GABP在制备糖尿病肾病防治药物中的应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种gabp作为药物靶点在制备糖尿病肾病防治药物中的应用。

背景技术：

1、糖尿病肾病(dn)是一种主要的糖尿病微血管并发症，是引起糖尿病患者慢性肾功能衰竭的最主要原因之一，其病理变化主要包括系膜细胞异常增生及细胞外基质(extracellular matrix,ecm)过度堆积。在高糖状态下，肾小球系膜细胞功能紊乱，引起ecm蛋白分泌和降解相对失衡而大量堆积于系膜区及基底膜区，使肾小球形态、结构及功能发生病理性变化，最终导致肾小球硬化症的发生。研究表明，肾小球系膜细胞的增殖在dn的病理进程中起着极为重要的作用，然而其具体分子机制尚未完全阐明。所以，寻找具有系膜细胞保护作用的靶点，对于抑制肾脏纤维化，诊断与治疗dn具有非常重要的意义。

2、转录因子ga结合蛋白(ga-binding protein，gabp)是ets转录因子家族成员之一，由gabpα、gabpβ共同组成。gabpα近羧基末端含有一个大约85个氨基酸的dna结合域。gabpβ在其氨基末端含有一个锚蛋白结构域，近羧基末端含有一个转录激活结构域，通过锚蛋白与gabpα作用形成异源二聚体或四聚体后，行使其基因调控功能。参与多个信号通路的转导，在细胞的生长、分化和增殖等方面具有重要作用。gabp在肾脏学领域中的研究尚处起步阶段，关于gabp在糖尿病肾病中的作用与机制尚未见报道。因此，研究gabp在dn发生发展中的作用机制具有重要意义，将为dn防治药物的研发提供新的研究思路与理论依据。

技术实现思路

1、本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种gabp在制备糖尿病肾病防治药物中的应用，例如，作为药物靶点在开发、筛选或预防抗糖尿病肾病防治药物中的应用。

2、本发明的第二个目的是提供gabp敲低慢病毒在制备糖尿病肾病防治药物中的应用。

3、本发明的第三个目的是提供一种诊断试剂，该诊断试剂以上述pgabp敲低慢病毒为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。

4、本发明的技术方案如下：

5、gabp在制备糖尿病肾病防治药物中的应用，其中，gabp中gabpα的序列如seq idno.1所示，gabp中gabpβ的序列如seq id no.2所示。

6、在本发明中，所涉及的基因gabpα蛋白质编码区(cod ing sequence,cds)在ncbi数据库中鼠源gabpα基因的转录本nm_008065.2中得到。该序列全长为5004bp，序列如seqid no.1所示，atgactaaga gagaagcaga agagctgata gaaattgaga tcgacgggac tgagaaagcagagtgcacag aagaaagcat tgtggaacaa acctataccc cagctgaatg tgtaagccag gccatagacatcaatgaacc aataggcaat ttaaagaaac tactagaacc aagactgcag tgttctttgg atgctcatgaaatttgcctg caagatattc agctggatcc agaccgaagc ttgtttgatc aaggagtgaa aacagatgggactgtacagc ttagtgtaca ggtaatttct taccaaggaa tggagccaaa gttgaacatt cttgaaattgttaagactgc ggaaacggtc gaggtggtca tcgatccaga tgcccaccac gcggaagcag aagcgcatctcgttgaagaa gctcaagtga taactcttga cggcaccaag cacattacga ccatttcaga cgagacctcggagcaggtga cgagatgggc tgctgcactg gaaggctaca gaaaagagca ggagcgcctt ggcatcccctatgatcctat acactggtcc acggaccaag tcctgcattg ggtggtttgg gtaatgaagg agttcagcatgactgatata gacctcacca cactcaacat ttcgggaaga gaattatgta gtctcaacca agaagatttttttcagcggg tccctcgggg agaaattctt tggagtcatc tggagcttct tcgaaaatat gttttggccagccaagagca acagatgaat gagatagtta ccattgacca gcctgtgcag attattccag cctcagtgcctcccgctaca ccgactacga ttaaagttat aaacagcagt gcaaaagcag ctaaagtgca acggtccccaaggatttcag gagaagacag aagttcaccg gggaacagaa caggaaacaa tggtcagatc caactatggcagtttttgct agaacttctt actgacaagg atgctcgagactgtatttct tgggttggtgatgaaggtgaatttaagctaaatcagcctg agttggttgc gcaaaaatgg ggacaacgta agaacaagcctaccatgaac tatgagaaac ttagccgtgc attacggtat tattatgatg gggacatgat ttgtaaagttcaaggcaaga gatttgtgta caaatttgtt tgtgacttga agactcttat tggatacagt gcagcagaactgaaccgtct ggtcatagag tgtgaacaga agaaactggc acggatgcag ctgcatggga ttgcccagccagtcacggca gtagcactgg cagccacctc tctacaggca gacaaagaga tttga。

7、在本发明中，所涉及的基因gabpβ蛋白质编码区(cod ing sequence,cds)在ncbi数据库中鼠源gabpα基因的转录本nm_207669.3中得到。该序列全长为2614bp，序列如seqid no.2所示，atgtccctgg tagatttggg gaagaagctt ttagaagcgg cacgagccgg tcaagatgatgaagttcgca ttttgatggc aaatggagct ccttttacta cagactggtt gggaacttct ccacttcatctggccgcaca gtatgggcat ttctctacca cagaggttct tctccgagcc ggtgtaagta gagatgccaggaccaaagtg gaccggacac cactgcacat ggcggcttct gagggccatg ccaacatagt agaagttttgcttaagcatg gtgctgacgt caatgcaaag gatatgttaa agatgacagc tctgcattgg gcaacagaacataatcatca agaggtggtg gagcttttaa tcaaatatgg tgctgatgta cacacgcaga gtaaattttgtaaaactgca tttgatattt caatagacaa tggaaatgaa gatttagcag agatattaca gattgctatgcagaaccaaa tcaacaccaa cccggagagt cctgacactg tgacaataca cgctgccaca ccacagttcatcattggacc cggaggggtg gtgaacctca cagatgaaac aggagtatct gctgttcagt ttggaaactcctctacgtca gtattagcta cgttagctgc cttagctgaa gcttctgccc cattgtccaa ttcttcagaaactccagtgg ccacagagga agtggttacc gcagaatctg tggatggtgc aattcagcaa gtagttagctcagggggtca gcaagtcatc acgatagtta cagatggaat ccagctgggg aatttgcact ccataccaaccagtgggatg ggtcagccca tcattgtgac gatgcccgat ggacagcaag tattgacagt accagcaacagacattgctg aagaaactgt catcagtgaa gagccaccag ctaagagaca gtgtatggaa ataattgagagccgggtgga atgtgcagaa attgaagaga gagaagcgct tcagaaacag ctggatgaag ccaaccgagaggcccagaaa taccgacagc agctgcttaa gaaggagcag gaggcagagg cctacaggca gaagctggaggccatgacac gcatccagac caacaaagaa gccgtttag。

8、在一种优选方案中，gabp作为药物靶点在开发、筛选或预防抗糖尿病肾病防治药物中的应用。其中，药物抑制gabp的蛋白活性或抑制gabp的基因表达。

9、在一种更优选方案中，药物为小分子、化学试剂、反义寡核苷酸、sirna、mirna、核酶、多肽或蛋白质药物。

10、gabp在制备糖尿病肾病防治药物中的应用，药物可以制成固体制剂或者液体制剂。进一步地，在本发明提供的技术方案的基础上，药物可以制成注射剂、口服液、颗粒剂、粉剂、片剂或胶囊剂。

11、在本发明中，gabp以慢病毒作为载体，制备gabp敲低慢病毒，以及gabp敲低慢病毒在制备糖尿病肾病防治药物中的应用。

12、在一种优选方案中，上述所得药物能够抑制高糖诱导的系膜细胞的增殖或延缓糖尿病肾病肾脏纤维化。

13、在一种优选方案中，本发明提及的gabp敲低慢病毒(敲低gabpα和gabpβ重组慢病毒)和gabp过表达慢病毒(过表达gabpα和gabpβ重组慢病毒)的制备方法，其包括如下步骤：

14、(1)目的基因片段的获取：以小鼠全长cdna为模板，通过pcr反应扩增引物，利用扩增gabpα和gabpβ的特异性引物，通过聚合酶链式反应扩增获得目的基因片段，目的基因片段为gabp的dna双链片段。

15、(2)目的片段和载体连接：采用ecori和agei对载体质粒进行酶切，获得线性化的载体片段，酶切结束之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。进一步克隆连接体系中将步骤(1)中gabpα和gabpβ的dna双链目的片段目连入酶切后的hu6-mcs-cbh-gcgfp-ires-puromycin载体，得到gabp敲低重组慢病毒载体。采用bamhi和agei对载体质粒进行酶切，将步骤(1)中gabpα和gabpβ的dna双链目的片段目连入酶切后的ubi-mcs-3flag-cbh-gcgfp-ires-puromycin载体，得到gabp过表达重组慢病毒载体。

16、(3)慢病毒包装：构建好的病毒载体和helper 1.0和phelper 2.0慢病毒包装辅助质粒，同时共转染293t细胞，在该细胞中进行病毒的包装并分泌到细胞外的培养基中，收集培养基离心后取得的上清液，超速离心获得病毒颗粒，测定病毒滴度。

17、本发明通过从mrna和蛋白水平验证。结果发现：gabp在不同周龄db/db小鼠肾脏中表达逐渐增加，表明gabp上调与dn的形成有关。进一步地，体外实验，通过检测高糖条件下系膜细胞和足细胞中gabp的表达变化，结果发现：gabp在不同糖浓度培养的系膜细胞中变化最显著。接下来，在小鼠系膜细胞中过表达gabp或敲低gabp，结果发现：gabp调控细胞周期蛋白的表达，且影响系膜细胞的增殖能力。最后，体内实验，在小鼠肾脏中特异性过表达或敲低gabp，结果发现：gabp调控dn小鼠肾脏纤维化的发生。本发明从正反两方面明确gabp在系膜细胞以及小鼠在dn过程中的作用，为dn防治药物的研发提供了新的思路。

18、本发明还提供一种诊断试剂，该诊断试剂以上述gabp敲低慢病毒为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。其中，药学上可接受的辅料在整个制剂技术发展过程中起到关键的作用，许多制剂中辅料占到大部分，因而很大程度上辅料的性质决定了制剂的性质。优良的辅料可以增强主药的稳定性，延长药剂的有效期；可以调控主药在体内外的释放速度；可以改变药物在体内的吸收，增加生物利用度，对具体的辅料类型不作限定。

19、本发明还公开了一种gabp过表达和敲低的小鼠系膜细胞模型的构建方法，包括下列步骤：

20、1)正常培养的小鼠系膜sv40细胞融合度达到30％～40％；

21、2)慢病毒感染，将慢病毒母液用无血清培养基稀释成滴度为1×108tu/ml病毒溶液，按moi＝30加入病毒量；

22、3)无血清培养基感染8h后更换为完全培养基，继续培养3天。

23、本发明还公开了一种gabp过表达和敲低的小鼠模型的构建方法，包括下列步骤：

24、将小鼠饲养到12周龄时，首先麻醉小鼠，再采用肾实质的方式注射慢病毒，从背部找到肾脏大概位置，给小鼠双背剃毛，先在左背切开一个1.5cm的切口，暴露左肾，双手配合将左肾掏出并提起，并将周围器官和脂肪轻轻分开；用显微止血夹夹住肾门，阻止病毒原液下流至膀胱；用30g注射针分别刺入左肾上极中极和下极(注意注射针头不应刺穿肾脏)将50ul液体(含有5×10^10μg病毒颗粒基因组拷贝数或生理盐水)注入肾盂，并快速将液体注入肾脏皮质停留至少30秒，将注射针缓慢撤出。

25、采用本发明的技术方案，优势如下:

26、本发明证实了gabp对改善糖尿病肾病的重要作用，提出gabp是糖尿病肾病相关的药物靶点，下调gabp可明显降低高糖引起的系膜细胞中细胞周期调控蛋白表达增多，抑制系膜细胞的增殖和延缓肾脏纤维化。因此，gabp可作为药物靶点用于制备防治糖尿病肾病的药物，对糖尿病肾病药物的开发和预防治疗具有重要意义。