一种具有炎症识别能力的脂质体纳米平台及其制备方法、用途

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种具有炎症识别能力的脂质体纳米平台及其制备方法、用途。

背景技术：

1、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, uc)，是最常见的慢性非特异性炎症性肠病，该病发病率及复发率较高，病程长，易诱发各种并发症。如果长期慢性溃疡性结肠炎症得不到有效控制，会导致大肠结构受损，增加患结肠癌的风险。加上uc药物的耐药性和药物副作用的出现，uc被世界卫生组织列为现代疑难病之一。目前治疗uc的方法和药物尚未达到理想状态。因此，研究人员迫切需要寻找安全有效的新的治疗药物及方法。

2、溃疡性结肠炎是一种典型的伴有活性氧(ros)过量产生的难治性炎症性肠病。活性氧是细胞线粒体氧化还原反应的副产物，ros的正常平衡可双向调节细胞凋亡和增殖，并介导一系列信号转导途径，而过量的ros会破坏细胞的完整性，任何ros水平升高的细胞氧化还原失衡都会对活细胞造成氧化损伤，并导致长期的各种紊乱。研究还表明，过量的ros可导致巨噬细胞的促炎激活，进而诱导促炎细胞因子的持续释放，伴随t细胞的积累和凋亡抵抗，进一步加重炎症。葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium， dss)诱导的小鼠溃疡性溃疡性结肠炎模型，是一种广泛应用于临床的化学诱导模型，其在形态和症状上与人类 uc中所见的结肠上皮细胞损伤相似。

3、众所周知，细胞内抗ros是利用细胞内的酶，包括超氧化物歧化酶(sod)和过氧化氢酶(cat)，一定程度上会通过自我清除ros以获得平衡。有一些研究试图利用sod/cat以对抗ros相关疾病，但是自身的sod/cat在患病状态下清除ros能力是明显不足的，且稳定性低成本还高，促使研究人员寻求更经济有效的替代品。受此启发，我们的团队采用单原子取代方法，以au25簇为基础制备了人工酶，即金簇酶。实验结果显示这类金簇酶具有超高的抗氧化活性，比天然的抗氧化剂还要高137-160倍。同时，金簇酶表现出优先的酶模拟催化活性，au24cu1和au24cd1分别对过氧化氢酶(cat-like)和超氧化物歧化酶(sod-like)活性表现出强烈的选择性。我们将两种金簇酶联合起来使用，依赖其抗氧化特性及活性氧清除能力，从逻辑上讲它是治疗uc的良好候选者。然而，单独将金簇用于炎症治疗可能会导致材料在体内的随机分布，对正常组织也产生不良的副作用，并降低病变部位的给药剂量，还可能会在一定程度上被免疫细胞捕获，严重减弱其治疗效果。因此，有必要开发一种生物相容性良好的药物传递系统，既能绕过免疫系统的清除，又能提高靶向传递能力，有效地将药物传递到靶向组织是疾病治疗的先决条件。

4、脂质体由于载药能力强、释药速度慢、生物相容性好等优点，被广泛应用于基因、小分子药物、显像剂、蛋白质和核酸的递送。脂质体易于功能化可以引入各种特性，例如刺激反应性、增强药物包封、组织靶向性、降低非靶组织中的药物毒性、延长血液循环和诊断能力，从而有利于传递过程，证明是理想的传递平台。重要的是，脂质体作为一种药物载体，近年来已被广泛应用于临床治疗，具有一定的临床转化潜力。

5、利用细胞或者细胞膜对脂质体的表面进行修饰改性，可以将细胞膜及其外周蛋白易位提供给脂质体表面，为载药脂质体提供靶向性，提高其对目标靶点的作用力，大大减少了肝肾代谢及细胞吞噬等降解途径对药物的降解。同时，细胞膜为多种细菌外毒素攻击靶点，在中和毒素的同时能够聚集在感染部位，使其包裹的药物在感染部位集中释放，达到靶向作用。

6、中性粒细胞(nc)是宿主对抗恶性肿瘤和入侵病原体的第一道防线，由于趋化因子的感应，中性粒细胞会在几分钟内被招募到感染或炎症刺激部位，反应在24 - 48小时达到峰值，在血液中感知化学引诱梯度，并穿过血管内皮到达肠道固有层。考虑到中性粒细胞天生的炎症靶向能力，中性粒细胞被初步认定为开发炎症疾病治疗方案的可靠来源。然而，中性粒细胞作为药物转运载体的直接用途是有限的，由于中性粒细胞终末分化细胞的半衰期只有7小时，目前体外培养技术尚不成熟。中性粒细胞一旦从血液或骨髓中分离出来，就必须在数小时内孵育、装载药物并重新注射，这种包封过程既复杂又耗时，整个过程还需要严格的制备和储存条件以及消毒方法。另外，在分离过程中要保证中性粒细胞的活性，因为一旦分离的中性粒细胞结构被破坏，就会表达“找我”或“吃我”的信号，引发免疫细胞的吞噬，导致严重脱靶。此外，据报道，在溃疡性结肠炎模型中，肠道单核吞噬细胞(巨噬细胞和树突状细胞)的消耗会增加中性粒细胞浸润并增加损伤的严重程度。与使用活细胞不同，中性粒细胞膜伪装纳米颗粒提供了一个独特的平台来实现癌症和炎症治疗的特定递送。如果选择中性粒细胞膜可以选择性中和一些tnf-α、il-β等促炎因子，减少细胞自身引起的炎症风暴，并能保留自身的靶向性。

7、即便如此，单核吞噬细胞可能会识别中性粒细胞膜武装的纳米载体，会消耗递送效果，从而导致治疗效果不足。红细胞(red blood cell， rbc)是人体内较为丰富的细胞，每毫升人体血液中约有50亿个红细胞，可为药物载体功能化提供丰富的涂层材料。此外cd47在红细胞膜上过表达，它可与巨噬细胞表面信号调节蛋白α（sirpα）的n末端结合，触发“不要吃我”信号抑制免疫细胞对红细胞的吞噬，从而使红细胞在循环过程中持续存活。随着这一进展，红细胞膜的整合有望成为一种直接的方法来掩盖纳米载体，以逃避免疫监测，以改善递送过程。

8、我们将两种细胞膜结合，使得这一载药体系可延长血液循环时间、逃离免疫系统、增强体内的生物相容性和生物降解性，提高药物负载能力、纳米颗粒的稳定性、延长材料的体外储存时间、抑制聚集等。最重要的是还可有效靶向炎症部位，使得治疗药物在感染部位的主动浓聚成为可能，提升感染部位的药物浓度，从而达到更好的治疗效果。此外其大小可控，粒径可控制纳米级，生物相容性好，性质稳定，制备方法简单。

9、同时，无创情况下实时成像给药过程可以实现纳米载体在体内动态行为的监测，为了解治疗效果提供更直观的依据，用于优化治疗方案。基于深层组织穿透、可忽略的自身荧光和低光子散射，第二近红外(nir-ii, 1000-1700 nm)荧光成像已被广泛采用，以高时空分辨率实现目标物质的体内跟踪。实验发现我们提出的单原子取代方法开发的au团簇酶(mpa配体调节)可以实现nir-ii成像应用，以协助其治疗uc。

技术实现思路

1、本发明的目的在于构建具有高炎症识别能力的仿生纳米平台的制备及其在溃疡性结肠炎治疗中的应用。

2、本发明的技术方案：开发的是一种细胞膜介导的仿生纳米平台，将抗炎剂金簇酶装载到脂质体上，用天然的、被激活的中性粒细胞膜及红细胞膜“伪装”后递送到炎症部位，用于溃疡性结肠炎的防治。

3、本发明的具有炎症识别能力的脂质体纳米平台是以脂质体为核心，装载金簇酶。

4、所述的金簇酶是au24cd1和au24cu1混合物（命名au）。

5、所述的脂质体是由2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱、1，2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷及胆固醇在氯仿溶液中合成。

6、本发明的具有炎症识别能力的脂质体纳米平台的制备方法步骤如下：

7、制备金簇酶：采用一种系统的单原子替代方法，以au25簇为基础制备人工酶，即簇状酶，制备au24cd1及au24cu1；

8、将2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱、1，2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷和胆固醇溶于氯仿，配成氯仿溶液；

9、载药脂质体的合成：将步骤（2）得到的氯仿溶液旋转蒸发后形成薄膜，加入步骤（1）制备的金簇水溶液，进行超声水化薄膜，然后挤压得到载药脂质体（命名au-lip）。

10、步骤（1）中，金簇酶的具体制备方法如下：

11、将四氯金酸三水合物和3-巯基丙酸水溶液加入到水中，室温搅拌，然后在反应溶液中加入的氢氧化钠水溶液，然后加入硼氢化钠碱溶液，整个反应在黑暗中进行，在室温搅拌后收集au25mpa18，最终对反应溶液进行老化得到金簇酶。

12、作为优选的技术方案之一：将四氯金酸三水合物(haucl4·3h2o，20 mm，0.25 ml)和3-巯基丙酸 (mpa，5 mm，2 ml)水溶液加入到水(2.35 ml)中，室温搅拌5 min，然后在反应溶液中加入1 m，0.3 ml的氢氧化钠(naoh)水溶液，然后加入0.1 ml 硼氢化钠(nabh4 )溶液 (将43 mg nabh4粉溶解在10 ml 0.2 m naoh溶液中制备)。整个反应在黑暗中进行，在室温搅拌3 h后收集au25mpa18，最终反应溶液在4 ℃下老化12 h。各种金属取代的auxm25-xsg18的合成也是基于同样的方法。唯一的区别是haucl4(20 mm， 0.25 ml)中的au原子被不同的硝酸金属离子(cu2+， cd2+)以4%的摩尔比(au:m = 24:1)取代。为了进一步纯化金簇酶，我们分别使用3 k和10 k的超滤管，在3500 rpm/min转速下超滤离心，以去除较小的有机配体和较大的团簇，然后冻干。

13、步骤（2）中，所述的2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱为16:0-18:1 pc，1，2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷为氯化物盐，为18:0 tap。

14、步骤（2）中，2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱、1，2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷、胆固醇三者的质量比为30-60：10-30：20-60；作为优选的技术方案之一：2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱、1，2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷、胆固醇三者的质量比为44：16：40。

15、步骤（3）中，采用20-60 khz超声频率超声1-5min，过夜后，采用avanti微型挤出器反复挤出，依次过400 nm, 200 nm滤膜；作为优选的技术方案之一：采用40 khz超声频率超声2 min，过夜后，采用avanti微型挤出器反复挤出，依次过400 nm, 200 nm滤膜。

16、作为优选的技术方案之一：本发明的具有炎症识别能力的脂质体纳米平台装载金簇酶后外层用中性粒细胞膜及红细胞膜包裹。制备方法的步骤如下：

17、制备金簇酶：采用一种系统的单原子替代方法，以au25簇为基础制备人工酶，即簇状酶，制备au24cd1及au24cu1；

18、将2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱、1，2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷和胆固醇溶于氯仿，配成氯仿溶液；

19、（3）载药脂质体的合成：将步骤（2）得到的氯仿溶液旋转蒸发后形成薄膜，加入步骤（1）制备的金簇水溶液，进行超声水化薄膜，然后挤压得到载药脂质体；

20、（4）将载药脂质体与中性粒细胞膜及红细胞膜超声混匀后反复挤出，制得仿生纳米平台（命名au-lip-cm）。

21、步骤（4）中，所述中性粒细胞膜及红细胞膜的制备方法如下：通过对小鼠lps体内诱导后，采用percoll密度梯度离心法，从小鼠骨髓中分离获取中性粒细胞，并从外周血中获取红细胞；获取中性粒细胞膜及红细胞膜。

22、本发明的具有炎症识别能力的脂质体纳米平台可以用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。

23、本发明中金簇酶具有强大的抗氧化性及活性氧清除能力，毒性几乎可以忽略，因此被选作抗炎剂。

24、本发明中所述的脂质体载药能力强且具有缓释效果，可增加细胞对材料的内吞能力，增强细胞内活性氧的清除能力。

25、本发明中所述的中性粒细胞，通过同种类小鼠进行体内诱导后，由percoll密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离获得，上调了细胞膜表面相关粘附分子的表达。

26、本发明中所述的外周血及骨髓细胞物种来源是小鼠或者大鼠 。

27、本发明中中性粒细胞膜的主动穿透病变部位及炎症靶向的能力，以及红细胞膜可以延长血液循环时间、极易获取、体内含量较多等优点。

28、本发明中所述包被中性粒细胞膜之后，最终的粒径在500 nm左右，相较于微米尺度的细胞，比表面积更大，可更好的发挥膜结构的作用。

29、本发明采用dss诱导的小鼠的溃疡性结肠炎模型。

30、本发明在体外细胞层面的实验表明，这一载药体系具有较强的抗炎及活性氧清除能力，且生物兼容性较好。

31、本发明在活体层面研究了仿生纳米平台的生物相容性，结合所有毒理学结果，在50 mg/kg的剂量下，仿生纳米平台在小鼠中不会引起体重、炎症、免疫反应或病理敏感性，为后续的体内治疗过程奠定了基础。

32、本发明中的金簇酶可用于近红外ⅱ区荧光成像，可无创、动态、实时、可视化的监测小鼠的生理病理状况及治疗效果。

33、本发明描述了该仿生纳米平台的制备方案，并提供了其体内靶向性、延长血液循环时间的结果及药效学的评价。

34、本发明小鼠活体模型近红外二区成像实验证明，该药物能够特异性的靶向肠炎处，并延长血液循环时间。体内药效学评价监测显示，相比于游离的药物和其他常用的药物，该仿生纳米平台能够显著的抑制溃疡性结肠炎的发生及发展，具有明显的抗炎效果。

35、本发明活体实验结果表明，经au-lip-cm处理后，过量的ros被减弱，肠屏障被修复，杯状细胞数量、黏液层水平和紧密连接相关蛋白显著增加。丙二醛(mda)、髓过氧化物酶(mpo)和促炎因子(tnf-α、il-6、il-1β和ifn-γ)水平降低，抗炎因子(il-10、tgf-β)水平升高。此外，结肠炎小鼠肠道菌群的多样性、丰富度和均匀性可在一定程度上恢复。有益菌群相对丰度增加，同时有害菌群同步减少，成功的改善了肠道菌群生态结构。

36、本发明的机理研究中ros免疫荧光染色结果说明au-lip-cm具有抗氧化剂性能，具有较好的ros清除能力。

37、本发明的机理研究中rna测序结果表明，ppar信号通路、趋化因子信号通路、甲状腺激素信号通路、foxo信号通路、fc epsilon ri信号通路与au-lip-cm的治疗机制高度相关。

38、本发明所制得的新型靶向仿生纳米平台及其给药方式为静脉注射，可提高药物利用率，减少对其它器官的损伤，降低副作用的影响。

39、相对于现有技术，本发明创造所述的具有高炎症识别能力的仿生纳米平台的制备及其在溃疡性结肠炎治疗中的应用具有以下优势：

40、金簇酶具有超强的抗氧化性及活性氧清除能力，抗炎效果佳；尺寸约为2 nm，可以穿透肾脏屏障，通过肾脏排出，避免了长期的肝毒性和多器官损伤；

41、脂质体生物相容性好、载药能力强且具有缓释效果，可增加细胞对材料的内吞能力，增强细胞内活性氧的清除能力；

42、金簇酶可在近红外ⅱ区发光，可用于生物成像，可无创、动态、实时、可视化的监测小鼠的生理病理状况及治疗效果；

43、激活的中性粒细胞膜表面相关粘附分子能高效的靶向炎症部位；

44、利用红细胞膜的伪装，能够逃避免疫细胞的吞噬，延长血液循环时间；

45、脂质体与两种细胞膜的结合使得这一仿生纳米平台具有中和细菌毒素、靶向炎症部位、延长血液循环时间、提高药物负载能力、提升纳米颗粒的稳定性、药物缓释、延长材料的体外储存时间、抑制材料聚集并可用于近红外二区荧光成像等多重潜力；

46、该仿生纳米平台通过清除炎症部位过量的活性氧、调节信号通路，显著性的抑制了结肠炎的发生发展，还改善了肠道菌群。

47、新型仿生纳米平台可实现定点可控治疗过程，且具有较高的安全性和生物相容性，因表面包覆的细胞膜免疫原性极低，不存在细胞器以及遗传物质等，具有相对较高的安全性和医学转化应用前景。