一种靶向衰老通路的促老龄骨缺损修复的仿生三维纳米支架及其制备方法

本发明涉及纳米材料和生物组织工程领域，更具体地涉及一种靶向衰老通路的促老龄骨缺损修复的仿生三维支架及其制备方法。

背景技术：

1、随着年龄的增加，骨骼强度降低，骨折、骨质疏松等相关骨骼疾病成为日益严重的健康问题。考虑到与年龄相关的骨骼疾病通常与多种其他慢性疾病如动脉粥样硬化、糖尿病、虚弱共存，人们对“老年科学假说”的兴趣越来越大，该假说假设：操纵基本衰老机制将延迟多种慢性疾病的出现或严重程度，因为这些疾病通常以衰老为潜在危险因素。因此，靶向基本的衰老机制有助于多种与年龄相关的疾病的治疗。

2、机体衰老与衰老细胞的增加相关，衰老细胞在骨骼组织中随着年龄增加而逐渐积累，导致骨组织自我修复能力的丧失和功能障碍的发生。衰老的细胞不仅高表达生物标志物p16,p21,p53,导致周期蛋白的激酶抑制剂的表达增加，而且抵制凋亡。此外衰老细胞具有的衰老相关外泌表型(sasp)il-6，il-8,mmp13，pai-1等都会影响机体功能。随着年龄的增长，老龄骨微环境中的多种细胞都会衰老，骨髓干细胞形成成骨细胞的能力下降，并优先形成脂肪细胞，导致骨形成和矿化减少。一些药物分子可以通过特异性抑制sasp或者促炎因子来抑制衰老相关表型。比如抗衰老药物：senolytic包括d达沙替尼+q槲皮素或者抑制衰老相关外泌促炎因子产生激酶抑制剂。

3、设计骨仿生支架涉及到构建合适的骨骼表征，这需要了解骨骼生物学和生理学。骨可以看作是一种由成骨细胞细胞外基质(ecm)蛋白、生长因子、羟基磷灰石钙形式的矿物钙和复杂血管系统组成的复合材料。传统上，支架被设计成与天然组织器官相似的宏观结构，然而却很少有人关注到组织器官微观结构的复杂性和纳米级细节。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种靶向衰老通路的促老龄骨缺损修复的仿生三维纳米支架及其制备方法，从而解决现有技术中缺乏有效改善老龄骨骼质量和骨骼强度的骨仿生支架的问题。

2、为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

3、提供一种靶向衰老通路的促老龄骨缺损修复的仿生三维支架的制备方法，包括以下步骤：1)将小分子阳离子表面活性剂十六烷基溴化铵与聚苯乙烯-b-聚丙烯酸胶束作为结构导向剂，加入正硅酸乙酯和硝酸钙作为硅源、钙源，制备出具有表面暴露大孔、高比表面积的介孔生物活性玻璃纳米球；2)将步骤1)获得的介孔生物活性玻璃纳米球分散于抗衰老药物溶液中，于室温下避光搅拌,离心洗涤干燥后，获得载药介孔生物活性玻璃纳米球；3)将聚己内酯颗粒溶于六氟异丙醇溶剂中搅拌均匀，获得质量分数为7％-15％的聚己内酯溶液，将步骤2)获得的载药介孔生物活性玻璃纳米球分散在聚己内酯溶液中，并转移至注射器，采用静电纺丝技术制备成含生物活性纳米球的纤维膜，静电纺丝的工艺条件为：流速为0.1-0.3ml/h，电压为15-18kv，接收距离为10-15cm；4)将步骤3)获得的纤维膜置于戊二醛蒸汽箱中交联后，剪成碎片形式分散于去离子水中，置于均质机中破碎成均匀的短纳米纤维悬浮液，随后将所述短纳米纤维悬浮液放入模具中，冷冻干燥，形成纳米级三维静电纺丝支架；5)采用聚多巴胺对步骤4)获得的纳米级三维静电纺丝支架进行表面修饰，即可获得一种靶向衰老通路的促老龄骨缺损修复的仿生三维支架。

4、根据本发明提供的一种靶向衰老通路的促老龄骨缺损修复的仿生三维纳米支架的制备方法，该支架主体结构通过聚己内酯生物材料与介孔生物活性玻璃纳米球共混静电纺丝制成纳米级支架，其中介孔生物活性玻璃纳米球可以负载抗衰老药物或者抑制sasp产生的抑制剂如jaki，一方面模拟天然骨的有机无机结构，另一方面靶向衰老细胞，从而减轻衰老细胞负担，促进老龄骨修复，实现老龄骨骼质量和强度的改善。

5、优选地，所述步骤(1)中聚苯乙烯-b-聚丙烯酸溶于四氢呋喃中，并将其快速倒入含十六烷基溴化铵的碱性溶液中，从而获得双模板复合胶束，作为介孔生物活性玻璃纳米球的结构导向剂，然后加入正硅酸乙酯、四水合硝酸钙搅拌，离心收集，真空干燥后，置于马弗炉中煅烧，即可制备出一种具有表面暴露大孔、高比表面积的介孔生物活性玻璃纳米球，该制备方法可调控材料形貌以及孔径大小，通过本发明制成的介孔生物活性玻璃纳米球一方面具有优异的生物活性，可均匀分布在聚己内酯纤维上模拟天然骨中胶原蛋白纤维与羟基磷灰石的结合，另一方面作为载体装载递送抗衰老药物。

6、优选的，所述步骤1)中正硅酸乙酯和硝酸钙的摩尔比为(75-85)∶(25-15)，可获得良好的球形形貌和孔径大小，优选的孔径范围在10nm-20nm，煅烧温度为500-600℃，升温速率为1-1.5℃/min。

7、所述步骤2)中的抗衰老药物可以为senolytic药物分子：包括d达沙替尼+q槲皮素，那维托克，荜拔酰胺等，或者抑制衰老相关外泌促炎因子产生的激酶抑制剂：鲁索替尼，托法替尼等。

8、所述步骤3)中载药纳米球的加入量为1-2％(g/100ml)。搅拌均匀后，静置，使得溶液中的气泡完全消失。

9、所述步骤4)中使用8000-12000rpm转速对纤维膜进行破碎。多次观察，使得纤维膜完全破碎成短纤维状态。

10、所述步骤4)中结合静电纺技术和冷冻干燥技术，可将静电纺纳米复合短纤维冷冻干燥得到孔径在10-300μm和孔隙率>90％的三维多孔支架。

11、为提高支架表面亲水性，从而提高细胞粘附性，所述步骤5)中将冷冻干燥后的三维支架置于多巴胺盐酸溶液中8-12h，然后去离子水冲洗数次以除去未反应的多巴胺。

12、众所周知的是，对于老龄骨缺损，静脉注射或者口服药物通常难以到达局部缺损部位，对于老龄骨的修复，对三维支架的要求更高，不仅要模拟宏观结构，还要模拟天然骨的微纳结构。对于老龄骨修复而言，由于其复杂的微环境不利于细胞增殖，将纳米结构和生物生长因子或药物结合到支架中是最有价值且挑战的治疗手段。

13、本发明的发明点主要在于，首次将靶向衰老通路机制与三维支架相结合，通过将纳米级聚己内酯纤维与纳米生物活性玻璃结合，以有效增加衰老骨微环境中细胞的接触位点，为细胞提供合适的粘附增殖空间，进一步的，通过原位递送抗衰老药物改善衰老骨微环境，减轻衰老细胞负担，从而达到促进老龄骨修复的效果。

14、应当理解的是，本发明采用聚己内酯构建支架，模拟天然骨细胞基质结构的纳米级支架为细胞提供更多的结合位点，靶向衰老药物或抑制剂的结合以抑制sasp的产生，减轻衰老骨微环境中间充质骨髓干细胞的负担，从而提高其活性，促进老龄骨的修复，这一策略与目前所有治疗老龄骨疾病的药物有本质的不同。

15、与现有技术相比，根据本发明提供的一种靶向衰老通路的促老龄骨缺损修复的仿生三维纳米支架，具有以下有益效果：

16、1)根据本发明提供的靶向衰老通路的促老龄骨缺损修复的仿生三维支架具有纳米级结构，载药的介孔生物活性玻璃均匀分散在单根纳米级纤维中，模拟天然骨中有机无机成分，具有与天然骨相似的细胞外基质结构，且负载药物可以靶向衰老机制，减少衰老细胞负担，从而提高细胞活性，用于老龄骨缺损修复。

17、2)本发明采用靶向衰老通路机制与骨修复支架相结合的治疗方式，不仅针对骨特异性通路，而是针对所有组织中存在的基本衰老机制。该仿生三维纳米支架可原位释放抗衰老药物靶向衰老细胞，抑制有毒物质sasp的产生，减少衰老细胞负担，从而促进骨组织修复；同时，抑制衰老细胞sasp的产生已被证明能改善心血管功能，增强胰岛素敏感性，并减轻虚弱，使其从根本上不同于目前所有的老龄骨疾病的治疗方法(只对骨骼有益)。因此，根据本发明提供的这样一种针对衰老细胞治疗的骨修复支架不仅是一种治疗老龄骨疾病的新策略，而且还可以针对基本的衰老机制来同时预防多种衰老合并症，为今后的临床试验提供了方向。