一种抵抗结核分枝杆菌的免疫治疗

本发明涉及免疫学和生物医学领域，具体的涉及结核病的免疫治疗。

背景技术：

1、结核病仍然是全球面临重大公共卫生问题之一，是十大致死因素之一。who发布的2022全球结核病报告显示，全球约有1/4人口感染结核，2021年全球新发结核病病人1060万，因结核病致死人数达160万。为全面应对结核病的挑战，世界卫生组织于2015年制订了“终止结核病策略”，旨在2035年时使结核病发病率降低90％，死亡率降低95％。要实现这个宏大的目标，不仅需要依赖于对结核病患者的精准规范治疗，同时要有效阻断结核病在人际中的传播。虽然全人群对结核分枝杆菌普遍易感，但是否发生结核病取决于多种因素，而机体免疫状态为其中的重要方面。

2、jak/stat信号转导是从细胞外相关细胞因子或生长因子与其相应的跨膜受体结合开始的。这种方式可以使jaks在空间位置上彼此接近，同时促使jaks在空间结构上发生改变，最终使jaks的激酶结构域从无激酶活性的抑制形式转变为具有激酶活性的活化形式。这种结合方式使jaks与其受体的空间距离接近，进而导致jaks自身和胞浆细胞质受体的尾部磷酸化，生成潜在的stat单体停靠必要位点。虽然每个细胞因子/受体通常是与某特定的stat相关，但每个细胞因子/受体却常常与多个stat家族成员(异构信号)相关，导致了同型二聚体、异聚体和高阶四聚体的形成。它们在细胞核内通过序列一致gas(gamma-nterferon activationsite)与dna结合，同时也通过非依赖gas的方式导致基因表达的激活、抑制或者与编码蛋白质的mrnas或非编码rna的靶基因进行中性结合，作为多分子复合物的一部分。由于gas基序具有相同的亲和力，多种形式的stats可能共同结合到相同的靶位点(即重叠特异性)。特殊的序列一致基序认为，stats之间可能相互持抗竞争结合相同的基因组区域。经验证得出stat3和stat5在t细胞、树突状细胞和肿瘤细胞株中，stat3介导的il-17的转录均被stat5所阻断(yang xp，ghoreschi k，steward-tharp sm,etal.opposing regulation of the locus encoding il-17through direct,reciprocalactions of stat3and stat5[j].nat immunol,2022,12(3):247-254)。

3、尽管stats是细胞因子特异性和功能的关键性因素，然而，细胞因子受体接受刺激，也可以在一定程度上通过影响stat来产生部分非依赖stat的信号。itam轴受体是一个很好的例子(免疫受体酪氨酸激活基序，immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,itam)，它是通过调节stati信号转导，与肿瘤坏死因子受体相关因子作用激活受体来发挥作用的，最终调节stat3信号途径(bezbradica js,rosenstein rk,demaeco ra,etal.a role for theitam signaling module in specifying cytokine-receptorfunctions[j].nat immunol,2014,15(4):333-342.nagashima h,okuyama y,asao a,etal.the adaptor traf5limits the differentiation of inflammatory cd4(+)t cellsby an-tagonizing signaling via the receptor for il6[j].nat immunol2014,15(5):449-456))。

4、在哺乳动物中的4种jaks激酶(jak1jak2jak3tyk2)和7种stats(stati、stat2、stat3、stat4、stat5a、stat5b、stat6)可以与50多种细胞因子和生长因子结合。那么问题接踵而至，在保证其特异性的前提下数量这么少的jaks激酶和stats是如何与它们相应的配体(即细胞因子和生长因子)结合的呢？一种解释是，具有相同激活属性的细胞因子可能在不同类型细胞(或不同状态细胞)中发挥作用，不同敏感性的stat是由不同的stat基因编码的。然而，这种解释并不能阐明为什么在“看起来”相似的stat信号级联反应中的细胞因子，在相同的细胞类型或状态下具有不同生物学反应的现象。例如在髓系细胞中，il-6和il-10都可以有效地激活stat3，il-6主要发挥促炎作用，而il-10主要是抗炎作用。stat3信号产生的差异主要表现在stat3信号的持续时间和强度方面，然而这可能仅仅是问题的一部分。虽然通常每个细胞因子只与一个特定的stat相关，但是几乎每一个stat都是多个细胞因子或生长因子的家族成员，只是在不同的家族中的作用程度不同而已，即异构的信号传递。例如，i型干扰素(interferon-i,ipn-i)是典型的stat1激活剂，但是它同样可以激活stat3和stat4。在某些情况下，细胞因子参与多个stats的活动并具有同等作用，如il-27可以强烈激活stati和stat3；而其他情况下，二者的相互作用具有清晰的层次性如ifn-γ可引起强烈的stat1反应，而对stat3引起的反应则相反。

5、stats可以直接与dna结合，作为经典的转录因子(transcription factors,tfs)来发挥作用。stat-dna相互作用的结果可以被整合到转录组学和功能基因组学的功能缺失研究当中，即基因敲除小鼠、小干扰rna(small interfering rna,sirna)从而对靶基因进行分类，还可以进一步将这些结果运用于stat的结合占位和stat依赖的转录调控上。stats分散在整个基因组中，可以调节编码蛋白质的基因和非编码基因的转录过程。在th细胞中，成千上万的结合位点已经与每个家族成员建立了对应关系，有时结合位点在转录起始位点的近端，但更多的位于转录起始位点的远端通常与增强子或其他的顺式作用元件相关。

6、jak/stat信号通路通常表现为经典途径，但其中充满复杂因素，如stats也作为异聚体和高阶四聚体发挥作用。ifn-i和ifn-ii一个关键的区别在于，前者诱导stat1/stat2异二聚体的形成(即isgi3复合体)，而后者则主要诱导产生stat1二聚体(即gaf复合物)。在功能方面，人们研究认为stat5是转录活性的关键。stati四聚体对ifn-i很重要但是对iifn-i却是非必需的。stat蛋白的表达是受到严格调控的，胞质内stat蛋白的浓度具有重要的生物学作用，比如在nk细胞中，stat1和stat4的相对水平决定着inf-i的反应水平。

7、体外研究证实，磷酸化丝氨酸对基因的转录至关重要，比如在t细胞中stat4驱动ifn-γ(morinobu a，gadina m，strober w,et al.stat4serine phosphorylation iscritical for il-12-induced inf-gamma production but not for cellproliferation[j].proc natl acad sci usa,2002,99(19):12281-12286.)而体内实验显示，stat4对免疫功能和造血系统产生影响(friedbichler k，kerenyi ma，kovacic b，etal.stat5a serine 725and 779phosphorylation is aprerequisite for hematopoietictransformation[j].blood,2010,，116(9)：1548-1558)

8、近年来，研究表明结核分枝杆菌感染的程序由免疫信号通路决定，这些通路可以消灭病原体或导致结核病。withaferina(wa)通过激发stat信号刺激t细胞记忆群体的产生，从而降低因再激活和再感染而导致的结核病复发率，证实了wa在增强宿主对结核分枝杆菌的免疫反应方面的免疫治疗潜力(kumari anjna；pahuja isha，withaferinaprotectsagainstprimary and recurrenttuberculosisbymodulatingmycobacterium-specifichost immuneresponses，[j]microbiology spectrum2023.pp e0058323-e0058323)。

9、传统观念认为，人群暴露于结核分枝杆菌环境中后发生结核的感染，但无临床症状，成为潜伏感染者，而部分潜伏感染者在后期发展成活动性结核病患者。一项来自美国的家庭密切接触者的流行病调查数据显示，家庭中与活动性肺结核患者密切接触的人群中约50％未感染结核，早期学者将这种未感染归结为免疫应答响应窗口期、暴露强度不足以及潜伏感染诊断标准问题等原因。但是最新研究表明，在长期且大量暴露于结核分枝杆菌环境中的密切接触者(比如结核病医院的医护人员等)，存在部分能够将入侵的结核分枝杆菌完全清除的人群，这类人群被称为“结核抵抗者(resister)”。结核抵抗者的定义：(1)持续高强度的暴露在结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,mtb)环境中；(2)ppd和igra试验持续阴性。这一特殊群体能够将反复入侵宿主细胞的结核分枝杆菌清除，并且不产生经由抗原呈递的适应性免疫应答，即不产生结核抗原特异性的记忆淋巴细胞。目前产生结核抵抗者的免疫机制尚不清楚，但是缺乏结核抗原特异性的记忆淋巴细胞提示天然免疫而非适应性免疫在其产生中发挥更重要作用。流行病学数据提示了结核抵抗者的存在，但目前国内外对于resister抵抗结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,mtb)感染机制仍然不清楚。

10、mtb感染机体过程中，分为初始感染、潜伏感染、再次大量增殖造成的疾病复燃三个阶段。机体对mtb产生细胞免疫必须由抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，apc)介导。树突状细胞(dendritic cells，dcs)是最有效的抗原呈递细胞。机体感染mtb后，未成熟的dc大量出现，它们是专门呈递和处理抗原的细胞。吞入抗原后，dc逐渐成熟(il-12p40在mtb感染后dc的成熟中发挥重要作用)，迁移至次级引流淋巴结，在迁移过程中趋化因子及其受体发挥重要作用，到达引流淋巴结后，它高度表达mhcⅱ类和mhcⅰ类分子分子，呈递抗原。研究发现，只有迁移至引流淋巴结，dc才能诱导th1细胞发挥免疫反应。成熟的dc释放大量il-12诱导th1反应，在小鼠体内去掉dc，会加重对mtb感染。因此在感染mtb的过程中，dc细胞发挥重要作用。研究显示，dc细胞摄取不同的mtb抗原会产生不同的临床结局：当dc细胞吞噬摄取mtb的man-lam(甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖)时，产生大量抑炎因子il-10，抑制th-1反应的激活，阻碍巨噬细胞和t细胞对结核分枝杆菌的清除，有利于mtb感染进展为活动性结核病；当dc细胞摄取吞噬mtb的脂蛋白时，产生大量促炎因子il12，促进强th1反应，分泌ifn-γ，活化巨噬细胞和t细胞，从而促进结核分枝杆菌的清除，将结核感染控制发展为结核潜伏或亚临床感染状态。这些均提示dc细胞在帮助宿主抵抗结核分枝杆菌的发挥重要作用。

11、通过研究健康人(hc)、结核抵抗者(resister)、结核潜伏感染者(ltbi)、结核病患者(tb)四组不同人群的外周血免疫细胞比例、dc细胞的吞噬、抗原呈递、迁移、细胞因子产生能力、dc细胞的转录组分析，进一步了解到结核抵抗人群的抗结核免疫机制，发现结核抵抗者(resister)的dc受到结核刺激后，通过上调stat4增强ifn-γ的分泌，进而提高了树突状细胞具有更强的吞噬能力，在此基础上完成了本发明。

技术实现思路

1、第一方面，本发明提供一种生物分子在杀灭结核分枝杆菌的中的应用。

2、进一步的，所述生物分子优选stat4分子的核酸、蛋白质和或多肽等。

3、进一步的，所述多肽还包括含有stat4分子核酸或含有stat4分子蛋白质的组合物的核酸或蛋白质组合物构建的多肽。

4、进一步的，所述多肽包括一种和/或多种多肽的组合物。

5、进一步的，所述一种多肽可以单独存在、可以作为包含同一肽的多个副本的多聚体存在和/或作为各种肽的杂聚体存在。

6、进一步的，所述一种和/或多种多肽的组合物为被修饰、重组、化学合成或生物合成。

7、进一步的，所述生物分子还可以改善或提高至少一种选自如下的性能：

8、a.增强树突状细胞的吞噬能力；

9、b.增强树突状细胞的迁移能力；

10、c.提高树突状细胞hla-dr表面标志物表达；

11、d.提高树突状细胞cd83表面标志物表达；

12、e.增强ifn-γ的分泌能力；

13、f.增强巨噬细胞的杀灭结核分枝杆菌的能力。

14、第二方面，本发明提供一种生物分子在结核病免疫治疗中的应用。

15、进一步的，所述生物分子优选stat4分子的核酸、蛋白质和或多肽等。

16、进一步的，所述免疫治疗包括靶向抗体、结核疫苗、继发性细胞疗法、免疫检查点抑制剂、细胞因子和免疫佐剂等治疗手段。

17、进一步的，所述结核病是由结合分支杆菌感染的结核病。

18、进一步的，结核病包括原发型肺结核、血行播散型肺结核、继发型肺结核、结核性胸膜炎、肺外结核等。

19、第三方面，本发明一种生物分子在制备治疗结核病的药物制剂中的应用。

20、进一步的，所述生物分子优选stat4分子的核酸、蛋白质和或多肽等。

21、进一步的，所述药物制剂包括药途径选自：经口给药、舌下给药、胃或肠给药、局部给药、注射给药、静脉注射、皮下注射、肌肉注射、经皮给药和/或吸入给药等。

22、进一步的，所述药物制剂可用于结核分枝杆菌的感染者，包括人和动物；

23、进一步的，所述动物可选自蝙蝠、鼬科、犬科、猫科、鹿科动物及家禽家畜、鼠类等。

24、第四方面，本发明提供一种生物分子制备检测人群结核分支杆菌易感性的免疫诊断试剂中的应用。

25、进一步的，所述免疫诊断包括stat4分子在被检测对象中的表达量的诊断。

26、进一步的，所述表达量表现为stat4分子发生基因突变而没有表达或者是stat4分子表达水平明显偏低。

27、第五方面，本发明提供一种生物分子在构建抵抗结核分枝杆菌的细胞模型中的应用。

28、进一步的，所述生物分子优选stat4分子的核酸、蛋白质和或多肽等。所述生物分子在所述细胞中表达增强。

29、进一步的，所述细胞模型优选树突状细胞。

30、进一步的，所述生物分子还可以改善或提高至少一种选自如下的性能：

31、a.增强树突状细胞的吞噬能力；

32、b.增强树突状细胞的迁移能力；

33、c.提高树突状细胞hla-dr表面标志物表达；

34、d.提高树突状细胞cd83表面标志物表达；

35、e.增强ifn-γ的分泌能力；

36、f.增强巨噬细胞的杀灭结核分枝杆菌的能力。

37、第六方面，本发明提供一种具有杀灭结核分枝杆菌的树突状细胞系。

38、进一步的，所述树突状细胞中stat4表达量和/或磷酸化水平高于一般树突状细胞中stat4的表达量和/或磷酸化水平。

39、进一步的，所述树突状细胞系可以具有如下至少一种功能：

40、g.吞噬能力更强。

41、h.迁移能力更强。

42、i.hla-dr表面标志物高表达。

43、j.cd83表面标志物高表达。

44、k.ifn-γ的分泌能力更强。

45、l.具有杀灭结核分枝杆菌的能力。