试剂盒也可以为评价化合物way-297131对hiv-1病毒的清除和/或抑制效果的试剂盒，所述试剂盒包含化合物297131、hiv-1病毒和宿主细胞；

13、进一步，所述hiv-1病毒为nl4-3或gx002；

14、进一步，所述宿主细胞为mt-2细胞。

15、本发明提供一种评价化合物way-297131对hiv-1病毒的清除和/或抑制效果的方法，包括如下步骤：

16、(1)测定化合物way-297131对宿主细胞的半数中毒浓度，记作tc50；

17、(2)测定化合物way-297131在宿主细胞/hiv-1病毒系统的抗病毒活性，得到化合物对hiv-1病毒的半数抑制浓度，记作ic50；

18、(3)将步骤(1)得到的tc50和步骤(2)得到的ic50，带入公式ti＝tc50/ic50，计算得到化合物的治疗指数ti。

19、进一步，所述宿主细胞/hiv-1病毒系统中所述hiv-1病毒可以在所述宿主细胞中进行复制。

20、进一步，所述hiv-1病毒为nl4-3或gx002；

21、进一步，所述宿主细胞为mt-2细胞。

22、所述步骤(2)中的ic50是通过测定化合物在宿主细胞/hiv-1病毒系统的抗病毒活性的细胞病变效应荧光法得到。

23、所述步骤(1)所采用的试剂盒的商品名称为celltiter-glotm luminescent cellviability assay，该试剂盒购自promega公司。

24、所述步骤(2)所采用的试剂盒的商品名称为bright-glotm luciferase assaysystem，该试剂盒购自promega公司。

25、所述试剂盒为评价化合物297131对hiv-1tat蛋白的抑制和/或激活作用的试剂盒，该试剂盒包括化合物297131和tzm-bl、tzm-bl-pcdna3.1-gx002-tat、tzm-bl-pcdna3.1-nl4-3-tat和tzm-bl-pcdna3.1细胞株。

26、本发明通风一种评价化合物way-297131对hiv-1tat蛋白的激活或抑制效果的方法，包括如下步骤：

27、(1)测定化合物way-297131对宿主细胞的细胞毒性，得到最大无毒浓度；

28、(2)测定当浓度低于最大无毒浓度时，化合物对稳定表达tat蛋白的单克隆细胞株的激活或抑制效果。

29、所述步骤(1)的测定方法为atp活性检测法；

30、所述步骤(2)中的激活或抑制效果是通过荧光检测法得到。

31、上述方法中，步骤(1)所述宿主细胞为tzm-bl细胞。

32、上述方法中，步骤(2)所述稳定表达tat蛋白的单克隆细胞株为tzm-bl-pcdna3.1-nl4-3tat、tzm-bl-pcdna3.1-gx002tat和tzm-bl-pcdna3.1细胞。其中，tzm-bl-pcdna3.1-nl4-3-tat为稳定转染有hiv-1的b亚型毒株nl4-3的tat蛋白表达载体的tzm-bl细胞株，tzm-bl-pcdna3.1-gx002-tat为稳定转染有hiv-1的crf01_ae重组型毒株gx002的tat蛋白表达载体的tzm-bl细胞株,tzm-bl-pcdna3.1为稳定转染有pcdna3.1(+)空载体的tzm-bl细胞株，作为hiv-1tat蛋白表达细胞株的阴性对照，以排除pcdna3.1(+)空载体对化合物效果评价的影响。

33、上述任一所述的方法中，所述步骤(1)的测定方法为atp活性检测法；

34、所述步骤(2)中的激活或抑制效果是通过荧光检测法得到。

35、所述步骤(1)所采用的试剂盒的商品名称为celltiter-glotm luminescent cellviability assay，该试剂盒购自promega公司。

36、所述步骤(2)所采用的试剂盒的商品名称为bright-glotm luciferase assaysystem，该试剂盒购自promega公司。

37、本发明提供的hiv-1tat蛋白抑制剂对艾滋病的防治研究具有重要的应用价值和意义。本发明提供的hiv-1tat蛋白抑制剂可以应用于阻断hiv转录过程，降低病毒的复制能力，还可涉及含有这两种化合物的药物组合物，进而达到抑制艾滋病的效果。